一种基于指数流加补料原理的鲜味肽发酵生产方法

摘要

本发明公开了一种基于指数流加补料原理的鲜味肽发酵生产方法。该方法以鲜味肽生物表达菌的发酵动力学模型为前提，利用庞特里阿金极大值原理，通过建立状态方程和目标函数，求取目标函数在一定限制条件范围内取得极大值时所对应的比生长速率的最优过程变化，并以此控制鲜味肽的发酵生产。该发酵生产优化方法有效提升了鲜味肽的产量，可广泛应用于肽或蛋白质的发酵生产领域。

权利要求

1.一种基于指数流加补料原理的鲜味肽发酵生产方法，其特征在于：将鲜味肽的生物表达工程菌以10～15％的体积比接种至pH为7的培养基中，在37℃条件下进行发酵，所述鲜味肽为牛肉风味肽，其序列如SEQ ID NO.1所示，所述表达工程菌为B.subtilis 168/pMA09srfA-8BMP，所述培养基包括以下浓度的组分：柠檬酸氢二铵7.5g/L、硫酸钠2.0g/L、硫酸铵20.0g/L、氯化铵3.5g/L、磷酸氢二钾14.6g/L、一水磷酸二氢钠4.0g/L、七水硫酸镁

1.0g/L、葡萄糖20.0g/L和微量金属离子溶液3.0mL/L；发酵过程中补料流加速率通过式1确定，其中，F表示补料流加速率，μset表示菌体比生长速率，X0表示开始补料时发酵罐内的菌体浓度，V0表示开始补料时发酵罐内的培养基体积，SF表示补料培养基中的底物葡萄糖浓度，YX/S菌体生长基于底物的得率系数，t表示补料时间；所述菌体比生长速率μset通过庞特里阿金极大值原理优化得出，菌体比生长速率μset的优化包括如下步骤：S1：建立鲜味肽生物表达工程菌的发酵动力学模型，所述模型如式2～4所示；

其中，式2为菌体生长速率方程，式3为底物消耗速率方程，式4为产物合成速率方程；X为补料发酵时发酵罐内的菌体密度，S为补料发酵时发酵罐内的葡萄糖浓度，P为补料发酵时发酵罐内的产物浓度，YP/S为产物基于底物的得率系数，qm为于细胞维持的比底物消耗速率系数，α为细胞生长速率相关的产物表达速率系数，β为细胞密度相关产物表达速率系数；

S2：基于S1所述的发酵动力学模型确定庞特里阿金极大值原理中的状态方程、目标函数和待求解的控制条件；

其中，式5～7为状态方程，式8为目标函数；

S3：基于步骤S2所述的状态方程和目标函数，引入拉格朗日乘子构建哈密顿函数，并确定目标函数求极值所需的必要条件：伴随函数和控制方程；

H＝λ1f1+λ2f2+(1+λ3)f3                  9

其中，式9为哈密顿函数，式10为伴随函数，式11为控制方程；

S4：联立求解步骤S2及步骤S3所述的状态方程、伴随函数和控制方程，确定目标函数在给出条件范围内取得极值时，对应控制条件的最优过程变化，即优化得出不同时间段的比生长速率μset。

2.根据权利要求1所述的基于指数流加补料原理的鲜味肽发酵生产方法，其特征在于：

所述微量金属离子溶液包括以下浓度的组分：氯化钙0.5g/L、七水硫酸锌0.18g/L、一水硫酸锰0.1g/L、乙二胺四乙酸二钠10.05g/L、氯化铁8.35g/L、五水硫酸铜0.16g/L和六水氯化钴0.18g/L。

说明书

一种基于指数流加补料原理的鲜味肽发酵生产方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种基于指数流加补料原理的鲜味肽发酵生产方法。

背景技术

[0002] 鲜味肽是一类由两个及以上的氨基酸组成的在一定浓度下能使人感受到鲜味的多肽或其盐类。其中，牛肉风味肽(Beefy Meety Peptide，BMP)是目前研究较为广泛的一种鲜味肽，除其本身具有特征鲜味外，还能与还原糖、氨基酸、核苷酸等物质共同参与美拉德反应，产生特殊的复合风味，赋予食物味感协调、鲜香、醇厚、浓郁等特性，可单独作为鲜味调味料或作为基料制备新型复合调味品，具有较大的市场潜力。目前，国内外已报道的BMP生产方式分为3种：化学合成、酶分解和生物表达，前两者因为其产量少、合成费用昂贵和分离提纯复杂等限制，不适用于实际生产，相较而言，生物表达发酵生产鲜味肽具有高效、快速、低成本的优点，为鲜味肽的大规模的生产提供了可行性。但目前对于鲜味肽BMP的生物发酵生产研究尚处于起步阶段，相较于其它肽类产品发酵生产的产量而言，有较高提升空间。

[0003] 高密度发酵技术是一种扩大微生物生产的常用技术，它能控制菌体在一定反应器体积和时间内，尽可能多的积累细胞量，进而提高目标产物产量。在高密度发酵过程中，对菌体的生长和生产影响较大的发酵因素为底物抑制，目前底物抑制解除主要通过补料控制来实现。对于生长偶联型表达系统而言，由于其菌体积累及产物表达主要集中于菌体的指数生长期，常采用指数流加补料策略解除其底物抑制。该流加策略使用的计算公式(式1)由生长动力学模型推导获得，式中的关键参数比生长速率设定值(μset)通常为一个实验经验值，使得指数流加的补料量与菌体实际生长需求不完全匹配，最终限制了菌体密度和产物的产量。因此，对于高密度发酵的指数流加补料策略，需要进一步优化其μset值，使底物浓度在满足菌体生长和生产需求的同时解除底物抑制。

[0004]

[0005] 其中，F表示补料流加速率，μset表示菌体比生长速率，X0表示开始补料时发酵罐内的菌体浓度，V0表示开始补料时发酵罐内的培养基体积，SF表示补料培养基中的底物葡萄糖浓度，YX/S菌体生长基于底物的得率系数，t表示补料时间。

[0006] 庞特里阿金极大值原理常用于解决工程领域中的最优控制问题，具体求解过程如下：建立用于描述事物的状态改变的一系列状态方程(式12)以及目标函数(式13)，引入随时间演化的参数拉格朗日乘数(λ(t))建立哈密顿函数(式14)，进一步确定该原理求解目标函数极大值的必要条件——伴随函数(式15)和控制方程(式16)，联立求解式12、式15和式16，获得目标函数取得极大值时对应的控制变量最优解。将庞特里阿金极大值原理应用于鲜味肽发酵过程控制未见报道。

[0007]

[0008]

[0009]

[0010]

[0011]

发明内容

[0012] 针对上述现有技术，本发明提供一种基于指数流加补料原理的鲜味肽发酵生产方法，通过该发酵方法，以提高鲜味肽的发酵产量。

[0013] 为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：提供一种基于指数流加补料原理的鲜味肽发酵生产方法，鲜味肽发酵过程中补料流加速率通过式(1)确定，[0014]

[0015] 其中，F表示补料流加速率，μset表示菌体比生长速率，X0表示开始补料时发酵罐内的菌体浓度，V0表示开始补料时发酵罐内的培养基体积，SF表示补料培养基中的底物葡萄糖浓度，YX/S菌体生长基于底物的得率系数，t表示补料时间；菌体比生长速率μset通过庞特里阿金极大值原理优化得出。

[0016] 在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

[0017] 进一步，菌体比生长速率μset的优化包括如下步骤：

[0018] S1：建立鲜味肽生物表达工程菌的发酵动力学模型；

[0019]

[0020]

[0021]

[0022] 其中，式2为菌体生长速率方程，式3为底物消耗速率方程，式4为产物合成速率方程；X为补料发酵时发酵罐内的菌体密度，S为补料发酵时发酵罐内的葡萄糖浓度，P为补料发酵时发酵罐内的产物浓度，YP/S为产物基于底物的得率系数，qm为于细胞维持的比底物消耗速率系数，α为细胞生长速率相关的产物表达速率系数，β为细胞密度相关产物表达速率系数；

[0023] S2：基于S1所述的发酵动力学模型确定庞特里阿金极大值原理中的状态方程、目标函数和待求解的控制条件；

[0024]

[0025]

[0026]

[0027]

[0028] 其中，式5～7为状态方程，式8为目标函数；

[0029] S3：基于步骤S2所述的状态方程和目标函数，引入拉格朗日乘子构建哈密顿函数，并确定目标函数求极值所需的必要条件：伴随函数和控制方程；

[0030] H＝λ1f1+λ2f2+(1+λ3)f3   9

[0031]

[0032]

[0033] 其中，式9为哈密顿函数，式10为伴随函数，式11为控制方程；

[0034] S4：联立求解步骤S2及步骤S3所述的状态方程、伴随函数和控制方程，确定目标函数在给出条件范围内取得极值时，对应控制条件的最优过程变化，即优化得出不同时间段的比生长速率μset。

[0035] 进一步，鲜味肽为牛肉风味肽，其序列如SEQ.ID.No.1所示。

[0036] 进一步，S1中所述鲜味肽生物表达工程菌以Bacillus subtilis 168为宿主菌，以pMA09为载体质粒，以具有自诱导特性高效表达的PsrfA为启动子。

[0037] 进一步，培养基包括以下浓度的组分：柠檬酸氢二铵7.5g/L、硫酸钠2.0g/L、硫酸铵20.0g/L、氯化铵3.5g/L、磷酸氢二钾14.6g/L、一水磷酸二氢钠4.0g/L、七水硫酸镁1.0g/L、葡萄糖20.0g/L和微量金属离子溶液3.0mL。

[0038] 进一步，微量金属离子溶液包括以下浓度的组分：氯化钙0.5g/L、七水硫酸锌0.18g/L、一水硫酸锰0.1g/L、乙二胺四乙酸二钠10.05g/L、氯化铁8.35g/L、五水硫酸铜
0.16g/L和六水氯化钴0.18g/L。

[0039] 本发明的有益效果是：

[0040] 与现有技术相比，本发明提供的基于指数流加补料原理的鲜味肽发酵生产方法可以在发酵过程中多阶段实时控制指数流加速率，在解除底物抑制的同时，也使限制性底物能有效地匹配宿主菌的生长需求，进而增加菌体生物量，并提高鲜味肽的发酵强度和产量(BMP产量3.16g/L)，实现了鲜味肽的高效生产。该优化的发酵方法效果显著，生物量和鲜味肽产量分别为分批发酵的3.2倍和2.8倍，为BMP及其它鲜味肽或蛋白质的大规模生产提供了坚实的理论基础。

附图说明

[0041] 图1为重组质粒琼脂糖电泳结果图；M代表DNA maker，1代表原质粒pMA09-8BMP，2代表重组质粒pMA09srfA-8BMP；

[0042] 图2为基于庞特里阿金极大值原理优化的鲜味肽BMP指数流加补料发酵图；“■”表示DCW，“★”表示鲜味肽产量，“▲”表示葡萄糖浓度，“—”表示DO；

[0043] 图3为鲜味肽BMP的分批发酵图；“□”表示DCW，“☆”表示鲜味肽产量，“△”表示葡萄糖浓度，“—”表示DO。

具体实施方式

[0044] 下面将结合本发明中的实施例，对本发明作进一步详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0045] 实施例一：鲜味肽高效自诱导生产菌株的构建

[0046] 将现有技术中已经成功构建出的鲜味肽表达菌株B.subtilis 168/pMA09-8BMP(林璐.鲜味肽BMP的克隆表达与高密度发酵生产[D].西华大学,2018)作为研究对象，将原质粒pMA09中的启动子替换成高效自诱导表达型启动子srfA，以此构建高效自诱导表达鲜味肽的重组质粒。自诱导型启动子srfA的基因序列如SEQ ID NO.2所示，使用全质粒PCR将原质粒pMA09作为PCR模板，设计的同源臂序列结果如表1所示。

[0047] 表1 pMA09全质粒PCR的同源臂序列

[0048]

[0049] 采用碱裂解法提取B.subtilis 168/pMA09-8BMP中重组质粒pMA09-8BMP，全质粒PCR扩增技术获得鲜味肽自诱导表达载体pMA09srfA-8BMP，并对重组质粒进行琼脂糖凝胶电泳验证结果如图1所示，泳道2为原质粒pMA09-8BMP的基因条带，泳道3的基因条带大于泳道2基因条带，大小为7642bp与设计结果相同，并通过测序检验自诱导表达启动子的重组质粒pMA09srfA-8BMP成功构建。将上述重组质粒转化到空白重组菌B.subtilis 168中，以此获得鲜味肽高效自诱导生产菌株B.subtilis 168/pMA09srfA-8BMP。

[0050] 实施例二：鲜味肽生物表达工程菌发酵动力学模型的建立

[0051] 菌体B.subtilis 168/pMA09srfA-8BMP中所用的启动子PsrfA为细胞密度依赖型启动子，其菌体密度积累和鲜味肽表达具有一定同步性，且主要集中在菌体的指数生长阶段，故以该阶段作为补料发酵控制阶段。在此发酵过程中，葡萄糖浓度为唯一底物限制性条件，结合上述启动子的表达规律，确定在补料阶段，该菌体的生长和产物表达适用于具有底物抑制和产物抑制的生长偶联型模型(式17-21)：

[0052] μ＝qgYX/S   17

[0053] qs＝qm+qg+qp   18

[0054]

[0055]

[0056]

[0057] 菌体指数生长期的补料控制主要是控制发酵罐内的葡萄糖量，使之在能够满足菌体生长需求的同时，又不会积累而对菌体生长产生底物抑制，该阶段的补料按照指数流加补料进行(式1)。在此基础上，结合式17-21，为后续庞特里阿金最大值原理对μ值的条件探索的优化，设定μset为菌体实际生长的μ，整理出菌体在指数补料阶段的发酵动力学模型如下：菌体生长速率方程(式2)、底物消耗速率方程(式3)和产物合成速率方程(式4)。

[0058]

[0059]

[0060]

[0061] 在指数流加补料过程中，μset值对于确定菌体的底物需求量具有重要作用。在实际发酵过程中，菌体指数生长期的μset值在不断变化，仅设定固定的μset值进行指数补料不是满足菌体实际生长需求的最佳控制，故将μset值作为未知的控制变量用于接下来的庞特里阿金极大值原理优化。上述发酵动力学模型中补料的初始参数X0、V0、SF由实际发酵过程中检测获得(表2)，其余动力学参数：qm(h-1)、YX/S(g/g)、YP/S(g/g)、α、β如表3所示。

[0062] 表2发酵过程中的指数补料初始值

[0063]

[0064] 表3发酵过程中的动力学参数值

[0065]

[0066] 代入参数后获得具体的发酵动力学模型如下：

[0067]

[0068]

[0069]

[0070] 将构建的发酵动力学模型(式22～24)定义为庞特里阿金极大值原理的状态方程(式25～27)，以其中的鲜味肽合成动力学模型构建目标函数(式28)，求解鲜味肽产量取得极大值时对应发酵控制条件μset在0～0.6h-1范围内的过程变化(μset(t))。在此基础上，通过引入拉格朗日乘子(λ(t))构建哈密顿函数(式29)，并根据庞特里阿金极大值原理进一步确定伴随函数(式30)和控制方程(式31)。联立求解上述状态方程、适应度函数和控制方程，确定当目标函数取得极值大时对应的μset(t)。最终μset(t)以每2h取一个点进行实际控制，具体变化规律如表4所示。

[0071] 状态方程：

[0072]

[0073]

[0074]

[0075] 目标函数：

[0076]

[0077] 哈密顿函数：

[0078]

[0079] 伴随函数：

[0080]

[0081] 控制方程：

[0082]

[0083] 表4基于庞特里阿金极值原理优化的不同阶段的μset值

[0084]

[0085] 实施例三：基于庞特里阿金极大值原理发酵优化生产鲜味肽BMP

[0086] (1)培养基

[0087] 所用的种子培养基为LB培养基：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、氯化钠10g/L。发酵培养基(g/L)：柠檬酸氢二铵7.5、硫酸钠2.0、硫酸铵20.0、氯化铵3.5、磷酸氢二钾14.6、一水磷酸二氢钠4.0、七水硫酸镁1.0、微量金属离子溶液3.0mL、葡萄糖20.0(单独灭菌)。微量金属离子溶液(g/L)：氯化钙0.5、七水硫酸锌0.18、一水硫酸锰0.1、乙二胺四乙酸二钠10.05、氯化铁8.35、五水硫酸铜0.16、六水氯化钴0.18。补料培养基(g/L)：葡萄糖800。

[0088] (2)发酵条件

[0089] B.subtilis 168/pMA09srfA-8BMP工程菌作为BMP的自诱导表达菌，于含有2.5L初始培养基的5L发酵罐中进行发酵生产。上罐发酵之前，首先将甘油管保存的表达菌以0.1％的比例接种至5mL的种子培养基中，于200rpm、37℃的条件下培养8h以活化菌体；然后以1％的比例转接至含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，于相同的培养条件下培养8h；最后将该培养液作为发酵种子培养液以10％的比例接种至发酵罐中，进行发酵培养。在整个发酵过程中，培养温度为37℃，培养pH为7，同时通过自动调节通入的空气流速和搅拌速度将发酵液中的DO维持在30％左右。

[0090] 按照上述发酵条件，根据表4所呈现的菌体指数生长阶段的最佳μset值控制，结合指数流加公式(式1)对鲜味肽BMP的发酵进行多级指数补料控制。在补料过程中，通过每小时调整一次补料流加速率F值来模拟指数流加。每2h检测一次发酵罐内的菌体干重(DCW)、葡萄糖浓度和产物浓度，以监测实时发酵情况(图2)。在发酵40h后，在基于庞特里阿金极大值原理的发酵控制下，底物葡萄糖的积累并不明显，并且菌体DCW和产物浓度分别达到了71.32g/L和3.16g/L。

[0091] 菌体干重的测定：每隔2h从发酵罐中取出5mL发酵培养液进行干重测定，将发酵液置于离心机中在12000rpm的条件下离心20min。去除上清液，再用蒸馏水进行重悬，再次以相同的条件下离心20min，然后在80℃条件下干燥至恒重；葡萄糖浓度由葡萄糖分析仪自动检测；产物浓度采用Bradford法测定。

[0092] 对比例一：鲜味肽BMP的分批发酵生产

[0093] 该分批发酵实验所用的培养基，与实施例(3)相比，除葡萄糖浓度提高至40g/L外，其余组分浓度均与其一致，发酵条件也按照实施例(3)所述条件进行，整个发酵过程不进行任何补料控制，以此作为基于庞特里阿金极值原理优化发酵的对比试验。分批发酵40h后，发现菌体浓度和鲜味肽的产量分别达到了22.53g/L和1.11g/L(图3)。

[0094] 对比基于庞特里阿金极大值原理的鲜味肽发酵结果和对比例1中的分批发酵结果，发现前者的菌体浓度和鲜味肽产量分别为后者的3.2倍和2.8倍。结果表明，基于庞特里阿金极大值原理优化发酵补料控制更加适合于菌体B.subtilis 168/pMA09srfA-8BMP的实际生长情况，能够在充分满足菌体碳源需求的同时，有效地避免了因碳源积累而引起的底物抑制，并提高目标产物的产量，为BMP及其它鲜味肽或蛋白质的大规模生产奠定了理论基础。

[0095] 虽然结合实施例对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。