一株花青素产生菌株CJ6及其应用

摘要

本发明涉及一株花青素产生菌株CJ6及其应用，属于微生物资源与技术领域。所述菌株CJ6经鉴定为层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)，保藏号为CGMCC NO.14793。菌株CJ6适生范围宽，易培养，可利用农业固体废弃物、粮食原料以及多种碳源合成花青素，生产成本低，周期短，环境友好，可实现周年生产，为花青素生产带来了一种新资源，应用前景广阔。

权利要求

1.一株花青素产生菌株CJ6，其特征在于：通过形态特征观察与分子生物学鉴定，确定菌株CJ6为层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)；该菌株2017年11月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院

3号，保藏号为CGMCC NO.14793。

2.根据权利要求1所述的一株花青素产生菌株CJ6，其特征在于：菌株CJ6产花青素的鉴别方法，采用酸碱变色反应、类黄酮定性颜色反应、紫外可见吸收峰测定以及液相/质谱测定相结合的鉴别方法。

3.根据权利要求1所述的一株花青素产生菌株CJ6，其特征在于：该菌株可在多种培养基中生长，可以在添加不同碳源的马铃薯培养基、马丁氏培养基以及察氏培养基中生长，所述的不同碳源是指葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油、玉米粉、大米粉、燕麦粉和麸皮；菌株CJ6可以利用农业固体废弃物和粮食原料生长，所述的农业固体废弃物是指秸秆、麸皮、稻壳中的1种或多种组合，所述的粮食原料是指大米、玉米、燕麦中的1种或多种组合。

4.根据权利要求1所述的一株花青素产生菌株CJ6，其特征在于：菌株CJ6在pH值为3-

10，温度在20℃-37℃条件下可生长；在pH值为3-9，温度在20℃-37℃条件下，可代谢产生花青素。

5.根据权利要求1所述的一株花青素产生菌株CJ6在花青素生产中的应用。

6.根据权利要求5所述菌株CJ6在花青素生产中的应用，其特征在于，菌株CJ6通过液体发酵培养生产花青素，包括步骤：(1)种子液制备：将菌株CJ6分别接种到马丁氏或马铃薯葡萄糖液体培养基，在20℃-37℃，转速为150-200r/min条件下，培养2-6天，得到种子液；(2)发酵培养：按照1％-10％接种量，将CJ6种子液分别接种于含有不同碳源的马铃薯或马丁氏或察氏液体培养基中，在温度为20℃-37℃，转速为150-200r/min条件下，培养2-10d，可代谢产生花青素；所述的不同碳源是指葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油、玉米粉、大米粉、燕麦粉和麸皮。

7.根据权利要求5所述的菌株CJ6在花青素生产中的应用，其特征在于：菌株CJ6通过固态发酵培养生产花青素，包括步骤：(1)种子液制备：将菌株CJ6分别接种到马丁氏或马铃薯葡萄糖液体培养基，在温度为20℃-37℃，转速为150-200r/min条件下，培养2-6天，得到种子液；(2)发酵培养：将CJ6种子液分别接种于含有不同碳源的马铃薯、马丁氏、察氏固体培养基中，在20℃-37℃条件下，培养2-10d，代谢产生花青素。

8.根据权利要求5所述的菌株CJ6在花青素生产中的应用，其特征在于：菌株CJ6通过固态发酵培养生产花青素，包括步骤：(1)种子液制备；(2)发酵培养：称量粮食原料或农业固体废弃物中的1种或多种组合原料，分别加入40-60％适量的自来水浸泡后，置于高压蒸汽灭菌锅中，121℃灭菌20-30min；然后，向灭菌后的固体培养原料中，按照4％-20％接种量，接入菌株CJ6种子液，每隔2-3天搅拌一次，待发酵原料颜色变红或紫色时，得到固体发酵产品；所述的粮食原料是指大米、玉米、燕麦中的1种或多种组合；所述的农业固体废弃物是指秸秆、麸皮、稻壳中的1种或多种组合。

9.根据权利要求8所述的菌株CJ6在花青素生产中的应用，其特征在于：菌株CJ6的种子液的制备方法为：菌株CJ6接种到马丁氏液体培养基或马铃薯葡萄糖液体培养基中，在温度为20℃-37℃，转速为150-200r/min条件下，培养2-6天，得到菌株CJ6种子液。

10.根据权利要求5所述的菌株CJ6在花青素生产中的应用，其特征在于：菌株CJ6及其发酵液，对革兰氏阳性和革兰氏阴性指示菌，均不产生抑制作用，菌株CJ6及其发酵液无生物毒性，可以应用于保健品、食品、化妆品；所述的革兰氏阳性菌是指藤黄微球菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌；所述的革兰氏阴性菌是指大肠杆菌。

说明书

一株花青素产生菌株CJ6及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一株花青素产生菌株CJ6及其应用，属于微生物资源与微生物技术领域。

背景技术

[0002] 花青素属于类黄酮化合物，具有清除自由基、抗癌、抗氧化、抗突变、抗辐射、预防心脑血管疾病，改善皮肤弹性、增进视力、改善睡眠、保护肝脏等生理作用，被广泛应用于医药、化妆品、保健品、食品等领域。

[0003] 植物花青素在蓝莓，桑葚，葡萄等植物中含量较高，是构成花瓣和果实颜色的主要色素之一。其颜色随着pH值变化而呈现出红、蓝、紫不同颜色，在500-550nm可见光区域有吸收峰。

[0004] 植物生长受土壤、温度、地域等环境因素影响较大，且收获具有季节性。用植物生产花青素，因受资源影响，较难做到周年生产。

[0005] 利用微生物生产花青素，不受季节影响，成本低，可以实现周年生产。本发明公开一株花青素产生菌，为花青素生产提供一种新资源和新途径。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供了一株花青素产生菌株CJ6及其应用。

[0007] 本发明所述的花青素产生菌株CJ6，通过对其形态特征观察，基因组DNA提取，PCR扩增和18S rDNA-ITS序列分析，在NCBI数据库进行Blast比对，进化树构建，发现菌株CJ6与Fusarium proliferatum菌的同源性最高，结合菌体的形态特征，确定该菌株为层生镰刀菌(Fusarium proliferatum),命名为层生镰刀菌CJ6(Fusarium proliferatum CJ6)。该菌株已于2017年11月10日保藏于中国微中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.14793，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

[0008] 本发明所述的花青素产生菌CJ6，采用下述技术方案获得：

[0009] 1、菌株筛选

[0010] 采集植物根际土样多份，用生理盐水稀释成10-1-10-8的溶液，分别在牛肉膏蛋白胨固体培养基、马丁氏固体培养基、马铃薯葡萄糖(PDA)固体培养基上涂布，分离菌株。每天观察，并挑取平板中呈现红色、蓝色、紫色的菌落，转接到新的同种固体培养基上进行多次划线纯化，直至得到纯菌落，并对菌落形态进行观察。

[0011] 取上述纯化的菌株，分别接入马丁氏和PDA液体培养基中进行摇瓶培养，得到不同菌株的培养液。取培养液开展酸碱变色反应、类黄酮定性颜色反应、紫外可见吸收峰测定以及液相/质谱(LC/MS)测定。

[0012] 由测定结果得知，分离纯化得到的菌株CJ6，其培养液具有花青素相关的颜色反应与吸收峰，且利用液相/质谱方法，检测到培养液中含有花青素，从而筛选得到一株能够产生花青素的菌株CJ6。

[0013] 2、菌株鉴定

[0014] CJ6菌株形态特征观察：该菌株接种到PDA固体平板上，7-8天可长满直径为9cm平板。菌落外观为棉絮状，呈粉白色到紫色，紫色代谢产物可转移到培养基中，平板背面呈现白紫相间或紫色，培养时间延长，菌落和培养基均会变成紫黑色。菌落表面有时会产生紫黑色液滴分泌物。产孢，分生孢子卵圆形。

[0015] 提取菌株CJ6基因组DNA，扩增18SrDNA-ITS序列，测序,得到该菌株的ITS4区的基因序列，总共得到545bp长度的碱基序列。结合菌株CJ6形态特征观测结果和18SrDNA-ITS序列分析结果，确定CJ6菌株为层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)，并命名为层生镰刀菌CJ6(Fusarium proliferatum CJ 6)。

[0016] 3、菌株CJ6抑菌活性测定

[0017] 选择藤黄微球菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌以及大肠杆菌作为指示菌，对菌株CJ6及其发酵液(其中含有花青素)开展抑菌实验检测，发现菌株CJ6及其发酵液对藤黄微球菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌以及大肠杆菌指示菌，没有产生抑菌圈。由此得知，菌株CJ6及其发酵液无生物毒性，环境友好。

[0018] 4、菌株CJ6生长、代谢花青素与应用

[0019] 菌株CJ6适生条件范围宽，易培养，可在多种培养基质中生长。可以在添加不同碳源的马铃薯培养基、马丁氏培养基以及察氏培养基中生长，所述的不同碳源是指葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油、玉米粉、大米粉、燕麦粉和麸皮；菌株CJ6可以利用农业固体废弃物和粮食原料生长，这里所述的农业固体废弃物是指秸秆、麸皮、稻壳中的1种或多种组合，所述的粮食原料是指大米、玉米、燕麦中的1种或多种组合。所述的粮食原料与固体废弃物原料，事先要加入原料重量的40-60％的自来水浸泡后，置于高压蒸汽灭菌锅中，121℃灭菌20-30min后使用。

[0020] 所述的花青素产生菌株CJ6，其特征在于：菌株CJ6在pH值为3-10，温度在20℃-37℃条件下可生长；在pH值为3-9，温度在20℃-37℃条件下，通过液体发酵培养和固体发酵培养，可代谢产生花青素。

[0021] 菌株CJ6通过液体发酵培养生产花青素，包括步骤：(1)种子液制备：菌株CJ6接种到马丁氏液体培养基或马铃薯葡萄糖液体培养基中，在温度为20℃-37℃，150r/min-200r/min，培养2-6天，得到菌株CJ6的种子液；(2)发酵培养：按照1％-10％接种量，将CJ6种子液分别接种于添加不同碳源的马铃薯或马丁氏或察氏液体培养基中，在温度为20℃-37℃，转速为150-200r/min条件下，培养2-10d，可代谢产生花青素。这里所述的不同碳源是指葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油、玉米粉、大米粉、燕麦粉和麸皮。

[0022] 菌株CJ6通过固态发酵培养生产花青素，包括步骤：(1)种子液制备；(2)发酵培养：将CJ6种子液分别接种于添加不同碳源的马铃薯、马丁氏、察氏固体培养基中，在温度为20℃-37℃条件下，培养2-10d，代谢产生花青素。

[0023] 固态培养发酵生产花青素，包括步骤：(1)种子液制备：(2)发酵培养：可利用大米、玉米、燕麦等粮食原料中的一种或多种组合，以及秸秆、麸皮、稻壳等固体废弃物原料中的一种或多种组合，通过固态发酵，代谢产生花青素。

[0024] 菌株CJ6代谢产生的花青素，水溶性好，同时可溶于乙醇，正乙烷，乙酸乙酯以及甲醇等溶剂。

[0025] 本发明的菌株CJ6为花青素生产提供了一种新资源，该菌株及其花青素发酵液，环境友好，可以应用于保健品、食品、化妆品等领域，应用前景广阔。

[0026] 发明的有益效果是：

[0027] 1、本发明所提供的菌株CJ6,从土壤筛选得到，环境友好，适宜性宽，易培养，在pH值为3.0-10.0，温度为20℃-37℃条件下可生长，可利用多种碳源、农业固体废弃物、粮食原料，发酵生产花青素。

[0028] 2、利用菌株CJ6生产花青素，工艺简便，占地小，成本低，生产周期短，避免了现有技术利用植物资源生长周期长、受季节和环境影响大等弊端，可以一年四季进行规模生产。为花青素生产带来一种新资源和新生产方式。

[0029] 3、通过抑菌试验测定发现，菌株CJ6及其花青素代谢产物，无生物无毒，绿色环保，可以应用于医疗保健、食品、化妆品等领域，应用前景广阔。

附图说明

[0030] 图1为菌株CJ6产花青素的全波段扫描图。

[0031] 图2为菌株CJ6的菌落形态图。

[0032] 图3为菌株CJ6显微形态图。

[0033] 图4为菌株CJ6的ITS序列系统发育树。

[0034] 图5为菌株CJ6及其发酵液对指示菌的抑菌圈图。

[0035] 图6为菌株CJ6在不同碳源培养基中菌落直径变化。

具体实施方式

[0036] 下面具体实施方式，是对本发明技术方案作进一步具体的说明，但本发明不局限于以下所列举具体实施方式。

[0037] 实施例1菌株CJ6的筛选与鉴定

[0038] 1、菌株分离与纯化

[0039] (1)从不同地区采集多份土壤，把土样研磨成粉末状，然后用生理盐水按照1:10,1:100，1:1000,1:10000；1:100000梯度，稀释成10-1-10-8溶液。取100-200ul稀释液，分别在牛肉膏蛋白胨固体培养基、马丁氏固体培养基、马铃薯葡萄糖(PDA)固体培养基上涂布，分离菌株。置于25-37℃，培养3-7天。每个稀释度设置三个平行。

[0040] (2)挑选上述平板中有颜色的菌落，在上述相应的分离培养基上划线分离纯化。此步骤重复2-3次，直至得到单一菌落，用试管斜面保存。所用的培养基配方如下：

[0041] 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1L，121℃灭菌15min。固体培养基添加琼脂10.0-15.0g。

[0042] 马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：马铃薯200g，葡萄糖10-20g，蒸馏水1L，pH自然，115℃灭菌20-30min。固体培养基添加琼脂10.0g-15.0g。

[0043] 马丁氏培养基：KH2PO4 1.0g，MgSO4 7H2O 0.5g，葡萄糖10.0g，蛋白胨5.0g，蒸馏水1L，pH自然，115℃灭菌15-20min。固体培养基添加琼脂10.0g-15.0g。

[0044] 2、花青素产生菌株筛选

[0045] 将上述步骤1中得到的有颜色的单菌落，分别接种到马铃薯液体培养基或马丁氏液体培养基中，置于20℃-37℃，150r/min-200r/min摇床中，震荡培养2-6d，获得培养液。对不同菌株的培养液，分别进行酸碱变色反应、类黄酮定性颜色反应、紫外可见吸收峰测定以及液相/质谱(LC/MS)测定，确定花青素产生菌。方法如下：

[0046] (1)酸碱变色反应：将纯化菌株液体培养液，分别配制成pH值为2，4，6，8，10，12系列溶液，通过酸碱变色反应，得知菌株CJ6在pH小于4呈红色，pH 4-10呈紫色，pH大于10呈深紫色，初步判断菌株CJ6为产花青素菌株，

[0047] (2)类黄酮定性颜色反应：具体操作为，在CJ6培养液中加入5％氯化铁的溶液，震荡，溶液变为灰黑色，静置一段时间有黑色沉淀产生。同时，向CJ6培养液中加入1％氯化铝溶液，振荡，溶液变为黄色后，又变为粉色，静置一段时间，有粉紫色物质沉降。根据这些类黄酮特征颜色反应，发现菌株CJ6培养液可呈现类黄酮化合物相关颜色反应，属于类黄酮类化合物，结合上面酸碱颜色反应，进一步判断菌株CJ6可产生花青素。

[0048] (3)紫外可见吸收峰测定：对CJ6菌株培养液离心，取上清液，利用紫外可见分光光度计从200nm-800nm进行全波段扫描，根据在可见光区500nm-550nm具有花青素特异吸收峰，进一步判断菌株CJ6产生花青素。图1为菌株CJ6产花青素的全波段扫描图。

[0049] (4)利用液/质色谱(LC/MS)检测：将CJ6菌株发酵液，过0.22um膜，然后进行LC/MS测定分析。色谱柱为C18，色谱分离条件：柱温为40℃；流速0.35mL/min；流动相组成A：水+5％乙腈+0.1％甲酸，B：乙腈+0.1％甲酸；进样量为10μL，自动进样器温度4℃。经检测，菌株CJ6培养液中含有花青素成分。

[0050] 经过上述方法联用，筛选得到一株花青素产生菌株CJ6。

[0051] 3、菌株CJ6的鉴定

[0052] 3.1菌落形态观察

[0053] 采用点接法，将菌株CJ6的菌液或菌丝，在马铃薯葡萄糖(PDA)琼脂固体培养基平板上接种，置于25-30℃培养箱中培养。生长2d，菌落直径大小10-15mm，4d菌落直径30-40mm,6d到50-65mm，8d即可长满整个平板(直径为90mm)。菌丝白色，菌落外观为棉絮状，边缘形态为根状，质地疏松。随着生长，菌落颜色会呈现白紫相间或紫色，紫色代谢产物可转移到培养基中，平板背面呈现白紫相间或紫色，培养时间延长，菌落和培养基均会变成紫黑色。菌落表面有时会产生紫黑色液滴分泌物。菌株CJ6显微形态观察得知，产胞，分生孢子卵圆形，菌丝有隔，分枝。菌株CJ6的菌落形态和显微形态见图2、图3。

[0054] 3.2菌株CJ6分子生物学鉴定

[0055] 3.2.1菌株CJ6的基因组提取

[0056] (1)菌株培养:将菌株CJ6接种到马丁氏或PDA液体培养基中，在温度为25-30℃，转速为150-200r/min摇床中，培养3-6天，过滤收集菌体，放入冰箱-20℃中保存。

[0057] (2)将上述冰箱中保存的CJ6菌体放入研钵中，加入少量液氮反复研磨至菌体呈粉末状。将研磨好的菌体转入1.5ml的EP管中，加入600μl 65℃预热的SDS裂解液，65℃保温30min，期间不断摇匀。

[0058] (3)置于冰中冷却至室温，然后加入等体积的酚/氯仿/异戊醇混合液(25:24:1)，充分混匀，4℃，10000g，离心10min，取上清液至新EP管中。

[0059] (4)向新EP管中加入等体积的氯仿/异戊醇混合液(24:1)，充分混匀，4℃，10000g，离心10min，取上清液至新EP管中。

[0060] (5)向上清中加入1/10体积的3M NaAc和2.5倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min。

[0061] (6)4℃，10000r/min，离心10min，弃上清。

[0062] (7)使用500μL 70％的冰乙醇洗涤DNA 2-3次，然后倒置晾干，加入50μL的TE溶解。

[0063] (8)用1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。

[0064] 3.2.2 PCR扩增

[0065] 采用真菌通用引物ITSI(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)，扩增菌株18SrDNA-ITS基因序列。PCR扩增采用50μL反应体系：5μL 10×PCR Buffer，1μL dNTP mix，2μL DNA模板，4μL NL1(或ITS1)(5p)，4μL NL4(或ITS4)(5p)，0.25μL Taq HS，37.75μL ddH2O。

[0066] PCR反应条件：95℃5min，循环一次；95℃30s，55℃30s，72℃1min，循环35次；72℃7min。PCR循环结束后取PCR产物2μL，加6μL上样缓冲液，用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。

[0067] 3.2.3测序及系统发育树构建

[0068] 将所提基因组DNA送北京诺赛基因组研究中心进行扩增、测序，得到的该菌株的18SrDNA-ITS的基因测序序列如下：

[0069]

[0070] 得到长度为545bp的碱基序列。

[0071] 将上述测序结果与网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/中基因序列比对，发现菌株CJ6的18SrDNA-ITS基因序列与Fusarium proliferatum中的一些菌株的ITS序列的同源性最高。在NCBI里查找相关菌株序列，用Clustalx软件进行序列比对，再用MEGA6.0软件构建系统发育树，图4为菌株CJ6的ITS序列系统发育树。结果显示，菌株CJ6与菌株Fusarium proliferatum聚于同一分支，系统发育关系最为密切。定名为层生镰刀菌CJ6(Fusarium proliferatum CJ6)。

[0072] 目前，国内外尚无文献报道层生镰刀菌(Fusarium proliferatum)具有产花青素的功能。因此，层生镰刀菌CJ6为一株具有代谢产生花青素的新功能菌株。

[0073] 实施例2菌株CJ6及其发酵液抑菌试验

[0074] 基于抑菌试验检测发现，菌株CJ6及其发酵液，对指示菌生长没有影响，即无生物毒性，环境友好。实验方法如下：

[0075] (1)菌株CJ6培养与测试样制备

[0076] 将CJ6接种至马丁氏液体培养基或马铃薯葡萄糖液体培养基中，培养2-6天，吸取发酵液4mL-10ml，于800R离心10min，得到发酵液上清液(其中含有花青素)和沉淀的菌体，备用。

[0077] (2)抗生素对照组溶液的配置

[0078] 称量金霉素抗生素20.0mg，置于100mL蒸馏水中，配成200mg/L的金霉素溶液，备用。

[0079] (3)指示菌的活化培养

[0080] 选择藤黄微球菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌3种革兰氏阳性菌，以及大肠杆菌革兰氏阴性菌，作为指示菌，将其接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，置于30-37℃，160r/min-180r/min，培养1-2天。

[0081] (4)抑菌试验

[0082] 采用抑菌圈法测定：取上述活化好的大肠杆菌，藤黄微球菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌4种指示菌的培养液，稀释使其OD600nm在1.0左右，然后吸取100-200uL的指示菌的菌液，滴于Ⅱ号固体培养基上，均匀涂布。然后，分别在涂布好的平板上，用点接法，接种金霉素对照液4-8ul和上述(1)中的发酵液上清液4-8ul以及沉淀菌体少许，设置3个平行，然后置于20-37℃培养箱中培养，24h、48h、36h、48h各调查抑菌圈一次。图5为菌株CJ6及其发酵液对指示菌的抑菌圈图，其中A板为金黄色葡萄球菌指示菌涂板、B板为藤黄微球菌指示菌涂板；图中右上角为金霉素抗生素溶液，右下方为培养基、左上方为发酵液上清液，左下方为CJ6菌体。

[0083] 结果显示，CJ6菌体与发酵液上清液(其中含有花青素)，对大肠杆菌、藤黄微球菌、金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌4种指示菌的抑菌圈均为零，由此可知，菌株CJ6及其发酵液(其中含有花青素)对指示菌没有生物毒性，绿色环保。

[0084] Ⅱ号固体培养基配方：蛋白胨6g，牛肉膏1.5g，酵母浸粉6g，葡萄糖1g，琼脂10-15g，水1000mL，115℃，高温灭菌20min。

[0085] 实施例3菌株CJ6生长、代谢花青素与应用

[0086] 1、不同初始pH值对菌株生长和花青素合成的影响

[0087] 配置马丁氏和马铃薯葡萄糖液体培养基，分别用盐酸或氢氧化钠将培养基pH值调至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12，然后分装，每种pH值培养基设置3个平行，115-121℃，灭菌15-20min，冷却，按照1-10％的接种量，接种菌株CJ6种子液，在接种后的第2、4、6、8、10天测定OD520值，并观察颜色变化。结果显示，菌株CJ6能在pH值为3-10的培养基中生长，在pH值为
3-9的培养基中能代谢产生花青素。

[0088] 2、不同培养基、不同碳源对菌株CJ6生长与花青素代谢的影响

[0089] 分别制备马丁氏、PDA和察氏液体培养基与固体培养基，培养基中分别添加葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油、玉米粉、大米粉、燕麦粉，麸皮等不同碳源。液体培养基分装到三角瓶中，在115-121℃温度下，灭菌15-20min。每个实验设置3个平行。对于上述配置的含有不同碳源的固体培养基，在115-121℃条件下，灭菌15-20min后，倒平板，得到含有不同碳源的固体培养基平板。

[0090] (1)液体发酵培养与花青素代谢生产

[0091] 菌株CJ6种子液制备：将菌株CJ6分别接种到马丁氏或PDA液体培养基中，在温度为20℃-37℃，转速为150-200r/min条件下，培养2-6天，得到种子液。

[0092] 液体发酵培养：按照1％-10％接种量，将CJ6种子液分别接种于添加不同碳源的马铃薯或马丁氏或察氏液体培养基中，在20℃-37℃，转速为150-200r/min条件下培养。在接种后的第2、4、6、8、10天，分别对发酵液OD520值进行测定，并观测发酵液颜色变化。结果显示，菌株CJ6能够在添加上述碳源的液体培养基中生长，是一株碳源利用谱宽的菌株，同时得知，在上述不同碳源液体培养基中，菌株CJ6可代谢产生花青素，但不同碳源代谢花青素有差异。

[0093] (2)固态发酵培养与花青素代谢生产

[0094] 菌株CJ6种子液制备：方法与上述(1)中相同。

[0095] 固态发酵培养：采用点接法，在含有不同碳源的马丁氏、PDA和察氏固体培养基平板中心，滴加一小滴菌株CJ6种子液，于温度为20℃-37℃条件下培养，第2、4、6、8、10天，分别观测平板中菌落大小、形态与颜色变化。

[0096] 结果显示，菌株CJ6能够在添加葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油、玉米粉、大米粉、燕麦粉，麸皮等不同碳源的固态培养基中生长，菌株菌落生长见图6。同时得知，在添加不同碳源固体培养基中，菌株CJ6可代谢产生花青素，不同碳源代谢产生的花青素量有差异。

[0097] 察氏培养基配方：硝酸钠2g，磷酸氢二钾1g，氯化钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，葡萄糖30g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，摇匀，pH自然，115℃灭菌15min。固体培养基添加琼脂10g-15g。

[0098] 3、粮食与废弃物原料固态发酵与花青素代谢

[0099] 菌株CJ6种子液制备：方法同上述(1)。

[0100] 固体发酵培养：选择大米、玉米、燕麦等粮食原料，以及秸秆、麸皮、稻壳等固体废弃物原料，分别按照原料重量的40％-60％加入自来水，浸泡后，置于高压蒸汽灭菌锅中，121℃灭菌20-30min。然后，向灭菌后的粮食与废弃物原料中，按照4％-20％接种量，接入菌株CJ6种子液，每隔2-3天搅拌一次，观测菌株生长与产花青素状况。结果显示，CJ6菌株能在上述粮食与废弃物原料基质上生长，并代谢产生花青素，使发酵原料颜色变红或紫色。

[0101] 综上所述，通过液体和固体发酵培养，菌株CJ6均可以代谢产生花青素。

[0102] 研究同时发现，菌株CJ6产生的花青素水溶性好，同时可溶于乙醇，正乙烷，乙酸乙酯以及甲醇等溶剂。

[0103] 本发明的菌株CJ6为花青素生产提供了一种新资源，该菌株及其花青素发酵产物，环境友好，可应用于保健品、食品、化妆品等领域，应用前景广阔。

[0104] 以上所述的实施例为本发明的目的、技术方案和有益效果的说明，本发明的实施方式不受上述实施例的限制，任何在本发明的宗旨、原理和原则范围内所做的改进、简化、替代、组合等，均视为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。