一株寡养单胞菌及其在白条党参上的应用转让专利
申请号 : CN201910632752.2
文献号 : CN110305814B
文献日 : 2020-08-28
发明人 : 杜文静 , 丁品 , 刘锦霞 , 李晶 , 李娜 , 武建荣 , 张建军
申请人 : 甘肃省科学院生物研究所
摘要 :
本发明提供了一株寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)ZBD‑a‑03‑I，该菌株现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.17102。ZBD‑a‑03‑I具有较高的固氮酶活性，可以降解多菌灵和联苯菊酯，同时对白条党参提取物具有较强的耐受性，ZBD‑a‑03‑I菌液或以ZBD‑a‑03‑I为核心菌株的微生物菌剂可以作为白条党参的专属固氮菌肥使用，也可用于修复残留多菌灵和联苯菊酯的土壤。
权利要求 :
1.一株寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp. ) ZBD-a-03-I，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.17102。
2.权利要求1所述的寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp. ) ZBD-a-03-I用于固氮。
3.一种权利要求1所述的寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp. ) ZBD-a-03-I用于降解多菌灵。
4.一种权利要求1所述的寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp. ) ZBD-a-03-I用于降解联苯菊酯。
5.权利要求1所述的寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp. ) ZBD-a-03-I的菌液或者以菌株ZBD-a-03-I为核心菌株的菌剂产品在种植白条党参时作为微生物氮肥施用。
6.权利要求1所述的寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp. ) ZBD-a-03-I的菌液或者以菌株ZBD-a-03-I为核心菌株的菌剂产品在种植白条党参时用于降解多菌灵。
7.权利要求1所述的寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp. ) ZBD-a-03-I的菌液或者以菌株ZBD-a-03-I为核心菌株的菌剂产品在种植白条党参时用于降解联苯菊酯。
说明书 :
一株寡养单胞菌及其在白条党参上的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及微生物领域，具体为一株寡养单胞菌及其在白条党参上的应用。
背景技术
[0002] 党参为中国常用的传统补益药，具有补中益气，健脾益肺之功效。现代研究，党参含多种糖类、酚类、甾醇、挥发油、黄芩素葡萄糖甙、皂甙及微量生物碱，具有增强免疫力、扩张血管、降压、改善微循环、增强造血功能等作用。此外对化疗放疗引起的白细胞下降有提升作用。甘肃是党参的主产地之一，渭源的白条党参，其年产量占全国党参总产量的60%以上，渭源更是被誉为“中国党参之乡”。甘肃省地处黄土高原，土质主要以黑垆土和黄绵土为主，土壤全氮含量低，pH偏碱性，会造成铵态氮肥中铵的挥发，不适合适用铵态氮肥。而《中药材生产质量管理规范》（GAP）规定：禁用硝态氮肥，氮肥施用过多会使商品药材中的亚硝酸盐积累并转化为强致癌物质亚硝酸铵，同时还会使药材质地松散，易患病害，药用果实中含氮量过高还会促进腐烂，不易保藏，GAP还要求在施肥过程中要保持或增加土壤肥力及土壤的生物活性。
[0003] 因此，最适合于党参种植的氮肥应首选微生物氮肥，即具有固氮性的微生物菌剂。现有技术中尚没有针对白条党参这一特殊作物的专用固氮菌肥，而普通的固氮菌肥中的固氮微生物对于党参种植环境并不能很好的适应，因而造成固氮效率不高，肥料施用效果不好，导致党参产量低，而推广难度大。除了甘肃特有的土壤环境对固氮微生物活性的影响以外，党参在种植过程中本身对土壤中释放的部分代谢产物也会影响固氮微生物的活性，且土壤中的微生物种群会与普通固氮菌肥中的固氮菌产生拮抗作用，从而限制其固氮活性。
[0004] 多菌灵是一种广谱性杀菌剂，对白条党参由真菌引起的病害有防治效果，可用于叶面喷雾、种秧处理和土壤处理等，在白条党参根腐病的防治中的使用广泛，土壤和白条党参中的多菌灵残留严重影响人类健康，因此研究多菌灵的生物降解具有重要意义。联苯菊酯是广谱杀虫剂，在土壤中的半衰期较长，这不仅对农业生态系统及水体造成污染，对白条党参质量安全与人类健康也存在潜在危害。目前，国内外研究多以单一农药的降解菌为主，但对不同类型的农药同时降解的降解菌研究较少。
[0005] 同时，额外施加原生土壤环境以外的微生物，会对原有的土壤微生态环境造成影响和破坏，且外来菌种的定殖性差，需要长期施用，大量施用才能保证微生物菌剂发挥效用，导致施用微生物菌剂的成本增加，而效果打折，且生态安全性仍需测评。
发明内容
[0006] 本发明是针对上述现有技术的不足和缺陷，提出了一株寡养单胞菌及其在白条党参上的应用。
[0007] 本发明的目的一是提供一株从白条党参根际土壤中分离得到的寡养单胞菌ZBD-a-03-I，该菌株现保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号CGMCC No.17102，保藏时间2019年01月02日。
[0008] 作为优选，寡养单胞菌ZBD-a-03-I对白条党参提取物的最高耐受量以党参炔苷计为3.47ug/ml。
[0009] 作为优选，寡养单胞菌ZBD-a-03-I的固氮酶活性为177.5 C2H2，nmol h-1 ml-1。
[0010] 作为优选，寡养单胞菌ZBD-a-03-I在 72h对200ml/L的多菌灵的降解率为84.33%[0011] 作为优选，寡养单胞菌ZBD-a-03-I在72h对100ml/L的联苯菊酯的降解率为51.06%[0012] 本发明的目的二是提供寡养单胞菌ZBD-a-03-I在种植白条党参上的用途，ZBD-a-03-I的菌液或者以ZBD-a-03-I为核心菌株的菌剂既可以作为微生物氮肥施用，有效促进白条党参的生长，也可以用于土壤修复，降解土壤中残存的多菌灵和联苯菊酯。
[0013] 本发明提供的寡养单胞菌ZBD-a-03-I是从白条党参根际土壤中分离得到的，对白条党参根部的代谢产物具有良好的耐受能力，以党参中主要活性成分党参炔苷计算，其最高耐受量达到3.47ug/ml，远高于白条党参根际土壤中党参炔苷的平均含量，证明ZBD-a-03-I能够在白条党参根际土壤中正常生长存活，发挥代谢作用。ZBD-a-03-I是通过阿须贝培养基从白条党参根际土壤中选择分离出来的，经乙炔还原法测定，ZBD-a-03-I具有较高的固氮酶活性，固氮酶活性为177.5 C2H2，nmol h-1 ml-1，可以作为微生物氮肥施用于白条党参。ZBD-a-03-I还能够同时降解土壤中残留的多菌灵及联苯菊酯，修复被污染的土壤，从源头上解决土壤及水体的污染问题，提高白条党参的质量安全性，为健康保驾护航。寡养单胞菌ZBD-a-03-I从白条党参根际土壤中分离，是白条党参根际土壤中的土著微生物，对白条党参根际土壤中的各种特殊生物碱等成分适应性好，因此代谢能力强，活性高，定殖能力强，而且不会对原有土壤微生态环境造成入侵破坏，生态安全性好。ZBD-a-03-I既具有高固氮性，又具有降解污染物的能力，是一株促生与修复的双效菌株，既具有肥料增产的作用，又具有生态修复的作用，有效提高白条党参产量的同时保证了药材的品质，改良了白条党参种植地的土壤环境，是一株应用前景广阔的优质菌株，同时由于其优良的定殖性，决定了其施用量少，施用成本低，对于白条党参种植业具有重大意义。
[0014] 保藏说明：
[0015] 菌种名称：寡养单胞菌
[0016] 拉丁名：Stenotrophomonas sp
[0017] 菌株编号：ZBD-a-03-I
[0018] 保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
[0019] 保藏机构简称：CGMCC
[0020] 地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
[0021] 保藏日期：2019年01月 02日
[0022] 保藏中心登记入册编号：CGMCC No. 17102。
具体实施方式
[0023] 下面结合具体实施实例对本发明进行详细说明。以下实施实例有助于此领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
[0024] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0025] 下述实施例中所使用的多菌灵和联苯菊酯标准品由北京中科质检生物技术有限公司提供。下述实施例中所使用的其他材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026] 下述实施例中所用的圆褐固氮菌（Azotobacter chroococcum）1.178，公众可从中国工业微生物菌种保藏管理中心甘肃分中心获得该菌株，以重复本申请的实验。
[0027] 下述实施例中所使用的培养基如下：
[0028] 固氮菌富集培养基：蔗糖15g，磷酸二氢钾0.8g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.2g，碳酸钙1.0g，质量分数为1%的钼酸钠、硼酸、硫酸锰、硫酸亚铁（现配）水溶液各1ml，蒸馏水1000ml，pH6.5-7.0。
[0029] 阿须贝培养基：甘露醇10g，酵母膏0.4g，氯化钠0.2g，碳酸钙1.0g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.2g，蒸馏水1000ml，pH7.4-7.6。
[0030] 固氮培养基：磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钾0.8g，硫酸镁0.2g，硫酸钙0.1g，氯化铁 微量，钼酸钠 微量，酵母提取物0.5g，甘露醇20g，蒸馏水1000ml，pH7.2。
[0031] 无机盐培养基：氯化铵1.0g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.5g，蒸馏水1000ml，pH7.0。
[0032] 实施例1 寡养单胞菌ZBD-a-03-I CGMCC No.17102的分离
[0033] 取5g土样（采自甘肃省漳县）放入三角瓶中，加入50ml无菌水，封口后于摇床震荡20min制成混悬液，吸取5ml加入100ml固氮菌富集培养基中，28℃培养，72h后吸取5ml菌液加入100ml固氮菌富集培养基继续培养，重复培养三次后进行单菌落分离。分离采用平板划线法与梯度稀释法：平板划线法即用接种环蘸取菌液在阿须贝固体培养基上进行划线分离；梯度稀释法是将培养后的菌液按照10-2、10-4、10-6、10-8稀释度用无菌水制成菌悬液后，吸取0.1ml在阿须贝固体培养基上均匀涂布。涂布好的平板于28℃静置培养，5-7d后挑取单菌落用平板划线法进行菌种纯化。将分离纯化所得的其中一个菌株命名为ZBD-a-03-I。
[0034] 实施例2 寡养单胞菌ZBD-a-03-I CGMCC No.17102的鉴定。
[0035] 从以下三方面对分离纯化得到的ZBD-a-03-I菌株进行鉴定。
[0036] 一、形态学鉴定
[0037] 将实施例1分离得到的ZBD-a-03-I进行单菌落培养并观察菌落，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态（是否平坦、凸起、褶皱、凹陷等）、菌落边缘状态（是否整齐、不规则、放射状等）。通过生物染色剂染色后进行显微镜镜检。
[0038] 结果表明，分离纯化后得到的菌株ZBD-a-03-I菌落：菌落直径6-7mm，菌落颜色为浅黄色，菌落不透明，菌落表面湿润、微凸起，菌落边缘整齐。镜检结果为杆状，革兰氏阴性，有鞭毛，无芽孢。
[0039] 二、16s rDNA 序列同源性分离
[0040] 常规方法培养上述步骤分离纯化得到的菌株ZBD-a-03-I，提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，以细菌16s rDNA通用引物，27F ： 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3[0041] 1492R：5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3在PCR 扩增仪上进行PCR 反应。反应完成后，取2ulPCR 产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。确认PCR 扩增片段。PCR 产物用AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒回收，具体操作按试剂盒说明书进行。取各个菌种纯化后的PCR 产物，使用测序仪ABI3730-XL 进行DNA 测序。与NCBI GenBank 中的已知序列进行同源性比较后，判定细菌种类，将细菌划分到属或种。
[0042] PCR基因扩增得到菌株的16s rDNA基因片段约1.4kb，测定序列后与NCBI数据库中已公开的16s rDNA序列进行在线同源性比较，结果显示ZBD-a-03-I与寡养单胞菌（Stenotrophomonas.sp）的同源性最高，达到98%。
[0043] 三、生理生化特征分析
[0044] 所述菌株ZBD-a-03-I的生理生化特征测定结果如下：
[0045] 甲基红阴性，吲哚阴性，过氧化氢酶阳性，接触酶阳性, 氧化酶阴性, 硝酸盐还原阴性, 明胶水解阳性, 淀粉水解阴性，赖氨酸脱羧酶阳性，葡萄糖氧化发酵实验阳性。
[0046] 鉴于上述形态、16s rDNA序列同源性分析、生理生化特征分析结果，将实施例1中分离纯化得到的居住ZBD-a-03-I鉴定为细菌域寡养单胞菌（Stenotrophomonas.sp）。该寡养单胞菌（Stenotrophomonas.sp）ZBD-a-03-I已于2019年01月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称 CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏编号为CGMCC No.17102。
[0047] 实施例3寡养单胞菌ZBD-a-03-I CGMCC No.17102的固氮酶活性测试
[0048] 对实施例1分离纯化得到的寡养单胞菌ZBD-a-03-I CGMCC No.17102进行固氮酶活性测试，采用乙炔还原法，具体方法如下所述：制备获得ZBD-a-03-I菌株的悬浮液（细胞，1×108ml-1），取1ml接种于盛有5ml半固体阿须贝培养基的血清瓶中， 28℃下培养48h。将血清瓶瓶盖换成橡胶塞，并用无菌注射器抽出10%的气体，然后注入10%乙炔，再在28℃下培养
36h。用无菌注射器从血清瓶中抽取混合气体0.2ml注入气相色谱仪，测定乙烯生成量，根据以下公式计算固氮酶活性。N=hxCV/(24.9hst)。其中N为固氮酶活性，即产生乙炔的浓度（C2H2，nmol h-1 ml-1），hx为样品峰值，C为标准乙烯浓度（nmol ml-1），V为培养容器体积(ml)，24.9为常数，hs为标准乙烯峰值，t为样品培养时间(h)。以固氮培养基培养圆褐固氮菌1.178，以同样的方法测定其固氮酶活性作为参照。以上实验均设三组重复。
36h。用无菌注射器从血清瓶中抽取混合气体0.2ml注入气相色谱仪，测定乙烯生成量，根据以下公式计算固氮酶活性。N=hxCV/(24.9hst)。其中N为固氮酶活性，即产生乙炔的浓度（C2H2，nmol h-1 ml-1），hx为样品峰值，C为标准乙烯浓度（nmol ml-1），V为培养容器体积(ml)，24.9为常数，hs为标准乙烯峰值，t为样品培养时间(h)。以固氮培养基培养圆褐固氮菌1.178，以同样的方法测定其固氮酶活性作为参照。以上实验均设三组重复。
[0049] 结果显示，实施例1中分离纯化得到的寡养单胞菌ZBD-a-03-I CGMCC No.17102的固氮酶活性为177.5（C2H2，nmol h-1 ml-1），这一结果表明，本发明的寡养单胞菌ZBD-a-03-I CGMCC No.17102具有较高的固氮能力，在拌种剂、育苗接种剂、固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。
[0050] 实施例4寡养单胞菌ZBD-a-03-I CGMCC No.17102对白条党参浸出物的耐受性测试
[0051] 以从甘肃省漳县采得的白条党参（晾干）为样品，测定ZBD-a-03-I对其浸出物的耐受性。以样品白条党参中党参炔苷含量作为衡量白条党参中有效成分的指标。通过HPLC检测样品白条党参中党参炔苷含量为231.25ug/g，样品白条党参根系表面土壤中党参炔苷含量为1.375 ug/g。
[0052] 将样品白条党参粉碎后过80目筛，收集白条党参粉末。精确称取5g白条党参粉末，加入100ml双蒸水，煮沸30min后过滤，得到50ml白条党参浸出液，按照体积比5%、10%、15%、20%代替水添加入阿须贝培养基中，接入3%对数生长期ZBD-a-03-I菌液，28℃下培养72h后测定培养液中的活菌数量。以圆褐固氮菌1.178作为对照，以不加白条党参浸出液的阿须贝培养基作为空白。实验结果如下：
[0053] 浸出液添加量(%) 0 5 10 15 20白条党参含量(g/ml) 0 0.005 0.01 0.015 0.02
党参炔苷含量(ug/ml) 0 1.1563 2.3125 3.4688 4.6250
ZBD-a-03-I活菌数(个/ml) 3.6×109 4.1×109 3.9×109 8.9×108 7.0×106
1.178活菌数(个/ml) 4.9×109 5.9×107 7.3×105 4.1×106 3.5×106
党参炔苷含量(ug/ml) 0 1.1563 2.3125 3.4688 4.6250
ZBD-a-03-I活菌数(个/ml) 3.6×109 4.1×109 3.9×109 8.9×108 7.0×106
1.178活菌数(个/ml) 4.9×109 5.9×107 7.3×105 4.1×106 3.5×106
[0054] 实验结果表明，对照组圆褐固氮菌1.178在党参炔苷含量为1.16 ug/ml时，其活菌数量就已经下降了两个数量级，表明白条党参浸出液对1.178的生长产生了影响，虽未达到杀灭的程度，但仍具有一定抑制作用，而白条党参根际表面土壤中的党参炔苷含量为1.375 ug/g，高于实验组数值，进一步证明1.178在白条党参根际表面的定殖性差，无法正常生长代谢，因而无法发挥其固氮作用。寡养单胞菌ZBD-a-03-I对白条党参浸出液具有良好的耐受性，当培养基中党参炔苷含量达到3.47 ug/ml时，ZBD-a-03-I的活菌数量仍能达到8.9×8
10个/ml，证明ZBD-a-03-I在高浓度白条党参浸出液中仍能保持高活性，能继续发挥其代谢作用。ZBD-a-03-I对白条党参根际土壤具有良好的适应性和定殖性，在高浓度白条党参挥发物的土壤中仍能发挥高效的代谢作用，是种植白条党参的优选菌株。
10个/ml，证明ZBD-a-03-I在高浓度白条党参浸出液中仍能保持高活性，能继续发挥其代谢作用。ZBD-a-03-I对白条党参根际土壤具有良好的适应性和定殖性，在高浓度白条党参挥发物的土壤中仍能发挥高效的代谢作用，是种植白条党参的优选菌株。
[0055] 实施例5寡养单胞菌ZBD-a-03-I CGMCC No.17102对多菌灵的降解性测试[0056] 在无机盐培养基中添加多菌灵标准溶液，使其浓度分别为50、100、150、200、250、300 mg/L，调节pH值为7.0，以5% 的接种量接入对数期ZBD-a-03-I，于28 ℃、150 r/min的条件下振荡培养，每隔12 h 采用HPLC检测培养基中多菌灵的含量，并计算降解率，实验结果如下。
[0057]
[0058] 以上实验结果表明，ZBD-a-03-I对多菌灵具有明显的降解作用，当多菌灵浓度为200mg/L时，ZBD-a-03-I在72h对多菌灵的降解率达到84.33%，ZBD-a-03-I及其相关菌剂可作为土壤改良剂降解土壤中残留的多菌灵，修复被污染的土壤。
[0059] 实施例6寡养单胞菌ZBD-a-03-I CGMCC No.17102对联苯菊酯的降解性测试[0060] 在无机盐培养基中添加联苯菊酯标准溶液，使其浓度分别为50、100、150mg/L，调节pH值为7.0，以5% 的接种量接入对数期ZBD-a-03-I菌液，于28 ℃、150 r/min的条件下振荡培养，每隔24 h取样，即取1mL培养液依次用2、2、1 mL石油醚萃取3 次，收集的有机相经无水硫酸钠脱水后，过0.45μm滤膜于GC小瓶中，采用HPLC检测培养基中联苯菊酯的含量，并计算降解率，实验结果如下。
[0061]
[0062] 以上实验结果表明，ZBD-a-03-I对联苯菊酯具有明显的降解作用，当多菌灵浓度为200mg/L时，ZBD-a-03-I在72h对100mg/L的联苯菊酯的降解率为51.06%，降解效率高，可见 ZBD-a-03-I及其相关菌剂可作为土壤改良剂降解土壤中残留的联苯菊酯，修复被污染的土壤。