一种伏立康唑有关物质检测方法

摘要

本发明涉及检测方法领域，特别是涉及伏立康唑有关物质检测方法。它是采用高效色谱法进行检测的，其有机项为乙腈：甲醇的混合液，并采用梯度洗脱。该方法对各杂质的分离及响应良好，所需检测时间短，检测精度高。

权利要求

1.一种伏立康唑中有关物质检测方法，其特征在于，采用高效液相色谱进行检测，流动相包括流动相A与流动相B，其中流动相A为pH值为2.0 5.0的缓冲液，所述缓冲液选自乙酸~

铵缓冲液或甲酸铵缓冲液，流动相B按体积比计算为乙腈：甲醇=3 4:2v/v的混合液，以流动~

相A及流动相B对供试品溶液进行梯度洗脱；检测波长240 270nm，十八烷基硅烷键合硅胶为~

填充剂，其洗脱程序如下：

时间/min 流动相A/% 流动相B/%

0 63 37

3 63 37

30 25 75

35 25 75

37 63 37

45 63 37

；

所述的流动相流速为0.6～1.2ml/min；所述的色谱柱柱温为25 35℃；

~

所述的有关物质为4‑乙基‑5‑氟嘧啶、1‑(2,4‑二氟苯基)‑2‑(1H‑1,2,4‑三氮唑‑1‑基)乙酮、(2R,3R)‑2‑(2,4‑二氟苯基)‑3‑(5‑氟嘧啶‑4‑基)‑1‑1‑(1H‑1,2,4‑三氮唑‑1‑基)丁‑

2‑醇、(2RS,3SR)‑2‑(2,4‑二氟苯基)‑3‑(嘧啶‑4‑基)‑1‑(1H‑1,2,4‑三氮唑‑1‑基)丁‑2‑醇、4‑(1‑溴乙基)‑6‑氯‑5‑氟嘧啶、3‑(6‑氯‑5‑氟嘧啶‑4‑基)‑2‑(2,4‑二氟苯基)‑1‑(1H‑

1,2,4‑三氮唑‑1‑基)丁‑2‑醇盐酸盐、4‑氯‑6‑乙基‑5‑氟嘧啶。

2.根据权利要求1所述的一种伏立康唑中有关物质检测方法，其特征在于：流动相A为pH值为3.5 4.5。

~

3.根据权利要求1所述的一种伏立康唑中有关物质检测方法，其特征在于：所述缓冲液的浓度为0.015 0.025mol/L。

~

4.根据权利要求3所述的一种伏立康唑中有关物质检测方法，其特征在于：所述的缓冲液的浓度0.02mol/L。

5.根据权利要求1所述的一种伏立康唑中有关物质检测方法，其特征在于：所述的流动相B为按体积比计算，乙腈：甲醇=2:1的混合液。

6.根据权利要求1所述的一种伏立康唑有关物质检测方法，其特征在于：所述的检测波长为251～256nm。

7.根据权利要求1所述的一种伏立康唑有关物质检测方法，其特征在于：供试品溶液以稀释剂为溶剂，所述的稀释剂为按体积比计算，流动相A：流动相B=55:45的混合试剂。

8.根据权利要求1所述的一种伏立康唑有关物质检测方法，其特征在于：所述流动相的流速为1.0ml/min。

9.根据权利要求1所述的一种伏立康唑有关物质检测方法，其特征在于：所述的色谱柱柱温为25℃。

10.根据权利要求1所述的一种伏立康唑有关物质检测方法，其特征在于：所述色谱柱长度为250mm，内径为4.6mm，填料粒径为5μm。

说明书

一种伏立康唑有关物质检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及检测方法领域，特别是涉及从伏立康唑有关物质检测方法。

背景技术

[0002] 根据伏立康唑合成路线及清除工艺，可知本品可能产生的杂质主要有起始原料、降解杂质、对映异构体、中间体残留、工艺副产物、试剂残留。参考欧洲药典EP9.0伏立康唑
(FLKZ)有关物质项下杂质限度控制，并根据样品检测结果，暂定杂质控制限度见表1。

[0003] 表1 FLKZ研究杂质情况汇总

[0004]

[0005]

[0006] 但是现有的检测方法对伏立康唑中有关物质进行检测，FLKZ‑V5‑Z3与FLKZ‑SM2分离度较差，某些杂质无法检出，而且现有的检测方法杂质保留时间长、检测时间过长。

发明内容

[0007] 本发明的目的在于提供一种伏立康唑有关物质检测方法，可以有效迅速的检测出伏立康唑相关杂质。

[0008] 为实现本发明目的，采用的技术方案为，一种伏立康唑中有关物质检测方法，采用高效液相色谱进行检测，流动相包括流动相A与流动相B，其中流动相A为pH值为2.0～5.0的
缓冲液，进一步为3.5～4.5(例如3.5、4.0、4.5等)，流动相B为乙腈：甲醇＝3～4:2v/v的混
合液，以流动相A及流动相B对供试品溶液进行梯度洗脱；检测波长240～270nm，十八烷基硅
烷键合硅胶为填充剂，其洗脱程序如下：

[0009]

[0010]

[0011] 本发明检测波长按照HPLC常用规则选取即可，即一般是在待检样品的最大吸收波长或临近波长进行检测，当然，如果发现了溶剂或其他原因的干扰，可以适当选取其他吸收
波长。而检测波长的选取，可以通过将待检样品单独采用紫外分光光度法测定获得，也可以
直接通过二极管阵列(DAD)或类似的检测器在HPLC检测过程中查找获取，目前大多数检测
器均可实现全波段扫描，检测人员可以通过扫描所得图谱找到相应的检测波长。本发明中，
所述的检测波长在200nm～300nm范围内，在该波长范围内有吸收部分均可实现检测，考虑
到吸收稳定性，即细微的波长变化对峰面积影响，可以优先选择吸收变化较平滑的波长，从
而避免外标法中仪器波长变化导致按峰面积计算误差较大的问题。

[0012] 作为优选，洗脱程序如下：

[0013]

[0014] 所述缓冲液选自乙酸铵缓冲液或甲酸铵缓冲液；进一步地，所述缓冲液的浓度为0.015～0.025mol/L；更进一步地，所述的缓冲液中铵浓度0.02mol/L

[0015] 进一步，所述的流动相B为按体积计算，乙腈：甲醇＝2:1的混合液。

[0016] 本发明中，“v/v”指体积比。所述乙酸铵缓冲液中，采用乙酸调节pH；所述甲酸铵缓冲液中，采用甲酸调节pH。

[0017] 进一步，所述的检测波长为251～256nm。

[0018] 作为优选，所述的检测波长为256nm。

[0019] 进一步，所述的供试品溶液以稀释剂为溶剂，所述的稀释剂为按体积比，流动相A：流动相B＝55:45的混合试剂。

[0020] 流动相流速按照HPLC操作即可，流速可以根据色谱柱尺寸型号、色谱峰保留时间来进行适当的调整，如本发明所述流动相的流速就可以选自0.6ml/min～1.2ml/min；本发
明一个具体实施方式中所述流动相的流速为0.8ml/min。若色谱柱固定相填料粒径较小时，
应相应调整流动相流速，例如降低流速。

[0021] 作为优选，所述的流动相流速为1.0ml/min。

[0022] 产品用稀释剂稀释成每1mg/ml的溶液，作为供试品溶液。

[0023] 取供试品溶液用稀释剂稀释成0.85～1.2μg/ml的溶液，作为对照溶液。例如：取供试品溶液用稀释剂稀释成1μg/ml的溶液，作为对照溶液。

[0024] 产品用稀释剂稀释成每0.5mg/ml的溶液，于100℃水浴放置40分钟，冷却至室温，作为系统适用性溶液。

[0025] 进一步，所述的色谱柱柱温为20～40℃。本发明具体实施方式中，所述的色谱柱柱温为25～35℃，可以进一步选自25℃。

[0026] 进一步，所述色谱柱长度为250mm，内径为4.6mm，填料粒径为5μm。

[0027] 进一步，所述的色谱柱采用Phenomenex Gemini C18色谱柱或效能相当色谱柱。

[0028] 综合以上筛选结果，FLKZ有关物质分析方法如下。

[0029] 取本品适量，精密称定，用稀释剂[流动相A‑流动相B(55:45)]溶解并稀释成每1ml溶剂约含1mg物质的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，用上述稀释剂稀释制成每1ml中
约含1μg的溶液，作为对照溶液；取本品适量，精密称定，用上述稀释剂溶解并稀释成每1ml
约含0.5mg的溶液，于100℃水浴放置40分钟，冷却至室温，作为系统适用性溶液。用高效液
相色谱法试验，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Phenomenex Gemini C18，4.6mm×
250mm，5μm或效能相当的色谱柱)，以0.02mol/L乙酸铵缓冲液(用乙酸调节pH值至4.0)为流
动相A，以乙腈‑甲醇(2:1)为流动相B，按下表进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；检测波长
256nm；柱温25℃。精密量取系统适用性溶液20μl注入液相色谱仪，记录色谱图，出峰顺序依
次为杂质FLKZ‑V5‑Z3、FLKZ‑SM2和伏立康唑，杂质FLKZ‑V5‑Z3和FLKZ‑SM2峰之间分离度应
符合要求。精密量取对照溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。供试品
溶液色谱图中如有杂质峰，杂质FLKZ‑V5‑Z3和杂质FLKZ‑SM2校正后的峰面积均不得大于对
照溶液主峰面积的1.5倍(0.15％)；如有与FLKZ‑V7‑Z2(相对保留时间约为0.7)保留时间一
致的色谱峰，其校正后的峰面积不得大于对照溶液主峰面积(0.1％)；如有与FLKZ‑Z1(相对
保留时间约为0.8)保留时间一致的色谱峰，其校正后的峰面积不得大于对照溶液主峰面积
(0.1％)；其他单个未知杂质的峰面积不得大于对照溶液主峰面积(0.10％)，杂质总和(包
括右旋异构体和樟脑磺酸)不得过0.5％。供试品溶液色谱图中任何小于对照溶液主峰面积
0.2倍(0.02％)的色谱峰可忽略不计。

[0030] 时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)0 63 37
3 63 37
30 25 75
35 25 75
37 63 37
45 63 37

[0031] 如果对有关物质含量进行计算，可以采用高效液相色谱法(HPLC)中的测定方式，如外标法、内标法、面积归一法等。在实际操作过程中，可以根据具体需求选择不同的方式。
在本发明上述条件已经可以将伏立康唑与各有关物质有效分离的情况下，对外标法、内标
法、面积归一法、自身对照法等含量测定方式的选择，可以是任意的。当然，如果采用内标
法，还需要找到不干扰各杂质吸收峰的内标物。在流动相、固定相等色谱条件确定的情况
下，内标物的选择需要进行有限次筛选获得。

[0032] 基于上述技术方案和效果，同样可以提供一种伏立康唑的检测方法，采用高效液相色谱进行检测，流动相包括流动相A与流动相B，其中流动相A为pH值为3.5～4.5的缓冲
液，进一步为4.0，流动相B为乙腈：甲醇＝3～4:2v/v的混合液，以流动相A及流动相B对供试
品溶液进行梯度洗脱；检测波长240～270nm，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其洗脱程序
如下：

[0033]

[0034] 采用该技术方案，可以将伏立康唑与其有关物质全部分离，分离度良好，峰型理想，分离效率高，同样适用于对伏立康唑产品中伏立康唑的定性或/和定量检测，有关物质
最终保留时间控制在28min以内，检测效率大幅提高。

附图说明

[0035] 图1是对比例1检测所得混合杂质图谱；

[0036] 图2是对比例2检测所得混合杂质图谱；

[0037] 图3是实施例1检测所得混合杂质图谱；

[0038] 图4为实施例2中不同流动相比例1混合杂质图谱；

[0039] 图5为实施例3中不同流动相比例2混合杂质图谱；

[0040] 图6是实施例4中不同柱温混合杂质图谱叠图；

[0041] 图7为实施例5中Inertsil‑ODS‑3色谱柱混合杂质图谱；

[0042] 图8为实施例5中SHISEIDO CAPCELL PAK C18色谱柱混合杂质图谱；

[0043] 图9为实施例5中Phenomenex Gemini C18色谱柱混合杂质图谱。

具体实施方式

[0044] 下面通过具体的实施例并结合附图对本发明做进一步的详细描述。

[0045] 对比例1：取每1ml约含FLKZ‑V5‑Z3、FLKZ‑V7‑Z2、FLKZ‑SM2、FLKZ‑Z1、FLKZ‑SM1、FLKZ‑V4、FLKZ‑V5各约0.5μg和FLKZ约1mg的混合溶液，参照EP9.0色谱条件进样检测。结果
见图1及表2。

[0046] EP9.0色谱条件

[0047]仪器 Agilent 1260
色谱柱 Inertsil ODS‑3(250×4.6mm，5μm)
流动相 1.9g/L甲酸铵溶液(pH4.0)：乙腈：甲醇(55:15:30)
检测波长 256nm
流速 1.0ml/min
柱温 35℃
洗脱程序 等度洗脱

[0048] 表2 EP9.0色谱条件混合杂质结果

[0049]

[0050]

[0051] 由以上表和图1可见，在此色谱条件下FLKZ主要降解杂质FLKZ‑SM2与FLKZ‑V5‑Z3分离度较差；检测时间过长，主峰出峰时间约35min，等度洗脱应运行约90min(3倍主峰出峰
时间)；杂质FLKZ‑V5未出峰。

[0052] 对比例2：取每1ml约含FLKZ‑V5‑Z3、FLKZ‑V7‑Z2、FLKZ‑SM2、FLKZ‑Z1、FLKZ‑SM1、FLKZ‑V4、FLKZ‑V5各约1μg和FLKZ约1mg的混合溶液。参照中国药典2015版同品种有关物质
色谱条件进样检测。结果见图2及表3。

[0053] 中国药典2015版色谱条件

[0054]仪器 Agilent 1260
色谱柱 Inertsil ODS‑3(250×4.6mm，5μm)
流动相 0.02mol/L乙酸铵溶液(pH4.0)：乙腈：甲醇(55:30:15)
检测波长 251nm
流速 1.0ml/min
柱温 35℃
洗脱程序 等度洗脱

[0055] 表3中国药典2015版色谱条件混合杂质结果

[0056] 名称 保留时间(min) 分离度FLKZ‑SM2 6.157 /
FLKZ‑V5‑Z3 6.496 1.60
FLKZ‑V7‑Z2 10.454 13.70
FLKZ‑Z1 11.973 3.89
FLKZ‑SM1 17.060 10.87
FLKZ 19.623 4.37
FLKZ‑V4 33.012 16.06
FLKZ‑V5 50.837 13.57

[0057] 由以上表与图2可见，在此色谱条件下FLKZ主要降解杂质FLKZ‑SM2与FLKZ‑V5‑Z3分离度较差；检测时间较长，主峰出峰时间约20min，等度洗脱应运行约60min。

[0058] 实施例1：取每1ml约含FLKZ‑V5‑Z3、FLKZ‑V7‑Z2、FLKZ‑SM2、FLKZ‑Z1、FLKZ‑SM1、FLKZ‑V4、FLKZ‑V5各约0.5μg和FLKZ约1mg的混合溶液。采用高效液相色谱法进行检测，结果
见图3与表4。

[0059] 色谱条件

[0060]

[0061] 表4混合杂质结果

[0062]名称 保留时间(min) 分离度
FLKZ‑V5‑Z3 6.942 ‑
FLKZ‑SM2 8.076 4.96
FLKZ‑V7‑Z2 12.989 19.46
FLKZ‑Z1 14.428 5.37
FLKZ‑SM1 15.766 4.65
FLKZ 18.524 9.16
FLKZ‑V4 22.558 12.99
FLKZ‑V5 25.693 10.11

[0063] 由表4与图3可见各杂质的分离及响应良好，所需检测为45分钟，时间短，检测精度高。

[0064] 实施例2：取每1ml约含FLKZ‑V5‑Z3、FLKZ‑V7‑Z2、FLKZ‑SM2、FLKZ‑Z1、FLKZ‑SM1、FLKZ‑V4、FLKZ‑V5各约0.5μg和FLKZ约1mg的混合溶液，采用高效液相色谱法进行检测，结果
见图4与表5：

[0065] 色谱条件‑不同流动相比例1

[0066]

[0067] 表5混合杂质结果

[0068]名称 保留时间(min) 分离度
FLKZ‑V5‑Z3 7.656 ‑
FLKZ‑SM2 8.112 2.1
FLKZ‑V7‑Z2 12.650 19.3
FLKZ‑Z1 13.768 4.4
FLKZ‑SM1 16.261 9.5
FLKZ 17.877 5.9
FLKZ‑V4 23.628 19.9
FLKZ‑V5 25.108 5.0

[0069] 由表5与图4可见各杂质之间的分离及响应良好，但是该条件下检测到的未知杂质减少了1个，疑似杂质FLKZ‑V4峰与相邻未知杂质峰重合。

[0070] 实施例3:取每1ml约含FLKZ‑V5‑Z3、FLKZ‑V7‑Z2、FLKZ‑SM2、FLKZ‑Z1、FLKZ‑SM1、FLKZ‑V4、FLKZ‑V5各约0.5μg和FLKZ约1mg的混合溶液，采用高效液相色谱法进行检测，结果
见图5与表6。

[0071] 色谱条件‑不同流动相比例1

[0072]

[0073] 表6混合杂质结果

[0074]名称 保留时间(min) 分离度
FLKZ‑V5‑Z3 7.745 ‑
FLKZ‑SM2 8.239 2.3
FLKZ‑V7‑Z2 13.013 19.8
FLKZ‑Z1 14.214 4.5
FLKZ‑SM1 16.943 9.9
FLKZ 18.670 6.0
FLKZ‑V4 25.098 21.2
FLKZ‑V5 26.755 5.3

[0075] 由表6与图5可见各杂质之间的分离及响应良好，但杂质FLKZ‑V4峰与相邻未知杂质峰分离良好，但杂质FLKZ‑V5‑Z3与杂质FLKZ‑SM2两峰分离效果较实施例1中稍差。实施例
4：取每1ml约含FLKZ‑V5‑Z3、FLKZ‑V7‑Z2、FLKZ‑SM2、FLKZ‑Z1、FLKZ‑SM1、FLKZ‑V4、FLKZ‑V5
各约0.5μg和FLKZ约1mg的混合溶液，以实施例1的所述的条件分别在柱温25℃、30℃、35℃
条件下检测。结果见图6及表7。

[0076] 表7不同柱温筛选结果

[0077]

[0078] 由以上结果可见，柱温在25℃是主要降解杂质FLKZ‑V5‑Z3与FLKZ‑SM2分离度最佳，柱温选择为25℃。

[0079] 实施例5：采用实施例1所述的色谱条件，色谱柱柱温在25℃条下，取每1ml约含FLKZ‑V5‑Z3、FLKZ‑V7‑Z2、FLKZ‑SM2、FLKZ‑Z1、FLKZ‑SM1、FLKZ‑V4、FLKZ‑V5各约0.5μg和
FLKZ约1mg的混合溶液，分别选用3种不同品牌色谱柱检测。结果见图7～图9及表8。

[0080] 表8不同色谱柱筛选结果

[0081]

[0082]

[0083] 由以上结果可见，以上三款色谱柱各杂质均能较好的分离。其中以Phenomenex Gemini C18色谱柱进行检测时，降解杂质FLKZ‑V5‑Z3与FLKZ‑SM2分离度较好，杂质FLKZ‑
SM1与主峰分离度最好并且主峰出峰时间最快。

[0084] 实施例6：FLKZ在溶液状态下易降解生成杂质FLKZ‑V5‑Z3与FLKZ‑SM2，故将FLKZ分别以溶剂A(流动相A‑流动相B 55:45)、溶剂B(50％乙腈)、溶剂C(50％甲醇)配置成1mg/ml
溶液。采用实施例1的条件，在25℃柱温，Phenomenex Gemini C18色谱柱色谱进行分析。分
别在配置后不同时间内进样，考察不同溶剂中稳定性情况。结果见表9。

[0085] 表9不同溶剂筛选结果

[0086]

[0087] 由以上结果可见，不同溶剂对于FLKZ样品溶液稳定性情况无显著影响，因此，选择与流动相成分和比例相近的溶剂A(流动相A‑流动相B 55:45)作为样品溶剂。

[0088] 实施例7：方法验证，通过对本申请所述的方法进行验证，得到如下结论。

[0089] 表10 FLKZ有关物质方法的验证总结

[0090]

[0091]

[0092]

[0093] 综上，本方法选用高效液相色谱法检测伏立康唑有关物质。在初步筛选检测色谱条件的基础上采用加校正因子的自身对照法进行定量。结果表明，该方法的系统适用性和
专属性、降解专属性、检测限和定量限、线性和范围、精密度、准确度和方法的耐用性均符合
要求，证明该方法适合FLKZ有关物质的检测。其中，空白溶液：稀释剂。

[0094] 系统适用性溶液：取供试品适量，加稀释剂溶解并稀释成每1ml约含0.5mg的溶液，于100℃水浴放置40分钟，冷却至室温作为系统适用性溶液。

[0095] 混合对照品溶液：分别精密称取杂质FLKZ‑V5‑Z3、FLKZ‑SM2、FLKZ‑V7‑Z2、FLKZ‑Z1对照品和FLKZ对照品适量，用稀释剂溶解并稀释成每1ml含FLKZ约1mg，杂质FLKZ‑V5‑Z3与
杂质FLKZ‑SM2约1.5μg，杂质FLKZ‑V7‑Z2与杂质FLKZ‑Z1约1.0μg的混合溶液。

[0096] 供试品溶液：取FLKZ供试品适量，精密称定，用稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含1mg的溶液。自身对照溶液：精密移取供试品溶液适量，用稀释剂稀释成每1ml中约含1μg
的溶液作为自身对照溶液。加标供试品溶液：分别精密称取杂质FLKZ‑V5‑Z3、FLKZ‑SM2、
FLKZ‑V7‑Z2、FLKZ‑Z1、FLKZ‑SM1、FLKZ‑V4、FLKZ‑V5对照品和供试品适量，用稀释剂溶解并
稀释成每1ml含供试品约1mg，杂质FLKZ‑V5‑Z3与杂质FLKZ‑SM2约1.5μg，杂质FLKZ‑V7‑Z2与
杂质FLKZ‑Z1约1.0μg，杂质FLKZ‑SM1、FLKZ‑V4和FLKZ‑V5约0.5μg的混合溶液。

[0097] 各个杂质定位溶液：精密称取杂质FLKZ‑V5‑Z3、FLKZ‑SM2对照品各适量，分别用稀释剂稀释成每1ml约含15μg的溶液，精密称取杂质FLKZ‑V7‑Z2、FLKZ‑Z1、FLKZ‑SM1、FLKZ‑V4
和FLKZ‑V5对照品各适量，分别用溶剂稀释成每1ml约含10μg的溶液即得。

[0098] 以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领
域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。