一种高产苏氨酸的基因工程菌及其应用方法

摘要

本发明公开了一种高产苏氨酸的基因工程菌及其应用方法，属于基因工程和发酵工程领域。所述基因工程菌为TWF001/pFW01‑phaCAB，在三氯生表达质粒pFW01上过表达了phaCAB，可以在胞外合成苏氨酸，胞内合成PHB。本发明构建的菌株苏氨酸合成量大大提高，在摇瓶发酵水平产量为17.0g/L，在3‑L罐发酵水平，合成苏氨酸产量为96.4g/L，在10L罐发酵水平，合成苏氨酸产量为133.5g/L。所述基因工程菌为TWF001/pFW01‑phaCAB生长状况良好，未引入外源抗性基因序列，更有利于大规模工业化生产。

权利要求

1.一株基因工程菌，其特征在于，是过表达了来自罗氏真养菌的phaCAB基因簇的大肠杆菌，可联产L-苏氨酸和β-聚3-羟基丁酸酯；所述基因工程菌以大肠杆菌TWF001为宿主，以pFW01为表达载体，过表达了序列如GenBank登录号MH558939.1的phaCAB基因簇。

2.一种构建权利要求1所述基因工程菌的方法，其特征在于，将如GenBank登录号MH558939.1的phaCAB基因簇与表达载体pFW01连接，转化至大肠杆菌TWF001中。

3.一种联产L-苏氨酸和β-聚3-羟基丁酸酯的方法，其特征在于，应用权利要求2所述的基因工程菌进行发酵。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将所述基因工程菌接种至发酵培养基中，

35～37℃，180～220rpm发酵至少24h。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，发酵过程控制溶氧为30％，pH 6.8。

6.根据权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于，所述发酵过程中还进行补料；所述补料是当发酵体系残糖低于5g/L时则补加葡萄糖溶液至残糖达10g/L。

7.权利要求1所述基因工程菌在生产含L-苏氨酸和/或β-聚3-羟基丁酸酯及其衍生物方面的应用。

说明书

一种高产苏氨酸的基因工程菌及其应用方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种高产苏氨酸的基因工程菌及其应用方法，属于基因工程和发酵工程领域。技术背景

[0002] 作为8种必需氨基酸之一，L-苏氨酸是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸。以添加了苏氨酸的低蛋白配方饲料作为家禽日粮，不但降低了饲喂成本，还有利于家禽吸收，可促进家禽的生长。除了可以缓解天然蛋白质的匮乏，家禽饲料营养配比合理还可以有效减少动物氨的排放，从而减少环境污染，有利于社会的可持续发展。此外，L-苏氨酸在食品、医药和化妆品等领域的用量也呈长期稳定增长趋势。在食品领域，L-苏氨酸是各类氨基酸保健饮品的配方成分，也是重要的食品强化剂，可以与其他氨基酸共用起到抗氧化的作用，还可以与葡萄糖共热产生焦香味。在医药领域，L-苏氨酸有促进人体生长发育、促进骨髓T淋巴细胞前体分化发育成为成熟T淋巴细胞和抗脂肪肝的药用疗效，因此在临床方面有着广泛的应用。此外，L-苏氨酸还是制造高效低过敏的抗生素单酰胺菌素等药物的中间体。在化妆品领域，L-苏氨酸的分子具有羟基结构，因此可用作保湿剂。

[0003] 苏氨酸的工业生产方法主要有蛋白水解、化学合成和微生物发酵。相对于前两种方法，发酵法优点是原料便宜、反应条件温和、环境污染小、效率高等。大肠杆菌由于其遗传背景清楚，基因操作简单，发酵周期短等优点，在工业生产饲料添加级苏氨酸中占主要地位。

[0004] 由于目前苏氨酸生产高产菌是大肠杆菌，大肠杆菌虽生长迅速发酵周期短，但是转化率也并不高。该工业化生产的出发菌株，目前利用葡萄糖生产苏氨酸经济效益最好，但是转化率低，摇瓶作为对照时，转化率为40％。

发明内容

[0005] 本发明目的在于提高该菌株的产量和转化率，并建立一种在大肠杆菌里高产苏氨酸的方法，同时这种方法可以运用到不同的产品生产。

[0006] 本发明第一个目的是提供一株高产苏氨酸的基因工程菌，所述菌株以具有苏氨酸生产能力的菌株为出发菌株，过表达了来自罗氏真养菌基因组的phaCAB基因簇。

[0007] 在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌TWF001为出发菌株，以质粒pFW01为表达质粒；所述TWF001和pFW01公开于2018年的论文《Increasing l-threonine production in Escherichia coli by engineering the glyoxylate shunt and the l-threonine biosynthesis pathway》。

[0008] 在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是在大肠杆菌TWF001中，过表达了来自罗氏真养菌基因组的phaCAB基因簇，该基因簇如GenBank登录号MH558939.1所示核苷酸序列。

[0009] 在本发明的一种实施方法中，基因phaA、phaB和phaC分别编码的β-酮硫解酶，乙酰乙酰辅酶A还原酶和PHB合成酶，在大肠杆菌中可以以乙酰辅酶A为底物合成β-聚3-羟基丁酸酯(PHB)。

[0010] 本发明的第二个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，是将所述phaCAB基因簇与表达载体连接，在大肠杆菌宿主细胞中表达。

[0011] 在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pFW01。

[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞是大肠杆菌TWF001。

[0013] 本发明的第三个目的是提供一种联产L-苏氨酸和β-聚3-羟基丁酸酯的方法，应用所述基因工程菌进行发酵。

[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵是将所述基因工程菌接种至发酵培养基中，35～37℃，180～220rpm发酵至少24h。

[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵过程控制溶氧为30％，pH 6.8。

[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌经过两级种子培养。

[0017] 在本发明的一种实施方式中，第一级种子培养基为LB培养基，第二级种子培养基含有32.5g/L葡萄糖,5g/L(NH4)2SO4,15g/L酵母浸提物,9.5g/L KH2PO4,24.35g/L K2HPO4,1g/LMgSO4·7H2O,pH 7.0。

[0018] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵过程中还进行补料。

[0019] 在本发明的一种实施方式中，所述补料是当发酵体系残糖低于5g/L时则补加葡萄糖溶液至残糖达10g/L。

[0020] 本发明还要求保护所述基因工程菌在生产含L-苏氨酸和/或β-聚3-羟基丁酸酯及其衍生物方面的应用。

[0021] 本发明的效果：

[0022] (1)本发明构建的一株高产苏氨酸的菌株E.coli TWF001/pFW01-phaCAB，遗传性能非常稳定，应用时无需添加抗生素，只需要添加终浓度为1μM的三氯生即可保证质粒稳定遗传，适合工业化生产。

[0023] (2)在工业化生产苏氨酸的菌株里面，过表达了来自罗氏真养菌基因组的phaCAB基因簇，通过联产β-聚3-羟基丁酸酯(PHB)的方法，能有效提高苏氨酸产量。应用本发明的方法构建的菌株TWF001/pFW01-phaCAB的苏氨酸产量在10-L发酵罐水平达到133.5g/L，与对照菌株TWF001/pFW01相比提高了41.6％，转化率对应也提高了31.6％；在3-L发酵罐水平达到96.4g/L，与对照菌株TWF001/pFW01相比提高了31.7％，转化率对应也提高了31.7％；在摇瓶发酵水平达到17.0g/L，与对照菌株TWF001/pFW01相比提高了74.9％，转化率对应也提高了72.7％；该方法核心思想是通过联产PHB，拉动胞内碳源代谢，增加乙酰辅酶A合成量，减少副产物乙酸的合成，增强细胞的代谢平衡，并通过乙醛酸循环快速利用乙酰辅酶A。

[0024] (3)本发明的方法——通过偶联PHB和苏氨酸合成，能够有效提高苏氨酸产量，同时也适用于通过联产PHB的途径生产其他天冬氨酸族氨基酸，比如将苏氨酸合成基因改变为赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸等途径的基因生产相应氨基酸；

附图说明

[0025] 图1：重组质粒pFW01-phaCAB示意图。

[0026] 图2：对照菌株TWF001/pFW01和基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB苏氨酸高产菌株的摇瓶发酵情况；其中，A为菌株生长，B为菌株发酵的耗糖情况，C为苏氨酸产量，D为发酵36h后的乙酸合成量。

[0027] 图3：对照菌株TWF001/pFW01和基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB苏氨酸高产菌株的摇瓶发酵合成PHB的情况；其中，A为TWF001/pFW01-phaCAB合成PHB颗粒的激光共聚焦观察照片，B为对照菌TWF001/pFW01的激光共聚焦观察照片，C为PHB合成量。

[0028] 图4：对照菌株TWF001/pFW01和基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB苏氨酸高产菌株的摇瓶发酵对数期合成乙酰辅酶A和苹果酸的情况。

[0029] 图5：对照菌株TWF001/pFW01和基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB苏氨酸高产菌株的发酵情况；其中，A为菌株生长情况，B为菌株耗糖情况，C为菌株发酵的苏氨酸产量。

[0030] 图6：对照菌株TWF001/pFW01和基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB苏氨酸高产菌株的10-L罐发酵情况；其中，A为菌株生长情况，B为菌株发酵的苏氨酸产量。

具体实施方式

[0031] 实施例1重组菌TWF001/pFW01-phaCAB的构建

[0032] (1)以罗氏真养菌基因组NC_008313.1为模板，采用引物phaCAB-F/phaCAB-R扩增phaCAB基因簇，扩增phaCAB基因簇的引物phaCAB-F/phaCAB-R序列为

[0033] phaCAB-F：5’-CTGCTCGAGAGAAGGAGAATCAAATCATGGCTACCGG-3’

[0034] phaCAB-R：5’-CCGGAATTCAGGTCAGCCCATATGCAGG-3’

[0035] (2)用限制性内切酶XhoI和EcoRI消化PCR产物，载体pFW01(载体pFW01的构建方法参见文章《Increasing l-threonine production in Escherichia coli by engineering the glyoxylate shunt and the l-threonine biosynthesis pathway》)用EcoRI和XhoI消化处理，酶切产物纯化后，使用T4连接酶22℃过夜处理，转化至大肠杆菌DH5α，筛选正确转化子，对于得到的正确转化子，提取质粒后用1.8kV，5ms电转化入谷氨酸棒杆菌WM001感受态，再次筛选正确的基因工程重组菌TWF001/pFW01-phaCAB转化子。

[0036] (3)提取pFW01质粒后直接电转化入TWF001，获得正确转化子，命名为TWF001/pFW01，作为无异源表达phaCAB基因的空载质粒对照菌株。

[0037] 实施例2应用大肠杆菌基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB摇瓶发酵生产PHB和L-苏氨酸(1)重组基因工程菌的摇瓶发酵

[0038] 种子培养基I：LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl；

[0039] 摇瓶发酵培养基I：30g/L葡萄糖、25g/L(NH4)2SO4、7.5g/L KH2PO4、2g/L酵母提取物、2g/L柠檬酸、1g/L MgSO4·7H2O、5mg/L FeSO4·7H2O、5mg/L MnSO4·4H2O、20g/L CaCO3，pH 6.8或pH 7.0；

[0040] 培养方法：37℃，200rpm，培养36h。

[0041] 发酵结束后，pH6.8条件下，苏氨酸合成量更多，基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB合成苏氨酸17.0g/L，葡萄糖转化系数为0.57g/g，乙酸合成2.83g/L；而对照菌TWF001/pFW01合成9.72g/L苏氨酸，葡萄糖转化系数为0.33g/g，乙酸合呈7.65g/L。

[0042] (2)重组基因工程菌的3-L罐发酵

[0043] 一级种子培养基I：LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl；

[0044] 二级种子培养基II：32.5g/L葡萄糖,5g/L(NH4)2SO4,15g/L酵母浸提物,9.5g/L KH2PO4,24.35g/L K2HPO4,1g/L MgSO4·7H2O,pH 7.0.

[0045] 发酵培养基II：20g/L葡萄糖,3g/L酵母浸提物,2g/L KH2PO4,10g/L(NH4)2SO4,0.5g/LMgSO4·7H2O,5mg/L FeSO4·7H2O,5mg/L MnSO4·4H2O；

[0046] 补料分批发酵条件：将甘油管中的菌体在LB平板上活化，然后接种到含有25mL种子培养基的250mL摇瓶培养4h，接着按初始OD＝0.2接种到两瓶含有50mL种子培养基的500mL摇瓶，37℃、200rpm培养4h，接着把两瓶种子液转入含有1.1L的3-L罐中，溶氧控制在
30％，pH控制在6.8，当体系残糖低于5g/L时则补加700g/L葡萄糖溶液至残糖约为10g/L，通气量为1.5L/min，发酵36h。

[0047] 发酵结束后，基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB合成苏氨酸96.4g/L，葡萄糖转化系数为0.54g/g，而对照菌TWF001/pFW01合成73.2g/L苏氨酸，葡萄糖转化系数为0.41g/g。

[0048] (3)重组基因工程菌的10-L罐发酵

[0049] 一级种子培养基III：1.2g/L蔗糖,10g/L胰蛋白胨,8g/L酵母浸提物,4g/L(NH4)2SO4,3g/L K2HPO4,0.4g/L MgSO4,0.01g/L FeSO4，0.01g/L MnSO4,5g/L谷氨酸钠,0.2g/L蛋氨酸,pH 7.0.；

[0050] 二级种子培养基IV：30g/L葡萄糖,2.86g/L酵母浸提物,5.7g/L玉米糖浆,2.86g/LK2HPO4,0.57g/L MgSO4,4.29g/L氨基酸混合物(包括0.026g/g天冬氨酸,0.034g/g谷氨酸,0.025g/g丝氨酸,0.018g/g甘氨酸,0.014g/g苏氨酸,0.010g/g精氨酸,0.014g/g丙氨酸,
0.0032色氨酸,0.0039g/g半胱氨酸,0.021g/g甲硫氨酸,0.011g/g苯丙氨酸,0.011g/g异亮氨酸,0.0088g/g亮氨酸,0.0041g/g赖氨酸),1mg/L维生素B1,0.1mg/L ATP,pH 7.0.[0051] 发酵培养基III：25g/L葡萄糖,3.2g/L玉米糖浆,0.63g/L盐酸甜菜碱,0.39g/L MgSO4,0.85g/L KCl,10mg/L FeSO4,10mg/L MnSO4,0.84g/L H3PO4,1.05g/L氨基酸混合物(包括0.026g/g天冬氨酸,0.034g/g谷氨酸,0.025g/g丝氨酸,0.018g/g甘氨酸,0.014g/g苏氨酸,0.010g/g精氨酸,0.014g/g丙氨酸,0.0032色氨酸,0.0039g/g半胱氨酸,0.021g/g甲硫氨酸,0.011g/g苯丙氨酸,0.011g/g异亮氨酸,0.0088g/g亮氨酸,0.0041g/g赖氨酸),
24mg/L消泡油,pH 6.8；

[0052] 补料分批发酵条件：将甘油管中的菌体在LB平板上活化16h，然后接种到含有100mL种子培养基的500mL摇瓶培养4h，接着将种子液按照初始OD600＝0.1转接到两瓶含有
500mL种子培养基的2L摇瓶，37℃、200rpm培养4h，接着把两瓶种子液转入含有4L的10-L罐中，溶氧控制在30％，pH控制在6.8-6.9，当溶氧过高和体系残糖低于5g/L时则补加700g/L葡萄糖溶液至残糖为10g/L以上，发酵36h。

[0053] 发酵结束后，基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB合成苏氨酸133.5g/L，葡萄糖转化系数为0.50g/g，而对照菌TWF001/pFW01合成94.3g/L苏氨酸，葡萄糖转化系数为0.38g/g。

[0054] (4)实施例2中的基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB和TWF001/pFW01胞内PHB的酯化：将所得发酵液中的菌体离心后，用pH 7.0的磷酸盐缓冲液洗涤两次，在真空冷冻干燥机中过夜冻干，称取20mg左右(质量记为Wt)的干菌体，加入到酯化管中，再加入2mL氯仿和2mL甲醇溶液，其中甲醇溶液是在甲醇中加入了3％的浓硫酸，将酯化管置于100℃的水浴锅中，酯化6小时，置于室温下半个小时，加入1mL水，充分震荡后分层，吸取下相；

[0055] (3)标样PHB的酯化：称取约5mg的PHB标样(质量分别记为WtB)加入酯化管中进行酯化，之后步骤同上述(2)；

[0056] (4)胞内PHB产量计算

[0057] 得出基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB的酯化产物有一个特征峰，记为A，其面积记为As，对应标样PHB也有同样出峰时间的特征峰，标样特征峰面积记为A0s；那么所合成的PHB占细胞干重比为Wt％＝(As/A0s*WtBV)/Wt。

[0058] 摇瓶发酵36h后，基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB合成PHB占细胞干重12.2％，而对照菌TWF001/pFW01不合成PHB；3-L罐发酵36h后，基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB合成PHB占细胞干重11.5％，而对照菌TWF001/pFW01不合成PHB；10-L罐发酵36h后，基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB合成PHB占细胞干重13.0％，而对照菌TWF001/pFW01不合成PHB。

[0059] 实施例4

[0060] (1)重组菌TWF001/pFW01-phaCAB和TWF001/pFW01的胞内乙酰辅酶A的测定[0061] 收集2mL实施例2中步骤(1)制备的OD600＝9.0左右的发酵菌液，置于冰上，并采用试剂盒Acetyl-CoA Assay Kit(Solarbio,Beijing,China)进行乙酰辅酶A提取及测定，在340nm测定光吸收值,乙酰辅酶A的合成量通过公式Acetyl-CoA (nmol/g wetcell)＝(1640*ΔA+0.012)/(OD600*1.7*0.002)；ΔA＝A80s-A20s计算获得，其中A80s为加入工作液后的80s的OD340nm，其中A20s为加入工作液后的20s的OD340n。

[0062] 基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB每克湿细胞合成乙酰辅酶A量为4.51μmol/g，而对照菌TWF001/pFW01每克湿细胞合成乙酰辅酶A量为1.43μmol/g；

[0063] (2)重组菌TWF001/pFW01-phaCAB和TWF001/pFW01的胞内苹果酸的测定[0064] 参照实施例4(1)中方法收集菌体，用冰水洗涤2次，采用1mL去离子水重悬并进行超声破碎10min，超声2s，停歇3s，工作效率为17％，然后离心10min，收集上清，进行高效液相测定，柱子采用Diamonsil  C18column(5μm,250mm×4.6mm  No.99603)(DiKMAtechnology,Beijing,China)。

[0065] 基因工程菌TWF001/pFW01-phaCAB每克湿细胞合成苹果酸量为0.32μmol/g，而对照菌TWF001/pFW01每克湿细胞合成苹果酸量为0.22μmol/g。

[0066] 虽然本发明以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。