一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用，其包含：采用SEQID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的核酸分子或者与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的猪伪狂犬病毒相关蛋白。该疫苗使用真核表达，产品的抗原性、免疫原性与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，保护效果好，对动物没有致病性，并且本发明的疫苗可以通过生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，同时大大降低了疫苗生产成本。

权利要求

1.一种免疫组合物，其特征在于，包含：

采用序列如SEQ ID NO:1所示的核酸分子编码的猪伪狂犬病毒gB蛋白；

采用序列如SEQ ID NO:3所示的核酸分子编码的猪伪狂犬病毒gC蛋白；

采用序列如SEQ ID NO:5所示的核酸分子编码的猪伪狂犬病毒gD蛋白；

采用序列如SEQ ID NO:7所示的核酸分子编码的猪伪狂犬病毒gH蛋白；

采用序列如SEQ ID NO:9所示的核酸分子编码的猪伪狂犬病毒gL蛋白。

2.根据权利要求1所述的免疫组合物，其特征在于：所述的猪伪狂犬病毒gB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

所述的猪伪狂犬病毒gC蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

所述的猪伪狂犬病毒gD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；

所述的猪伪狂犬病毒gH蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；

所述的猪伪狂犬病毒gL蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示。

3.根据权利要求1或2所述的免疫组合物用于生产用于在受试动物中诱导针对猪伪狂犬病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。

4.根据权利要求1或2所述的免疫组合物用于生产用于预防动物受猪伪狂犬病毒感染的药剂的用途。

5.根据权利要求1或2所述的免疫组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将密码子优化后的猪伪狂犬病毒gB、gC、gD、gH、gL蛋白编码基因分别克隆到对应的真核表达载体中，得到与猪伪狂犬病毒gB、gC、gD、gH、gL蛋白编码基因对应的重组质粒载体；

S2、将所述重组质粒载体分别转染CHO细胞，通过培养、筛选、驯化分别得到对应的悬浮稳定高度表达的CHO细胞株；

S3、对S2步骤中的CHO细胞株进行发酵培养，纯化后得到对应的重组猪伪狂犬病毒gB、gC、gD、gH、gL蛋白；

S4、将S3步骤中重组猪伪狂犬病毒gB、gC、gD、gH、gL蛋白混合后加入到佐剂中，即得所述免疫组合物。

6.根据权利要求5所述的一种免疫组合物的制备方法用于生产用于在受试动物中诱导针对猪伪狂犬病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。

7.根据权利要求5所述的一种免疫组合物的制备方法用于生产用于预防动物受猪伪狂犬病毒感染的药剂的用途。

8.一种蛋白组合物，其选自由以下组成的组：SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。

9.根据权利要求8所述的一种蛋白组合物用于生产用于预防动物受猪伪狂犬病毒感染的药剂的用途。

说明书

一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于动物疫苗技术领域，尤其涉及一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用。

背景技术

[0002] 伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PrV)引起的多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是伪狂犬病毒的贮存宿主，病猪、带毒猪以及带毒鼠类为本病重要传染源。该病在猪呈暴发性流行，仔猪和其他易感动物多为急性致死性症状，具有明显的神经症状、死亡率高达100％；成年猪多为隐性感染，表现为繁殖障碍与呼吸道症状，妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，育肥猪呼吸困难、生长停滞等，是危害全球养猪业的重大传染病之一。

[0003] 伪狂犬病病毒属于疱疹病毒科(Herpesviridae)、猪疱疹病毒属，属于双股线性DNA病毒，病毒粒子呈椭圆或圆形外观，主要由3层核衣壳和囊膜组成。在已经发现的PrV11种糖蛋白中，可分为必需糖蛋白(gB、gD、gH和gL蛋白)和非必需糖蛋白(gC、gE、gG、gI、gK、gM和gN蛋白)两大类。gB蛋白是PrV的1个重要囊膜组分和中和抗原，对于其感染必不可少。gB蛋白与gC蛋白形成1种糖蛋白复合物可以介导病毒与肝素样受体的结合。gD蛋白参与病毒穿透过程，同时gD蛋白也是PrV主要的免疫原性蛋白之一，它刺激机体产生的抗gD抗体具有中和保护能力。gH和gL蛋白则是必须糖蛋白的组分。

[0004] 疫苗接种是预防、控制甚至消灭伪狂犬病的主要措施之一。目前用于预防、控制猪伪狂犬病的疫苗较多都是传统的弱毒苗和灭活疫苗，有少数基因工程亚单位疫苗。但灭活疫苗存在自身免疫保护力较弱，且存在灭活不完全，造成散毒的风险；弱毒活疫苗存在毒株毒力返强的风险；亚单位疫苗存在疫苗生产成本高，免疫原性不及弱毒疫苗及灭活疫苗的问题。

发明内容

[0005] 本发明旨在提供一种猪伪狂犬病病毒亚单位疫苗的制备方法及其应用，以解决现有技术中的问题。

[0006] 为达到上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种免疫组合物，包含：

[0007] 采用序列如SEQ ID NO:1所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的猪伪狂犬病毒gB蛋白；采用序列如SEQ ID NO:3所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的猪伪狂犬病毒gC蛋白；采用序列如SEQ ID NO:5所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列
95％以上相同的核酸分子编码的猪伪狂犬病毒gD蛋白；采用序列如SEQ ID NO:7所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的猪伪狂犬病毒gH蛋白；采用序列如SEQ ID NO:9所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列
95％以上相同的核酸分子编码的猪伪狂犬病毒gL蛋白。

[0008] 本发明进一步的技术方案是：所述的猪伪狂犬病毒gB蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；所述的猪伪狂犬病毒gC蛋白包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:4的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；所述的猪伪狂犬病毒gD蛋白包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:6的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；所述的猪伪狂犬病毒gH蛋白包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:8的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；所述的猪伪狂犬病毒gL蛋白包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:10的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

[0009] 本发明的另一目的在于提供一种所述的免疫组合物用于生产用于在受试动物中诱导针对猪伪狂犬病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。

[0010] 本发明的又一目的在于提供一种所述的免疫组合物用于生产用于预防动物受猪伪狂犬病毒感染的药剂的用途。

[0011] 本发明还提供了一种免疫组合物的制备方法，包括以下步骤：

[0012] S1、将密码子优化后的猪伪狂犬病毒gB、gC、gD、gH、gL蛋白编码基因分别克隆到对应的真核表达载体中，得到与猪伪狂犬病毒gB、gC、gD、gH、gL蛋白编码基因对应的重组质粒载体；

[0013] S2、将所述重组质粒载体分别转染CHO细胞，通过培养、筛选、驯化分别得到对应的悬浮稳定高度表达的CHO细胞株；

[0014] S3、对S2步骤中的CHO细胞株进行发酵培养，纯化后得到对应的重组猪伪狂犬病毒gB、gC、gD、gH、gL蛋白；

[0015] S4、将S3步骤中重组猪伪狂犬病毒gB、gC、gD、gH、gL蛋白混合后加入到佐剂中，即得所述免疫组合物。

[0016] 本发明还提供了一种蛋白组合物，其选自由以下组成的组：SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；SEQ ID NO:4的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:4的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；SEQ ID NO:6的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:6的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；SEQ ID NO:8的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:8的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；SEQ ID NO:10的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:10的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

[0017] 本发明的另一目的在于提供一种所述的蛋白组合物用于生产用于预防动物受猪伪狂犬病毒感染的药剂的用途。

[0018] 本发明的另一目的在于提供蛋白组合物用于生产用于检测猪伪狂犬病毒相关诊断试剂的用途。

[0019] 本发明解决了背景技术中存在的缺陷，本发明公开了一种CHO细胞表达的猪伪狂犬病毒重组亚单位疫苗的制备方法和应用，并证明该疫苗能够在动物体内产生较强的体液免疫，免疫后的动物能够抵御PrV感染，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域，其目的在于提供一种免疫效果好、工艺更安全的猪伪狂犬病病毒基因工程亚单位疫苗，其目的还在于提供一种可大规模工业化生产的猪伪狂犬病毒重组亚单位疫苗的制备方法。本发明使用CHO细胞表达重组猪伪狂犬病病毒gB、gC、gD、gH、gL蛋白，生产过程不涉及全病毒培养，通过CHO细胞进行蛋白表达，产品的抗原性、免疫原性与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，表达糖基化修饰完善，最接近本身蛋白分子。对动物没有致病性，并且本发明的疫苗可以通过生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，大大降低了疫苗生产成本。

附图说明

[0020] 下面结合附图和实施例对本发明进一步说明；

[0021] 图1为单个gB目的基因进行PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果，在2.3kbp附近的位置出现目的条带：1为目的基因，2为阴性对照，M为Marker；

[0022] 图2为多个gB基因转化的菌落样品的PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，出现2.3kbp附近条带的样品为阳性样品：1至5为目的基因扩增，6为阴性对照；M为Marker；

[0023] 图3为构建好的pCI‑gB‑GS载体图谱；

[0024] 图4为单个gC目的基因进行PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果，在1.4kbp附近的位置出现目的条带：1为目的基因，2为阴性对照，M为Marker；

[0025] 图5为多个gB基因转化的菌落样品的PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，出现1.4kbp附近条带的样品为阳性样品：1至5为目的基因扩增，6为阴性对照；M为Marker；

[0026] 图6为构建好的pCI‑gC‑GS载体图谱；

[0027] 图7为单个gD目的进行基因PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果，在1.1kbp附近的位置出现目的条带：1为目的基因，2为阴性对照，M为Marker；

[0028] 图8为多个gD基因转化的菌落样品进行PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，出现1.1kbp附近条带的样品为阳性样品：1至5为目的基因扩增，6为阴性对照；M为Marker；

[0029] 图9为构建好的pCI‑gD‑GS载体图谱；

[0030] 图10为单个gH目的基因进行PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果，在2.0kbp附近的位置出现目的条带：1为目的基因，2为阴性对照，M为Marker；

[0031] 图11为多个gH基因转化的菌落样品的PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，出现2.0kbp附近条带的样品为阳性样品：1至5为目的基因扩增，6为阴性对照；M为Marker；

[0032] 图12为构建好的pCI‑gH‑GS载体图谱；

[0033] 图13为单个gL目的基因进行PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳结果，在0.5kbp附近的位置出现目的条带：1为目的基因，2为阴性对照，M为Marker；

[0034] 图14为多个gL基因转化的菌落样品的PCR扩增后PCR产物进行凝胶电泳的结果，出现0.5kbp附近条带的样品为阳性样品：1至5为目的基因扩增，6为阴性对照；M为Marker；

[0035] 图15为构建好的pCI‑gL‑GS载体图谱；

[0036] 图16为表达gB蛋白的细胞培养物进行SDS‑PAGE凝胶电泳的结果：1为单独表达gB蛋白的细胞培养物上清，2为阴性对照，M为分子量标记；

[0037] 图17为表达gC蛋白的细胞培养物进行SDS‑PAGE凝胶电泳的结果：1为单独表达gC蛋白的细胞培养物上清，2为阴性，M为分子量标记；

[0038] 图18为表达gD蛋白的细胞培养物进行SDS‑PAGE凝胶电泳的结果：1为单独表达gD蛋白的细胞培养物上清，2为阴性，M为分子量标记；

[0039] 图19为表达gH蛋白的细胞培养物进行SDS‑PAGE凝胶电泳的结果：1为单独表达gH蛋白的细胞培养物上清，2为阴性，M为分子量标记；

[0040] 图20为表达gL蛋白的细胞培养物进行SDS‑PAGE凝胶电泳的结果：1为单独表达gL蛋白的细胞培养物上清，2为阴性，M为分子量标记；

[0041] 图21为单独表达gB蛋白的重组CHO细胞培养物上清Western Blot检测结果：其中1为单独表达gB蛋白的重组CHO细胞培养物上清；2为阴性对照；M为分子量标记；

[0042] 图22‑图25分别为单独表达gC蛋白、gD蛋白、gH蛋白、gL蛋白的重组CHO细胞培养物上清Western Blot检测结果：1为重组CHO细胞培养物上清，2为阴性对照，M为分子量标记；

[0043] 图26‑图30分别为重组gB蛋白、重组gC蛋白、重组gD蛋白、重组gH蛋白、重组gL蛋白纯化后的结果；

[0044] 图31为免疫实验结果。

具体实施方式

[0045] 现在结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。

[0046] 应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

[0047] 本发明中gB、gC、gD、gH、gL蛋白序列可以是原始序列，增加以及截短的序列，使用真核表达载体pSV2‑GS，pCI‑GS，pcDNA4‑GS，优选的用pCI‑GS；CHO细胞系可以是为DG44，DXB11，CHO‑K1，CHO‑S细胞株，优选的CHO‑S；佐剂选自MONTANIDE ISA 15、MONTANIDE ISA 206VG、MONTANIDE GEL 01的一种或者两种以上的组合。

[0048] 实施例1：重组真核表达载体pCI‑gB‑GS的构建

[0049] 1.1、pUC‑S1质粒载体的构建

[0050] 密码子优化的gB基因来自南京金斯瑞生物科技有限公司，优化后的gB基因序列如SEQ ID NO:1所示。本实施例中，克隆步骤均采用的大肠杆菌克隆质粒载体优选pUC‑57，将密码子优化的gB基因克隆到pUC‑57载体上，构建了pUC‑gB质粒载体。

[0051] 1.2、gB基因扩增

[0052] 以pUC‑gB作为模板，gB‑F、gB‑R作为引物进行PCR扩增(其中gB‑F的基因序列如SEQ ID NO.11所示，gB‑R的基因序列如SEQ ID NO.12所示)，扩增体系见表1。反应条件为：94℃预变性5分钟；95℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃保藏。

[0053] 表1 gB基因扩增体系

[0054]

[0055] 将PCR产物进行凝胶电泳鉴定目的基因大小，如图1所示，在2.3kbp的位置出现条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。

[0056] 1.3、酶切

[0057] 表达载体可以是pCI‑DHFR或pSV2‑DHFR或pcDNA4‑D或pCI‑GS,本实施例中选用表达载体pCI‑GS，将pCI‑GS质粒和纯化后的gB基因PCR产物分别使用XhoⅠ、KpnⅠ37℃酶切3小时，反应体系见表2、表3。酶切产物凝胶电泳后分别回收，用凝胶回收纯化试剂盒进行纯化。

[0058] 表2 gB基因酶切反应体系

[0059]

[0060]

[0061] 表3 pCI‑GS质粒酶切反应体系

[0062]

[0063] 1.4、连接

[0064] 将酶切过的pCI‑GS质粒和gB基因酶切产物使用T4DNA连接酶16℃水浴连接过夜，连接体系见表4。

[0065] 表4 gB基因与pCI‑GS质粒连接体系

[0066]

[0067] 1.5、转化

[0068] 取10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞，混匀，42℃热休克90秒，冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液离心浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。

[0069] 1.6、菌落PCR和测序鉴定

[0070] 挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，gB‑F和gB‑R作为引物进行菌落PCR。将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图2所示，出现2.3kbp条带的样品为阳性样品。将菌落PCR鉴定阳性的菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌液进行保存，得到真核表达载体pCI‑gB‑GS。构建好的pCI‑gB‑GS载体图谱如图3所示。

[0071] 重组真核表达载体pCI‑gC‑GS、pCI‑gD‑GS、pCI‑gH‑GS和pCI‑gL‑GS按照本实施例步骤依次构建，其中引物gC‑F的基因序列如SEQ ID NO.13所示、引物gC‑R的基因序列如SEQ ID NO.14所示，构建好的pCI‑gC‑GS载体图谱如图6所示；引物gD‑F的基因序列如SEQ ID NO.15所示、引物gD‑R的基因序列如SEQ ID NO.16所示，构建好的pCI‑gD‑GS载体图谱如图9所示；引物gH‑F的基因序列如SEQ ID NO.17所示、引物gH‑R的基因序列如SEQ ID NO.18所示，构建好的pCI‑gH‑GS载体图谱如图12所示；引物gL‑F的基因序列如SEQ ID NO.19所示，引物gL‑R的基因序列如SEQ ID NO.20所示，构建好的pCI‑gL‑GS载体图谱如图15所示。

[0072] 实施例2：重组CHO细胞的构建与筛选

[0073] 1.细胞转染

[0074] 1.1、准备细胞取对数生长期的CHO细胞，CHO细胞可以使CHO‑DG44细胞或CHO‑DXB11细胞或CHO‑K1细胞或CHO‑S细胞，本实施例中选用CHO‑S细胞，取样计数，以1×6
10 cells/ml的细胞密度继续传代，维持种子，剩余细胞离心，1000rpm离心4分钟后，弃上清，用20ml左右的新鲜CHO‑WM培养基重悬，再次离心，1000rpm离心4分钟，弃上清后用少量
7
培养基重悬计数，最终将细胞密度调整为1.43×10cells/ml。

[0075] 1.2、质粒与细胞混合取实施例1中步骤1.6所得的pCI‑gB‑GS质粒载体5μg，加入至EP管中，添加0.7ml细胞，混合均匀后，静置15分钟。

[0076] 1.3、电转280V 20ms电击2个脉冲，电击完成后，立刻将细胞转入至摇瓶中，悬浮培6
养，48h后观察细胞状态，换液培养，等细胞密度生长到0.6×10cells/ml时，添加50μM MSX(L‑methionine sulphoximine)加压筛选。

[0077] 2.单克隆筛选

[0078] 2.1、用苏州沃美生物技术有限公司的CHO细胞无血清无蛋白培养基CHO‑WM细胞培养基+50μM MSX重新悬浮细胞，计数。

[0079] 2.2、铺板稀释细胞至5个/mL，取200μl混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5％CO2细胞培养箱中孵育4‑6h。记录单个细胞的孔。

[0080] 2.3、待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，PBS洗一次，100μl 0.25％trypsin‑EDTA，室温消化2min左右，加入2mL CHO‑WM培养基(含10％FBS+50μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，Elisa检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养，冻存。

[0081] 3.细胞摇瓶发酵

[0082] 3.1、传代培养基的配置：使用CHO‑WM培养基添加50μM MSX作为传代培养基，置于37℃水浴锅总预热至37℃。

[0083] 3.2、从CO2恒温摇床取出摇瓶细胞，进行计数。

[0084] 3.3、稀释细胞至2.5‑3.5×105个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO2恒温摇床中100rpm/min孵育过夜。

[0085] 3.4、每隔24h计数细胞密度以及活力，测葡萄糖，当糖低于2g/L的时候，添加葡萄糖到4g/L；每天取1mL样品，上清用于检测蛋白表达情况。

[0086] 以同样的方法对所得的pCI‑gC‑GS、pCI‑gD‑GS、pCI‑gH‑GS和pCI‑gL‑GS载体进行重组CHO细胞的构建与筛选的操作。

[0087] 实施例3：SDS‑PAGE检测

[0088] 分别将收获的细胞培养物上清进行SDS‑PAGE检测，同时使用空的CHO细胞作为阴性对照。具体操作如下：取40μl收获的细胞培养物，加入10μl的5×loading buffer，沸水浴5分钟，12000r/min离心1分钟，取上清进行SDS‑PAGE凝胶(12％浓度凝胶)电泳，电泳后取凝胶经染色、脱色后观察目的条带。

[0089] 所得表达gB蛋白的细胞培养物检测结果如图16所示，在分子量约90kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。

[0090] 所得表达gC蛋白的细胞培养物检测结果如图17所示，在分子量约50kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。

[0091] 所得表达gD蛋白的细胞培养物检测结果如图18所示，在分子量约50kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。

[0092] 所得表达gH蛋白的细胞培养物检测结果如图19所示，在分子量约100kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。

[0093] 所得表达gL蛋白的细胞培养物检测结果如图20所示，在分子量约18kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。

[0094] 实施例4：Western Blot检测

[0095] 分别将实施例3中SDS‑PAGE电泳后的产物转印到NC(硝酸纤维素)膜上，用5％脱脂牛奶封闭2小时，猪源抗PrV多抗血清孵育2小时，漂洗，HRP标记的羊抗猪多克隆抗体二抗孵育2小时，漂洗，然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用化学发光成像仪拍照。如图21‑25所示，图中重组CHO上清样品有细胞条带，阴性对照没有目的条带，说明目的抗原蛋白在重组CHO细胞中得到正确表达。

[0096] 实施例5：蛋白纯化

[0097] 由于目的蛋白含有his标签，使用镍柱亲和层析纯化目的蛋白。按照以下步骤分别纯化五种目的蛋白。

[0098] 1.Ni柱的再生和平衡：

[0099] 1.1、0.5mol/L的NaOH反向冲洗Ni柱10min，冲洗结束后，用超纯水正向冲洗。

[0100] 1.2、50mol/L的NiSO4冲洗5柱体积。结束后，用超纯水正向冲洗。

[0101] 1.3、用含有300mM咪唑PBS(pH＝7.4)缓冲液冲洗3个柱体积后继续用PBS缓冲液冲洗平衡5个柱体积。

[0102] 2.Ni纯化过程:

[0103] PBS平衡Ni柱后，取培养的上清上样，上样结束后用PBS洗涤5个柱体积至基线平衡。然后分别使用含有30mM和150mM咪唑的PBS进行洗脱。

[0104] 结果如图26‑30所示，在150mM咪唑浓度的PBS溶液中洗脱出目的蛋白。

[0105] 实施例6：猪伪狂犬病病毒重组亚单位疫苗制备

[0106] 分别将适量纯化的猪伪狂犬病病毒重组gB蛋白、重组gC蛋白、重组gD蛋白、重组gH蛋白、重组gL蛋白混合后加入到MONTANIDE ISA 206VG佐剂中(蛋白混合物与佐剂的体积比为1:1)，使混合蛋白终浓度为100μg/mL，乳化，质检合格后置于4℃保存。佐剂可以是MONTANIDE ISA 15、MONTANIDE ISA 206VG、MONTANIDE GEL 01中的一种或任意两种的组合或三种的组合，本实施例中选取MONTANIDE ISA 206VG一种作为佐剂。

[0107] 实施例7：猪伪狂犬病病毒重组亚单位疫苗的免疫实验

[0108] 1.血清中和抗体检测

[0109] 取PrV中和抗体效价≤1:4的仔猪16头，随机分为疫苗组与对照组，每组8头。疫苗组接种成品亚单位疫苗2mL，对照组注射同样体积的生理盐水，于免疫后14日采血，用中和试验法检测血清中和抗体。疫苗组8头仔猪有8头血清阳转，猪伪狂犬病毒中和抗体效价≥1:32。阴性对照组8头仔猪都为PrV抗体阴性，猪伪狂犬病毒中和抗体效价≤1:4。

[0110] 2.免疫攻毒

[0111] 上述两组16头仔猪，于免疫后28日，各滴鼻攻击PrVFa株病毒液1ml(106PFU)，观察7日，对照组8头均发病，均观察到有消瘦和明显的呼吸症状、耳皮下毛细血管出血；其中6头横卧于地，做“划船”动作，角弓反张；观察7天内有4头死亡。疫苗组全部存活，未观察到明显病状，仔猪正常生长，说明产品合格。解剖对照组和免疫组猪，可以发现对照组猪有肺出血、角弓反张、肝脏表面有散在坏死点、肾弥漫性淤血点(图31所示)，免疫组猪解剖正常。

[0112] 以上依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定。