一种间充质干细胞无血清培养基及其用途

摘要

本发明涉及一种间充质干细胞无血清培养基及其用途，所述无血清培养基包括基础培养基和添加组分，所述添加组分包括以下成分：2'‑Deoxyadenosine、2'‑Deoxycytidine•HCl、2'‑Deoxyguanosine、L‑谷氨酰胺、人血清白蛋白、重组人转铁蛋白、重组人胰岛素、rhPDGF‑BB、rhFGF‑b、rhTGF‑beta1、rhEGF、硒酸钠及氢化可的松。采用本发明的无血清培养基，不含牛血清等动物来源的异源成分，能够有效替代血清进行骨髓间充质干细胞的培养，并且添加组分中各组分的协同作用使得该培养基在进行骨髓间充质干细胞培养时具有细胞周期缩短，增值迅速，细胞一致性好，能够有效维持骨髓间充质干细胞分子特性及分化潜能，通过该培养基获得的骨髓间充质干细胞适合于进一步的科学研究及临床应用研究。

权利要求

1.一种骨髓间充质干细胞无血清培养基，包括基础培养基和添加组分，其特征在于，所述添加组分由以其体积计的以下成分组成：2'-Deoxyadenosine 110～140ug/L；2'-Deoxycytidine·HCl 110～140ug/L；2'-Deoxyguanosine 110～140ug/L；L-谷氨酰胺3～

6mg/mL；人血清白蛋白65～85mg/mL；重组人转铁蛋白110～140ng/mL；重组人胰岛素10～

15ng/mL；rhPDGF-BB 55～70ng/mL；rhFGF-b 55～70ng/mL；rhTGF-beta1 35～40ng/mL；

rhEGF 55～70ng/mL；硒酸钠150～200ng/mL；氢化可的松1～5ug/mL；所述基础培养基与添加组分的体积比为10：0.8～1.6。

2.根据权利要求1所述的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述添加组分各成分的含量：2'-Deoxyadenosine 120～130ug/L；2'-Deoxycytidine·HCl 120～130ug/L；

2'-Deoxyguanosine 120～130ug/L；L-谷氨酰胺4～5mg/mL；人血清白蛋白70～80mg/mL；重组人转铁蛋白120～130ng/mL；重组人胰岛素12～13ng/mL；rhPDGF-BB 60～65ng/mL；

rhFGF-b 60～65ng/mL；rhTGF-beta1 35～40ng/mL；rhEGF 60～65ng/mL；硒酸钠175～

195ng/mL；氢化可的松1～5ug/mL。

3.根据权利要求2所述的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于，所述添加组分各成分的含量：2'-Deoxyadenosine 125ug/L、2'-Deoxycytidine·HCl 125ug/L、2'-Deoxyguanosine 125ug/L、L-谷氨酰胺4.5mg/mL、人血清白蛋白75mg/mL、重组人转铁蛋白

125ng/mL、重组人胰岛素12.5ng/mL、rhPDGF-BB 62.5ng/mL、rhFGF-b 62.5ng/mL、rhTGF-beta1 37.5ng/mL、rhEGF 62.5ng/mL、硒酸钠188ng/mL、氢化可的松3ug/mL。

4.根据权利要求1～3中任一项权利要求所述的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：所述基础培养基与添加组分的体积比为10：0.8。

5.根据权利要求4所述的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：所述基础培养基与添加组分的体积比为10：1.0。

6.根据权利要求5所述的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：所述基础培养基与添加组分的体积比为10：1.6。

7.根据权利要求1～3中任一项权利要求所述的间充质干细胞无血清培养基，其特征在于：所述基础培养基为DMEM/F12。

8.权利要求1～7中任一项权利要求所述的间充质干细胞无血清培养基用于骨髓间充质干细胞的培养的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的骨髓间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞。

说明书

一种间充质干细胞无血清培养基及其用途

技术领域

[0001] 本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种间充质干细胞无血清培养基及其用途。

背景技术

[0002] 间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)属于中胚层的多能干细胞，主要存在于结缔组织和器官间质中，具有自我更新和多向分化能力，广泛存在于脐带组织、脂肪、骨髓、骨骼肌、骨外膜、肺、肝、胰腺等组织以及羊水、脐带血中。间充质干细胞具有非常强的分化能力，在特定的条件培养下，它可以增殖分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、神经细胞、肌细胞等多种类型的细胞。

[0003] 间充质干细胞中，来源于骨髓的骨髓间充质干细胞(Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells，BM-MSCs)含量最为丰富，骨髓间充质干细胞具有强大的增殖能力和多向分化潜能，在适宜的体内或体外环境下具有分化为肌细胞、肝细胞、成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞的能力；具有免疫调节功能，通过细胞间的相互作用及产生细胞因子抑制T细胞的增殖及其免疫反应，从而发挥免疫重建的功能；具有来源方便，易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增后仍具有干细胞特性，并且表面抗原不明显，异体移植排异较轻，配型要求不严格。正是由于拥有这些特性，使得间充质干细胞能够提供一种理想的生物学平台，用于科学研究与临床应用，如细胞治疗、再生医学、药物筛选、基因治疗载体的建立、细胞发育与分化的分子调节机制研究、组织工程种子细胞等。2004年，Le Blanc等报道了首例半相合异基因间充质干细胞移植治疗GVHD获得成功，其后又报道了异基因配型不合的间充质干细胞移植治疗GVHD的有效性，并且认为在应用间充质干细胞治疗GVHD不需要严格的配型，其后又有多篇异基因未经配型的MSC治疗GVHD、促进造血重建的报道，其MSC来源涉及骨髓、脂肪、牙周等。目前，美国FDA已批准了近60项间充质干细胞的临床试验，主要包括：组织损伤的修复：骨、软骨、关节损伤、心脏损伤；肝脏损伤；脊髓损伤和神经系统疾病；自身免疫性疾病治疗：系统性红斑狼疮、硬皮病、炎性肠炎等；作为基因治疗的载体。

[0004] 尽管骨髓的间充质干细胞含量最丰富，但是其在骨髓组织中的含量极低，采集难度及对机体损伤大，极大地限制了间充质干细胞的研究与应用，如何获得高活性、高一致性、更安全的骨髓间充质干细胞，是间充质干细胞研究应用的重要课题。传统的间充质干细胞培养仍需要添加胎牛血清，培养的间充质干细胞通过胞吞摄取牛血清蛋白而携带牛血清蛋白，能够引起受体免疫反应，同时有引入异源血清携带的细菌、病毒的风险，再者血清培养的细胞产率、传代次数有限，极大限制了间充质干细胞的应用。

发明内容

[0005] 本发明目的是为了克服现有技术的不足而提供一种改进的间充质干细胞无血清培养基。

[0006] 本发明的另一目的是提供上述间充质干细胞无血清培养基的用途。

[0007] 为达到上述目的，本发明所采用的技术方案为：

[0008] 一种间充质干细胞无血清培养基，包括基础培养基和添加组分，所述添加组分包括以下成分：2'-Deoxyadenosine、2'-Deoxycytidine·HCl、2'-Deoxyguanosine、L-谷氨酰胺、人血清白蛋白、重组人转铁蛋白、重组人胰岛素、rhPDGF-BB、rhFGF-b、rhTGF-beta1、rhEGF、硒酸钠及氢化可的松。

[0009] 根据本发明的一些实施方面，以所述添加组分的体积计，所述添加组分各成分的含量：2'-Deoxyadenosine 110～140ug/L；2'-Deoxycytidine·HCl 110～140ug/L；2'-Deoxyguanosine 110～140ug/L；L-谷氨酰胺3～6mg/mL；人血清白蛋白65～85mg/mL；重组人转铁蛋白110～140ng/mL；重组人胰岛素10～15ng/mL；rhPDGF-BB 55～70ng/mL；rhFGF-b 55～70ng/mL；rhTGF-beta1 35～40ng/mL；rhEGF 55～70ng/mL；硒酸钠150～200ng/mL；氢化可的松1～5ug/mL。

[0010] 根据本发明的一些实施优选方面，所述添加组分各成分的含量：2'-Deoxyadenosine 120～130ug/L；2'-Deoxycytidine·HCl 120～130ug/L；2'-Deoxyguanosine 120～130ug/L；L-谷氨酰胺4～5mg/mL；人血清白蛋白70～80mg/mL；重组人转铁蛋白120～130ng/mL；重组人胰岛素12～13ng/mL；rhPDGF-BB 60～65ng/mL；rhFGF-b 60～65ng/mL；rhTGF-beta1 35～40ng/mL；rhEGF 60～65ng/mL；硒酸钠175～195ng/mL；氢化可的松1～5ug/mL。

[0011] 根据本发明的一些实施更优选方面，所述添加组分各成分的含量：2'-Deoxyadenosine 125ug/L、2'-Deoxycytidine·HCl 125ug/L、2'-Deoxyguanosine 125ug/L、L-谷氨酰胺4.5mg/mL、人血清白蛋白75mg/mL、重组人转铁蛋白125ng/mL、重组人胰岛素12.5ng/mL、rhPDGF-BB 62.5ng/mL、rhFGF-b 62.5ng/mL、rhTGF-beta1 37.5ng/mL、rhEGF 
62.5ng/mL、硒酸钠188ng/mL、氢化可的松3ug/mL。

[0012] 根据本发明的一些实施方面，所述基础培养基与添加组分的体积比为10：0.4～1.6。

[0013] 根据本发明的一些实施优选方面，所述基础培养基与添加组分的体积比为10：0.6～1.0。

[0014] 根据本发明的一些实施更优选方面，所述基础培养基与添加组分的体积比为10：0.8。

[0015] 根据本发明的一些实施方面，所述基础培养基为DMEM/F12。

[0016] 本发明采取另一技术方案是：上述所述的间充质干细胞无血清培养基用于骨髓间充质干细胞的培养的用途。

[0017] 本发明采取另一技术方案是：上述所述的间充质干细胞无血清培养基用于脐带间充质干细胞或脂肪间充质干细胞的培养的用途。

[0018] 由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

[0019] 本发明通过在基础培养基中添加2'-Deoxyadenosine、2'-Deoxycytidine·HCl、2'-Deoxyguanosine、L-谷氨酰胺、人血清白蛋白、重组人转铁蛋白、重组人胰岛素、rhPDGF-BB、rhFGF-b、rhTGF-beta1、rhEGF、硒酸钠、氢化可的松等多种营养因子替代血清功能，成分明确、稳定，排除了血清培养的不稳定性，同时各因子之间协同作用，能够高效的扩增骨髓间充质干细胞，缩短细胞周期，增殖迅速，3代次培养细胞产率达到血清培养3倍以上，而且细胞一致性好，能够高效的维持其生物学特性及分化潜能。细胞免疫表型分析说明：阳性标志物CD90和CD105表达率达98％以上；阴性标志物CD45表达率1％以下。细胞分化检测说明，以此培养基培养的骨髓间充质干细胞能够有效地分化为软骨细胞、脂肪细胞、成骨细胞。通过本发明培养基获得的骨髓间充质干细胞适合于进一步的科学研究及临床应用研究。

[0020] 本发明的培养基通过在基础培养基中添加成分明确的添加组分，制备的无血清培养基具有高效、稳定、安全的优点，且适合大规模培养制备骨髓间充质干细胞。

[0021] 本发明的培养基不含动物来源血清及动物来源蛋白成分，排出了动物源蛋白污染，排出异源蛋白可能引起的免疫反应，同时排出动物来源的细菌、病毒感染等风险。

[0022] 本发明的培养基在细胞培养效果上能够接近或超过进口无血清培养基的水平，成本低廉，打破国外公司价格高昂，供应不及时，价格垄断等状况。

附图说明

[0023] 图1(a)、(b)分别为人骨髓间充质干细胞在实施例1的无血清培养基和胎牛血清培养基培养条件下连续传代3次的细胞形态观测示意图。

[0024] 图2为人骨髓间充质干细胞在实施例1的无血清培养基和胎牛血清培养基培养条件下连续传代3次的细胞产率对比示意图。

[0025] 图3(a)、(b)分别为人骨髓间充质干细胞在实施例1的无血清培养基和胎牛血清培养基培养条件下连续传代3次细胞标志物的检测结果示意图。

[0026] 图4为人骨髓间充质干细胞在实施例1的无血清培养基培养条件下连续传代3次细胞分化测试结果示意图。

[0027] 图5为人骨髓间充质干细胞在实施例3不同配比无血清培养基M1-M5，进口MSC无血清培养基M6-M7和胎牛血清培养基M8培养条件下连续传代3次的细胞形态观测示意图。

[0028] 图6为人骨髓间充质干细胞在实施例3不同配比无血清培养基M1-M5，进口MSC无血清培养基M6-M7和胎牛血清培养基M8培养条件下连续传代3次的细胞产率对比示意图。

具体实施方式

[0029] 正如背景技术中介绍的，如何获得高活性、高一致性、更安全的骨髓间充质干细胞，是间充质干细胞研究应用的重要课题。为了提高间充质干细胞体外培养质量，降低风险，需要研发高效的间充质干细胞无血清培养基，本发明通过在基础培养基中添加人源蛋白、重组蛋白、细胞因子、微量元素、氨基酸等方式，替代血清功能，以期实现无动物源成分，同时还能够高效的扩增间充质干细胞，相比血清培养，大大缩短细胞周期，并且细胞一致性好，能有效维持其生物学特性及分化潜能，还减少血清培养带来的不稳定性，排除异源血清生物安全风险等。

[0030] 为更清楚体现本发明的目的、技术方案及优势，下面结合说明书附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。实施例仅用以阐释本发明，不用于限制本发明。

[0031] 实施例1

[0032] 本实施例提供的间充质干细胞无血清培养基由以下成分组成：基础培养基和添加组分，基础培养基为DMEM/F12，添加组分记为MAX1组分，MAX1组分和DMEM/F12的具体物质组成如下：

[0033] (1)MAX1组分中含有的组分及各组分的含量为(以MAX1组分的体积计)：

[0034]

[0035] (2)DMEM/F12组分中含有的组分及各组分含量为(以DMEM/F12组分的体积计)：

[0036]

[0037]

[0038] 本例中，基础培养基DMEM/F12，也可以直接从试剂公司购买。

[0039] 本例中，间充质干细胞无血清培养基以DMEM/F12与MAX1按体积比1000mL：80mL配制而成，配制方法采用常规方法配制。

[0040] 实施例2

[0041] 本实施例提供实施例1的间充质干细胞无血清培养基的效果验证。

[0042] 本实施例的实验中采用人骨髓间充质干细胞，该细胞来源于ATCC标准细胞库(PCS-500-012，Lot 70011720，ATCC)，此细胞用于下述所有实验。

[0043] 一、实验方法

[0044] 1、细胞培养

[0045] 人骨髓间充质干细胞，以5000/cm2密度接种于100mm细胞培养皿，实验所用细胞培养皿皆经包被预处理，包含下列人源粘附分子：10μg/cm2人源胶原蛋白IV(collagen IV)、5μg/cm2人源纤维连接蛋白(fibronectin)。

[0046] 添加间充质干细胞无血清培养基及对照组含牛血清培养基(DMEM/F12培养基(Sigma,M2906)加入10％胎牛血清(ExCellBio，FND500))，进行连续培养，添加量约为15ml，每48～72h更换一次培养基，骨髓间充质干细胞生长至约80％丰度(约72～96h)时进行传代2
培养，同时记录细胞数。继代培养仍以5000/cm 密度接种于100mm细胞培养皿，连续传代培养3次，每样本设置3个重复实验组。

[0047] 实验设置2组，分别采用实施例1的间充质干细胞无血清培养基及对照组含牛血清培养基(DMEM/F12培养基(Sigma,M2906)加入10％胎牛血清(ExCellBio，FND500))。

[0048] 二、细胞鉴定

[0049] 1、检测骨髓间充质干细胞细胞形态及增殖效率

[0050] 按上述细胞培养的实验方法连续传代三次，同时追踪各代次细胞形态，如图1所示，结果显示，采用实施例1的无血清培养基的培养条件，连续传代三次，细胞形态均一，符合骨髓间充质干细胞梭形。

[0051] 按上述细胞培养的实验方法连续传代三次，同时追踪各代次细胞产率，如图2所示，结果显示，采用实施例1的无血清培养基的培养条件，骨髓间充质干细胞在无血清条件下产率更高，传代三次(图2中P3)达到血清培养三倍以上，(由图2中可看出产率甚至达到4倍以上)，产率远远高于血清培养的产率。

[0052] 2、骨髓间充质干细胞细胞表面标志物检测

[0053] 骨髓间充质干细胞在实施例1的无血清培养基和胎牛血清培养基的培养条件下连续培养传代3次，以常规方法进行细胞免疫染色，通过细胞流式术进行标志物分析。

[0054] 细胞染色：阳性染色以APC/Cy7anti-human CD90和PE anti-human CD105抗体染色；阴性以PerCP anti-human CD45进行染色；同时分别以对应的同型对照作为参照。

[0055] 使用BD FACSCanto II进行细胞流式术分析。

[0056] 检测结果参见图3所示，结果显示，采用本实施例1的无血清培养基培养的骨髓间充质干细胞能够很好的保证骨髓间充质干细胞的生物特性不改变，且无血清培养条件下阳性标志物CD90和CD105表达率达98％以上；阴性标志物CD45表达率1％以下。

[0057] 3、骨髓间充质干细胞细胞分化测试

[0058] 骨髓间充质干细胞在实施例1的无血清培养基培养条件下连续培养3代，然后分别使用成骨分化培养基(StemCell，05455)、成脂分化培养基(StemCell，05465)、成软骨分化培养基(StemCell，05415)进行细胞分化培养，以常规方法进行细胞分化测试，以常规染色方式进行染色鉴定。

[0059] 细胞染色后结果如图4所示，结果显示，无血清培养条件下，骨髓间充质干细胞能够较好的保持干细胞的分化潜能，较高比例的分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。

[0060] 实施例3

[0061] 本实施例提供多种培养基的效果验证。

[0062] 本实施例的实验中采用人骨髓间充质干细胞，该细胞来源于ATCC标准细胞库(PCS-500-012，Lot 70011720，ATCC)，此细胞用于下述所有实验。

[0063] 一、实验方法

[0064] 1、培养基的配制：

[0065]编号 培养基溶液体积配比(DMEM/F12：MAX1)
M1 10:0.4
M2 10:0.6
M3 10:0.8
M4 10:1.0
M5 10:1.6
M6 商业化无血清培养基I
M7 商业化无血清培养基II
M8 含血清培养基

[0066] 其中：编号M1～M5中的培养基是基础培养基和MAX1在不同体积配比下的培养基，基础培养基和MAX1的组分及其含量同实施例1；

[0067] 商业化无血清培养基I：进口品牌MSC无血清培养基(Miltenyi Biotec，130-104-182)；

[0068] 商业化无血清培养基II：进口品牌MSC无血清培养基(GIBCO，A1033201)；

[0069] 含血清培养基：DMEM/F12培养基(Sigma,M2906)加入10％胎牛血清(ExCellBio，FND500)配制而成。

[0070] 2、细胞培养

[0071] 人骨髓间充质干细胞，以5000/cm2密度接种于6孔细胞培养板，实验所用细胞培养板皆经包被预处理，包含下列人源粘附分子：10μg/cm2人源胶原蛋白IV(collagen IV)、5μg/cm2人源纤维连接蛋白(fibronectin)。

[0072] 分别添加间充质干细胞培养基M1～M8，进行连续培养，添加量约为2ml，每48～72h更换一次培养基，骨髓间充质干细胞生长至约80％丰度(约72～96h)时进行传代培养，同时记录细胞数，每样本设置3个重复实验组。

[0073] 继代培养仍以5000/cm2密度接种于6孔细胞培养板，连续传代培养3次，每样本设置3个重复实验组。

[0074] 实验设置8组，分别采用本实施例编号M1～M8的培养基进行细胞培养实验，每样本设置3个重复实验组。

[0075] 二、效果检测

[0076] 1、骨髓间充质干细胞形态分析

[0077] 按上述细胞培养的实验方法连续传代3次，同时追踪各代次细胞形态，如图5所示，结果显示，采用实施例3中DMEM/F12：MAX1以10:0.4～1.6不同配比混合，配制成的M1～M5无血清培养基，用M1～M5培养基进行细胞培养，连续传代3次，细胞形态均一，符合骨髓间充质干细胞梭形(见图5)。

[0078] 2、骨髓间充质干细胞增殖分析

[0079] 按上述细胞培养的实验方法连续传代3次，同时追踪各代次细胞产率，如图6所示，结果显示：采用实施例1的无血清培养基的培养条件，骨髓间充质干细胞在无血清条件下产率更高；传代3次，无血清培养基M3细胞收率可达到血清培养4倍以上(如图6所示，M3与M8Passage3数据对比)；M1～M5配制方案好于进口对坐品牌M7；M3～M5配制方案与进口品牌M6产率接近，并远高于血清培养基M8的产率(如图6所示)。

[0080] 上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。