球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架及制备方法

摘要

本发明公开了球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架及制备方法，解决现有技术中羟基磷灰石粒子形貌、尺寸和含量不可控，以及分布不均匀的问题。本发明所述的一种球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架的制备方法，包括以下步骤：将天然高分子溶解于去离子水制成高分子溶液；将高分子溶液交联形成高分子凝胶；将可溶性钙盐溶液滴加到凝胶表面，扩散；再将可溶性含磷溶液滴加到凝胶表面，继续扩散；去除扩散完成后凝胶表面的溶液，将凝胶浸泡于碱性溶液，再用磷酸盐缓冲溶液(PBS)、去离子水依次对凝胶进行洗涤，冷冻干燥得到三维多孔的仿生支架。本发明设计科学，方法简单，操作简便。

权利要求

1.一种球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1.将天然高分子溶解于去离子水，制备成高分子溶液；

步骤2.将步骤1中制得的高分子溶液交联形成高分子凝胶；

步骤3.将可溶性钙盐溶液滴加到步骤2制得的凝胶表面，扩散；再将可溶性含磷溶液滴加到凝胶表面，继续扩散；

步骤4.去除扩散完成后凝胶表面的溶液，将凝胶浸泡于碱性溶液，再用磷酸盐缓冲溶液、去离子水依次对凝胶进行洗涤，冷冻干燥得到三维多孔的仿生支架；

所述的可溶性钙盐为氯化钙、硝酸钙中的一种，所述的可溶性含磷化合物为磷酸二氢钠、磷酸中的一种。

2.根据权利要求1所述的一种球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架的制备方法，其特征在于，所述天然高分子选胶原、明胶、透明质酸、纤维素、甲壳素、壳聚糖、丝素蛋白及其改性产物中的任意一种或几种混合。

3.根据权利要求2所述的一种球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的高分子溶液质量浓度为0.5％～10％。

4.根据权利1所述的一种球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架的制备方法，其特征在于，所述步骤2中交联方式选自化学交联、物理交联中的一种或两种的结合。

5.根据权利要求4所述的一种球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架的制备方法，其特征在于，所述化学交联采用的交联剂为戊二醛，京尼平，甘油磷酸钠中的一种。

6.根据权利要求1所述的一种球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架的制备方法，其特征在于，所述可溶性钙盐的浓度为0.05～1.5mol/L。

7.根据权利要求1所述的一种球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架的制备方法，其特征在于，所述可溶性含磷溶液的浓度为0.04～1mol/L。

8.根据权利要求1所述的一种球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，将可溶性钙盐溶液滴加到步骤2制得的凝胶表面，扩散2～12小时；再将可溶性含磷溶液滴加到凝胶表面，继续扩散2～12小时。

9.权利要求1-8任意一项所述的制备方法制成的球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架。

10.权利要求9所述的球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架，其特征在于，具有三维贯通的多孔结构，孔径尺寸为100～800μm，孔隙率为40％～90％；所述支架中羟基磷灰石粒子平均粒径为20～200nm。

说明书

球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架及制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架及制备方法。

背景技术

[0002] 由于创伤、肿瘤、人口老年化等原因，骨缺损患者越来越多，骨缺损疾病已成为威胁人类健康的重大疾病。骨基质主要有有机质和无机质构成，有机质的主要由胶原纤维构成，无机质的主要成分为羟基灰石，纳米羟基磷灰石晶体均匀有序地排列在胶原纤维的长轴方向。为了模仿自然骨的组成和结构，将天然有机高分子(如胶原，明胶等)和无机羟基磷灰石粒子复合来仿生构建骨缺损损修复材料具有重要的意义。

[0003] 目前，制备仿生支架的方法主要有物理共混法、生物矿化法，原位沉积法。物理共混法是直接将天然有机高分子和无机纳米羟基磷灰石物理混合，如专利CN 105521524 A采用物理共混法制备了一种明胶羟基磷灰石纳米复合材料，但这种方法存在纳米粒子团聚严重、无机相分布不均匀的问题，这将影响支架的力学性能和骨修复性能。生物矿化法是通过将材料浸泡在模拟体液(SBF)等模拟液中，在高分子表面形成一层矿化层，但此方法制备的支架中无机成分的比例非常低，生物活性和成骨性能较差(CN  105688288A；Adv.Funct.Mater.2018,28,1804730)。原位沉积法则是通过在高分子溶液中加入钙盐(氯化钙，硝酸钙等)和磷盐(磷酸氢二钠，磷酸二氢铵等)，在高分子材料内生长出羟基磷灰石，该方法虽然可以实现无机相的均匀分布，且含量可调，但存在羟基磷灰石形貌和粒径的不可控，羟基磷灰石粒子仍存在团聚生长的问题。(CN 107929812A；CN 1106861C；ACS Appl.Mater.Interfaces 2015,7,10386)因此，如何实现羟基磷灰石粒子形貌、尺寸和含量可控，且可以均匀分布在有机质中，是目前亟需解决的技术问题。

发明内容

[0004] 本发明解决的技术问题是：提供一种球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架的制备方法，解决现有技术中羟基磷灰石粒子形貌、尺寸和含量不可控，分布不均匀的问题。

[0005] 本发明还提供了采用该制备方法制得的球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架。

[0006] 本发明采用的技术方案如下：

[0007] 本发明所述的一种球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架的制备方法，包括以下步骤：

[0008] 步骤1.将天然高分子溶解于去离子水，制备成高分子溶液；

[0009] 步骤2.将步骤1中制得的高分子溶液交联形成高分子凝胶；

[0010] 步骤3.将可溶性钙盐溶液滴加到步骤2制得的凝胶表面，扩散；再将可溶性含磷溶液滴加到凝胶表面，继续扩散；

[0011] 步骤4.去除扩散完成后凝胶表面的溶液，将凝胶浸泡于碱性溶液，再用磷酸盐缓冲溶液(PBS)溶液、去离子水依次对凝胶进行洗涤，冷冻干燥得到三维多孔的仿生支架。

[0012] 所述步骤3中的扩散为低温条件下扩散，优选为2-6℃条件下扩散。

[0013] 进一步地，所述天然高分子选胶原、明胶、透明质酸、纤维素、甲壳素、壳聚糖、丝素蛋白及其改性产物中的任意一种或几种混合。

[0014] 进一步地，所述步骤1中的高分子溶液质量浓度为0.5％～10％。

[0015] 进一步地，所述步骤2中交联方式选自化学交联、物理交联中的一种或两种中的结合。

[0016] 进一步地，所述化学交联采用的交联剂为戊二醛，京尼平，甘油磷酸钠中的一种。

[0017] 进一步地，所述的可溶性钙盐为氯化钙、硝酸钙中的一种，可溶性钙盐的浓度为0.05～1.5mol/L。

[0018] 进一步地，所述的可溶性含磷化合物为磷酸二氢钠、磷酸中的一种，可溶性含磷溶液的浓度为0.04～1mol/L。

[0019] 进一步地，所述步骤3中，将可溶性钙盐溶液滴加到步骤2制得的凝胶表面，扩散2～12小时；再将可溶性含磷溶液滴加到凝胶表面，继续扩散2～12小时。

[0020] 本发明所述的上述制备方法制成的球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架。

[0021] 优选地，该支架具有三维贯通的多孔结构，孔径尺寸为100～800μm，孔隙率为40％～90％；所述支架中羟基磷灰石粒子平均粒径为20～200nm。

[0022] 优选地，所述支架中羟基磷灰石粒子的质量含量为5％～80％。

[0023] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0024] 本发明设计科学，方法简单，操作简便。本发明创造性地采用“先成胶-后沉积”方法成功实现对羟基磷灰石形貌、尺寸和含量的调控。首先，将可溶性钙盐溶液滴加到凝胶表面，低温扩散后，再将可溶性含磷溶液滴加到凝胶表面，再次低温扩散，通过调节体系的pH值，使在凝胶内部生成纳米级的羟基磷灰石颗粒，颗粒形貌为球形，且均匀分布在凝胶中。另外，通过控制凝胶在碱溶液中的浸泡时间，实现羟基磷灰石颗粒粒径大小的调节，从而满足多种不同的临床需求。

[0025] 采用本发明方法制成的球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架，具有三维贯通的多孔结构，有利于细胞和血管的迁移和长入；具有良好的生物相容性和生物降解性，其降解速率可调，且纳米羟基磷灰石粒子可随着高分子的降解而缓慢释放，有利于新骨的再生。

附图说明

[0026] 附图1为本发明的球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架的扫描电镜图。其中，a，b，c均为实施例2中制成的支架的扫描电镜照片:图a为放大100倍，图b为放大20000倍，图c为放大50000倍。图d为实施例3采用的支架的扫描电镜照片，放大倍数为20000倍。

[0027] 附图2为试验例一中球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架与骨髓间充质干细胞(B MSCs)共培养后1、3、7天的MTT结果图。

[0028] 附图3为试验例二中球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架植入大鼠颅骨缺损处8周后取材进行Masson三色染色的切片放大10倍的结果图。

具体实施方式

[0029] 下面通过具体实施例对本发明所述的球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架进行进一步说明。

[0030] 实施例1

[0031] 本实施例公开了本发明的球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架的制备方法，选用明胶作为天然高分子原料，可溶性钙盐为氯化钙，质量浓度为0.25％的戊二醛溶液为交联剂，实施步骤如下：

[0032] (1)将1g明胶和18mL去离子水混合后置于60℃水浴锅中加热搅拌30分钟，得到透明均一的明胶溶液，其质量分数为5％。

[0033] (2)将2mL质量分数为2.5％的戊二醛溶液加入明胶溶液中(戊二醛终浓度为0.25％)，混合均匀后将溶液倒入塑料培养皿中，放置于4℃的冰箱12小时使其成为凝胶。将
3.6mL氯化钙溶液滴加铺满凝胶表面后，将其置于4℃冰箱中扩散12小时，取出，而后再将
3.6mL磷酸溶液滴加铺满凝胶表面，在4℃冰箱中继续扩散12小时。其中，氯化钙溶液浓度为
0.267mol/L，磷酸浓度为0.16mol/L，Ca：P＝1.67:1。

[0034] (3)去除凝胶表面的液体，将凝胶浸泡于15％氨水溶液3h。取出支架浸泡于0.1M的精氨酸溶液以去除支架中残留的戊二醛，再用磷酸盐缓冲液(PBS)、去离子水依次对凝胶进行洗涤，冷冻干燥即得到三维多孔的仿生支架，孔径为100-300μm。支架中的羟基磷灰石粒子为分布均匀的球形颗粒，粒径为50-70nm。支架中纳米羟基磷灰石质量/明胶高分子质量比例为5.26％。

[0035] 实施例2

[0036] 选用明胶作为天然高分子原料，可溶性钙盐为硝酸钙，0.1％的戊二醛为交联剂，实施步骤如下：

[0037] (1)将1g明胶和18mL去离子水混合后放置于60℃水浴锅中加热搅拌30分钟，得到质量分数为5％的透明均一的明胶溶液。

[0038] (2将2mL质量分数为1％的戊二醛溶液加入明胶溶液中(戊二醛终浓度为0.1％)，混合均匀后将溶液倒入塑料培养皿中，放置于4℃的冰箱12小时使其成为凝胶。将6mL硝酸钙溶液滴加铺满凝胶表面后，将其置于4℃冰箱中扩散12小时，而后再将6mL磷酸溶液滴加铺满凝胶表面，在4℃冰箱中继续扩散12小时。其中，硝酸化钙溶液浓度为1.326mol/L，磷酸浓度为0.794mol/L，Ca：P＝1.67:1。

[0039] (3)去除凝胶表面的液体，将凝胶浸泡于15％氨水溶液3h。取出支架浸泡于0.1mol/L的精氨酸溶液以去除支架中残留的戊二醛，再用PBS、去离子水依次对凝胶进行洗涤，冷冻干燥得到三维多孔的仿生支架，孔径为100-300μm(见图1a)。支架中的羟基磷灰石粒子为分布均匀的球形颗粒，粒径为50-70nm(见图1b，c)。支架中纳米羟基磷灰石质量/明胶高分子质量比例为27％。

[0040] 实施例3

[0041] 选用明胶作为天然高分子原料，可溶性钙盐为氯化钙，0.25％的戊二醛为交联剂实施步骤如下：

[0042] (1)将1g明胶和18mL去离子水混合后放置于60℃水浴锅中搅拌30分钟，得到透明均一的明胶溶液，质量分数为5％。

[0043] (2)将溶液倒入塑料培养皿，放置于4℃冰箱2h使溶液固化成为胶体，取出培养皿中的胶体浸泡于20mLL浓度为0.25％的戊二醛溶液12小时。然后将6mL氯化钙溶液滴加铺满凝胶表面后，将其置于4℃冰箱中扩散6小时，而后再将6mL磷酸溶液滴加铺满凝胶表面，在4℃冰箱中继续扩散6小时。其中，氯化钙溶液浓度为1.32mol/L，磷酸浓度为0.794mol/L，Ca：P＝1.67:1。

[0044] (3)去除凝胶表面的液体，将凝胶浸泡于15％氨水溶液6h。取出支架浸泡于0.05mol/L的精氨酸溶液以去除支架中残留的戊二醛，再用PBS、去离子水依次对凝胶进行洗涤，冷冻干燥得到三维多孔的仿生支架。支架中的羟基磷灰石粒子为分布均匀的球形颗粒，粒径为200nm(见图1d)。

[0045] 实施例4

[0046] 选用明胶作为天然高分子原料，可溶性钙盐为氯化钙，不添加交联剂而通过明胶低温固化成胶，实施步骤如下：

[0047] (1)将0.6g明胶和18mL去离子水混合后放置于60℃水浴锅中加热搅拌30分钟，得到质量分数为3％的透明均一的明胶溶液。

[0048] (2)将明胶溶液倒入塑料培养皿中，放置于4℃的冰箱12小时使其低温固化成为凝胶。然后将6mL氯化钙溶液滴加铺满凝胶表面后，将其置于4℃冰箱中扩散2小时，而后再将6mL磷酸溶液滴加铺满凝胶表面，在4℃冰箱中继续扩散2小时。其中，氯化钙溶液浓度为
0.792mol/L，磷酸浓度为0.4764mol/L，Ca：P＝1.67:1。

[0049] (3)去除凝胶表面的液体，将凝胶浸泡于15％氨水溶液3h。用PBS、去离子水依次对凝胶进行洗涤，冷冻干燥得到三维多孔的仿生支架。

[0050] 实施例5

[0051] 选用明胶作为天然高分子原料，可溶性钙盐为氯化钙，京尼平为交联剂，实施步骤如下：

[0052] (1)将2g明胶和18mL去离子水混合后放置于60℃水浴锅中搅拌30分钟，得到透明均一的明胶溶液，质量分数为10％。

[0053] (2)将2mL质量分数为2.5％的京尼平溶液加入明胶溶液中(京尼平终浓度为0.25％)，混合均匀后将溶液倒入塑料培养皿中，放置于4℃的冰箱12小时使其成为凝胶。然后将12mL氯化钙溶液滴加铺满凝胶表面后，将其置于4℃冰箱中扩散2小时，而后再将12mL磷酸二氢钠溶液滴加铺满凝胶表面，在4℃冰箱中继续扩散12小时。其中，氯化钙溶液浓度为1.32mol/L,磷酸二氢钠浓度为0.794mol/L，Ca：P＝1.67:1。

[0054] (3)去除凝胶表面的液体，将凝胶浸泡于pH为8的氢氧化钠溶液3h。取出支架浸泡于0.05mol/L的精氨酸溶液以去除支架中残留的戊二醛，再用PBS、去离子水依次对凝胶进行洗涤，冷冻干燥得到三维多孔的仿生支架。

[0055] 实施例6

[0056] 选用胶原作为天然高分子原料，可溶性钙盐为氯化钙，京尼平为交联剂，实施步骤如下：

[0057] (1)冰浴条件下，在18mL质量分数为10％的胶原溶液中加入2mL浓度为2.5％的京尼平溶液，放置3小时成胶。

[0058] (2)将1.5mL氯化钙溶液滴加铺满凝胶表面后，将其置于4℃冰箱中扩散12小时，而后再将1.5mL磷酸溶液滴加铺满凝胶表面，在4℃冰箱中继续扩散2小时。其中，氯化钙溶液浓度为1.32mol/L,磷酸浓度为0.794mol/L，Ca：P＝1.67:1。

[0059] (3)去除凝胶表面的液体，将凝胶浸泡于20％氨水溶液3h，再用PBS、去离子水依次对凝胶进行洗涤，冷冻干燥得到三维多孔的仿生支架。

[0060] 实施例7

[0061] 选用巯基改性的透明质酸(HA-SH)为天然高分子原料，可溶性钙盐为氯化钙实施步骤如下：

[0062] (1)称取150mgHA-SH于去离子水中，振荡溶解形成均一溶液。用浓度为0.3mol/L的NaOH水溶液调节pH至7，室温下放置6h使溶液成胶。

[0063] (2)将1.5mL氯化钙溶液滴加铺满凝胶表面后，将其置于4℃冰箱中扩散6小时，而后再将1.5mL磷酸溶液滴加铺满凝胶表面，在4℃冰箱中继续扩散2小时。其中，氯化钙溶液浓度为0.66mol/L,磷酸浓度为0.397mol/L，Ca：P＝1.67:1。

[0064] (3)去除凝胶表面的液体，将凝胶浸泡于20％氨水溶液3h，再用PBS、去离子水依次对凝胶进行洗涤，冷冻干燥得到三维多孔的仿生支架。

[0065] 实施例8

[0066] 选用壳聚糖，可溶性钙盐为氯化钙，实施步骤如下：

[0067] (1)称取150mg壳聚糖于9mL去离子水中，振荡使其充分溶解，接着向溶液中加入1mL浓度为2.5％的戊二醛。混合均匀后将溶液倒入塑料培养皿中，放置于4℃的冰箱12小时使其成为凝胶。

[0068] (2)将1.5mL氯化钙溶液滴加铺满凝胶表面后，将其置于4℃冰箱中扩散2小时，而后再将1.5mL磷酸二氢钠溶液滴加铺满凝胶表面，在4℃冰箱中继续扩散6小时。其中，氯化钙溶液浓度为1.32mol/L，磷酸二氢钠浓度为0.794mol/L，Ca：P＝1.67:1。

[0069] (3)去除凝胶表面的液体，将凝胶浸泡于20％氨水溶液3h，再用PBS、去离子水依次对凝胶进行洗涤，冷冻干燥得到三维多孔的仿生支架。

[0070] 试验例一、细胞相容性试验

[0071] 1、试验对象：选取骨髓间充质干细胞(BMSCs)，由中国科学院典型培养保藏委员会细胞库(中国上海)提供。

[0072] 2、试验材料：实施例1制备的球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架。

[0073] 3、试验方法：

[0074] 将骨髓间充质干细胞(BMSCs)复苏，传代，增殖。取长势良好的BMSCs接种在实施例1制备的仿生复合支架上(75％乙醇灭菌)，材料与细胞共培养1、3、5天后，观察细胞的生长状况。

[0075] 4、试验结果如图2所示

[0076] 采用四唑盐比色试验(MTT)对仿生支架上的细胞增殖情况进行检测，体外材料于细胞共培养1、3、5天后，向孔板内加入0.5mg/mL MTT(200μL/孔)，37℃下孵育4h后弃去上清液，用PBS轻柔冲洗后，将材料转移到新的24孔板内，加入二甲基亚砜(DMSO)振荡使蓝色结晶产物溶解，然后在酶标仪上于490nm波长下测定溶液的吸光度。MTT检测结果，实施例3制备的球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架可以促进BMSCs的增殖，无明显抑制作用。试验结果表明，采用本发明提供的球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架对正常细胞无毒副作用。

[0077] 试验例二、动物体内植入评价材料的成骨活性

[0078] 1、试验材料：实施例3制备的球形纳米羟基磷灰石/天然高分子仿生支架。

[0079] 2、实验对象：SD大鼠3只，由四川大学华西实验动物中心提供。

[0080] 3、试验方法：选取3只健康的SD大鼠，在每只大鼠颅骨制造两个直径为5mm、高度为2mm的圆柱形缺损。在每个缺损处植入和缺损相同尺寸的样品，逐层缝合肌肉和皮肤。术后8周取材，样品经固定、脱水、透明、石蜡包埋等步骤制成5μm厚的石蜡切片，采用Masson三色染色观察材料的成骨性能。

[0081] 4、试验结果如图3所示。

[0082] 由Masson染色切片可以看出，在植入肌肉8周后，材料孔内有新生的骨组织生成，说明这种材料具有较好的骨再生能力，有良好的应用价值。

[0083] 上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。