一种天然多糖及祛斑美白用途

摘要

本发明公开了一种天然多糖及祛斑美白用途。黑色素是一种主要分布在人体表皮细胞和角质细胞中的高分子生物色素，决定了人的肤色和发色，但是当黑色素积累过多时，会引起色斑、雀斑、皮肤黑暗等问题。本发明提供了三种从冰凉花根茎中分离得到的多糖BLH‑1‑JZ、BLH‑2‑JZ、BLH‑3‑JZ，纯度高，并发现这三种多糖具有优异的祛斑美白活性(祛斑美白机理：抑制黑色素细胞的增殖、抑制黑色素细胞中的黑色素合成)。

权利要求

1.一种天然多糖，其特征在于，通过如下方法制备：

称取1kg干燥的冰凉花根茎，先用95％乙醇热回流脱脂3次，每次2h，再用8L去离子水于

85℃浸提3次，每次2h，合并水提液，过滤，浓缩至5L，静置24h后再次过滤，收集上清液，加入

5倍体积的95％乙醇，搅拌均匀后静置醇沉24h，以3000r/min的转速离心10min，收集沉淀，用3L去离子水复溶，重复醇沉1次，收集沉淀，Sevag法除蛋白，用截留分子量为7000u的透析袋透析48h，冷冻干燥得到粗多糖；其中，95％乙醇为体积百分浓度；

取粗多糖250mg溶于10mL去离子水，上样于内径4cm、柱床高度20cm的DEAE-Sepharose Fast Flow纤维素阴离子交换层析柱中，依次用0、0.1、0.2、0.3、0.5mol/LNaCl溶液洗脱，流速1mL/min，每管收集10mL，每种洗脱液收集30管，共编号1～150管，合并101～119管洗脱液，浓缩，用截留分子量为7000u的透析袋透析48h，冷冻干燥得到初步纯化多糖BLH-3-CB；

取初步纯化多糖BLH-3-CB 20mg溶于4mL去离子水，上样于内径2cm、柱床高度70cm的Sephacryl S-200HR凝胶柱中，用去离子水洗脱，流速0.5mL/min，每管收集5mL，收集40管，编号1～40管，合并17～24管洗脱液，浓缩，用截留分子量为7000u的透析袋透析48h，冷冻干燥即得，干燥、阴凉处保存。

说明书

一种天然多糖及祛斑美白用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种天然多糖及祛斑美白用途。

背景技术

[0002] 黑色素是一种主要分布在人体表皮细胞和角质细胞中的高分子生物色素，决定了人的肤色和发色(张慧瑛等，葡萄籽原花青素抑制小鼠B16-F0黑色素瘤细胞黑色素生成的影响，中药药理与临床，2017)，但是当黑色素积累过多时，不但会引起色斑、雀斑等问题，还有可能发生癌变，产生黑色素瘤。因此，可用来预防和治疗色素沉着和黑色素瘤等疾病的药物及化妆品研发受到研究人员的重视(李莉莉等，酪氨酸酶抑制剂的研究新进展，食品工业，2016)。

[0003] 多糖，是多羟基醛或多羟基醇及其衍生物形成的一类庞大的天然高分子体系，可用通式表示(C6H10O5)n。广布于动植物体内，可以分为均一多糖和不均一多糖。在植物体内，包括纤维素、淀粉等多聚糖。植物多糖由于其复杂的空间结构，具有特殊的结构和生物活性，形成了独特的构效关系。研究发现，有些植物多糖具有抗氧化衰老、降血糖血脂、免疫和促进记忆等多种药理性质，并生产出了一系列含有多糖的口服液、胶囊等产品。随着人们对美好生活的需要，人们越来越注重追求健康的功能性化妆品，越来越青睐天然来源，无毒副作用的植物天然产物化妆品以达到护肤美肤的目的。相比原始的或者含化学成分的化妆品，植物多糖表现出许多天然护肤生理活性，应用在化妆品中具有广阔的开发意义(阳赵艳等，植物多糖在化妆品中的应用，昭通学院学报，2018)。

[0004] 很多国内外品牌相继研发了含有植物多糖成分的化妆品。早在20世纪，法国品牌霏蜜早已成功将植物提取物多糖应用于其产品中。如该品牌的玻尿酸原液、芦荟原液和杜鹃花原液中的主要成分就是植物多糖。在我国，自古就会利用中草药配方来美容修颜。国内中草药配方佰草集，以中国传统药用植物提取枸杞多糖作为添加剂，配合茯苓、白芨等萃取精华，推出的保湿护肤霜、美白面膜深受大众青睐。同时，国内的众多品牌如百雀羚、韩束、阿芙等行业也在专注于对植物功能性产品的开发。特别是丸美品牌中的芦荟凝胶，近年来深受大众追捧。其主要配方为芦荟多糖，是一款兼具保湿、修复的产品(阳赵艳等，植物多糖在化妆品中的应用，昭通学院学报，2018)。

[0005] 目前，未见冰凉花根茎多糖的祛斑美白活性报道。

发明内容

[0006] 本发明目的在于提供一种天然多糖及祛斑美白用途。

[0007] 本发明目的通过如下技术方案实现：

[0008] 一种天然多糖，通过如下方法制备：

[0009] 称取冰凉花根茎，先用95％乙醇(体积百分浓度)热回流脱脂，再用去离子水加热浸提，水提液过滤、浓缩，静置再次过滤，收集上清液，加入5倍体积的95％乙醇(体积百分浓度)，搅拌均匀后静置醇沉，离心，收集沉淀，用去离子水复溶，重复醇沉1次，收集沉淀，Sevag法除蛋白，透析，冷冻干燥得到粗多糖；

[0010] 取粗多糖适量溶于10mL去离子水，上样于内径4cm、柱床高度20cm的DEAE-Sepharose Fast Flow纤维素阴离子交换层析柱中，依次用0、0.1、0.2、0.3mol/L NaCl溶液分别洗脱300mL，流速1mL/min，收集1010～1190mL洗脱液，浓缩，透析，冷冻干燥得到初步纯化多糖；

[0011] 取初步纯化多糖适量溶于4mL去离子水，上样于内径2cm、柱床高度70cm的Sephacryl S-200HR凝胶柱中，用去离子水洗脱，流速0.5mL/min，收集85～120mL洗脱液，浓缩，透析，冷冻干燥即得。

[0012] 优选地，热回流脱脂3次，每次2h。

[0013] 优选地，去离子水85℃浸提3次，每次2h。

[0014] 优选地，静置24h后再次过滤。

[0015] 优选地，搅拌均匀后静置醇沉24h。

[0016] 优选地，所述透析为用截留分子量为7000u的透析袋透析48h。

[0017] 有益效果：

[0018] 黑色素是一种主要分布在人体表皮细胞和角质细胞中的高分子生物色素，决定了人的肤色和发色，但是当黑色素积累过多时，会引起色斑、雀斑、皮肤黑暗等问题。本发明提供了三种从冰凉花根茎中分离得到的多糖BLH-1-JZ、BLH-2-JZ、BLH-3-JZ，纯度高，并发现这三种多糖具有优异的祛斑美白活性(祛斑美白机理：抑制黑色素细胞的增殖、抑制黑色素细胞中的黑色素合成)。

附图说明

[0019] 图1为粗多糖在DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱上的洗脱曲线；

[0020] 图2为初步纯化多糖BLH-1-CB在Sephacryl S-200HR层析柱的洗脱曲线；

[0021] 图3为初步纯化多糖BLH-2-CB在Sephacryl S-200HR层析柱的洗脱曲线；

[0022] 图4为初步纯化多糖BLH-3-CB在Sephacryl S-200HR层析柱的洗脱曲线；

[0023] 图5为精制多糖BLH-1-JZ的SEM扫描图；

[0024] 图6为精制多糖BLH-2-JZ的SEM扫描图；

[0025] 图7为精制多糖BLH-3-JZ的SEM扫描图。

具体实施方式

[0026] 下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。

[0027] 实施例1：多糖的制备方法

[0028] 一、实验方法

[0029] 1、粗多糖的制备

[0030] 称取1kg干燥的冰凉花根茎(采集自我国黑龙江省绥化市，洗净后于阴凉处风干，切段)，先用95％乙醇(体积百分浓度，下同)热回流脱脂3次，每次2h，再用8L去离子水于85℃浸提3次，每次2h，合并水提液，过滤，浓缩至5L，静置24h后再次过滤，收集上清液，加入5倍体积的95％乙醇，搅拌均匀后静置醇沉24h，离心(3000r/min×10min)，收集沉淀，用3L去离子水复溶，重复醇沉1次，收集沉淀，Sevag法除蛋白，透析48h(透析袋截留分子量为7000u)，冷冻干燥得到粗多糖。

[0031] 2、粗多糖的初步纯化

[0032] 取粗多糖250mg溶于10mL去离子水，上样于DEAE-Sepharose Fast Flow(4cm×20cm)纤维素阴离子交换层析柱中，依次用0、0.1、0.2、0.3、0.5mol/L NaCl溶液洗脱，流速
1mL/min，每管收集10mL，每种洗脱液收集30管，共编号1～150管，苯酚-硫酸法跟踪显色定性(490nm)，并根据定性结果绘制洗脱曲线，将同一色谱峰对应的各管洗脱液合并，浓缩，透析(透析袋截留分子量为7000u，透析48h)，冷冻干燥得到不同的初步纯化多糖。

[0033] 3、初步纯化多糖的精制

[0034] 分别取不同的初步纯化多糖20mg溶于4mL去离子水，上样于Sephacryl S-200HR(2cm×70cm)凝胶柱中，用去离子水洗脱，流速0.5mL/min，每管收集5mL，收集40管，编号1～40管，苯酚-硫酸法跟踪显色定性(490nm)，并根据定性结果绘制洗脱曲线，将同一色谱峰对应的各管洗脱液合并，浓缩，透析(透析袋截留分子量为7000u，透析48h)，冷冻干燥得到精制多糖，干燥、阴凉处保存。

[0035] 4、电子显微镜扫描(SEM)

[0036] 取适量精制多糖分散固定在金属样品台上，清除多余的不能被粘附在样品台上的粉末，使得样品台上保留一层薄薄的待测样品。将黏附有样品的样品台置于镀膜仪中镀金后，在扫描电子显微镜下观察样品的表面结构。

[0037] 二、实验结果

[0038] 1、粗多糖的初步纯化

[0039] 粗多糖初步纯化的洗脱曲线如图1所示，共出现4个主要的色谱峰，分别为0、0.1、0.2、0.3mol/L NaCl溶液主洗脱峰，其中，0mol/L NaCl溶液主洗脱峰的为双峰，应为多种多糖的混合，故暂不研究，0.1、0.2、0.3mol/L NaCl溶液主洗脱峰对应收集得到的初步纯化多糖(分别对应41～55管、68～81管、101～119管)依次命名BLH-1-CB、BLH-2-CB、BLH-3-CB为进行下一步研究。

[0040] 2、初步纯化多糖的精制

[0041] BLH-1-CB、BLH-2-CB、BLH-3-CB精制的洗脱曲线如图2～4所示，BLH-1-CB、BLH-2-CB、BLH-3-CB均只出现一个主洗脱峰，且吸收值高、峰形对称，说明精制效果好，纯度高，各主洗脱峰(BLH-1-CB对应收集13～21管、BLH-2-CB对应收集19～24管、BLH-3-CB对应收集17～24管)对应收集得到的精制多糖依次命名BLH-1-JZ、BLH-2-JZ、BLH-3-JZ。经苯酚-硫酸法测定，BLH-1-JZ、BLH-2-JZ、BLH-3-JZ的多糖含量分别为99.1％、97.5％、98.4％。

[0042] 3、SEM扫描分析

[0043] BLH-1-JZ、BLH-2-JZ、BLH-3-JZ的SEM扫描图如图5～7所示，可见BLH-1-JZ、BLH-2-JZ、BLH-3-JZ具有不同的固态表观形貌，分子规整性不同，支链化程度存在差异。

[0044] 实施例2：祛斑美白活性测试

[0045] 人A-375黑色素细胞常用于评价外界干预因素对人的祛斑美白的效果，观察指标包括对人A-375黑色素细胞的增殖抑制作用和人A-375黑色素细胞内黑色素合成的抑制作用等。

[0046] 一、实验材料

[0047] 多糖BLH-1-JZ、BLH-2-JZ、BLH-3-JZ按照实施例1方法制备，干燥、阴凉处保存。

[0048] 将人A-375黑色素细胞用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基(完全培养基)于5％CO2、37℃培养，当细胞生长至汇合度为85％左右时，胰酶消化传代。

[0049] 二、实验方法

[0050] 1、测定多糖对人A-375黑色素细胞的增殖抑制作用

[0051] 取对数生长期的人A-375黑色素细胞，用完全培养基调节细胞浓度为5×104个/mL，接种于96孔板，每孔加100μL，24h后给药组分别添加100μL含有不同浓度多糖BLH-1-JZ、BLH-2-JZ或BLH-3-JZ的完全培养基继续培养48h，同时设置添加空白完全培养基的对照组和含有不同浓度熊果苷的阳性药组，每组设置3个复孔。培养到时间节点后，离心弃上清，PBS洗涤，每孔加入5μg/mL的MTT溶液20μL，置于5％CO2、37℃孵育4h，弃上清，每孔加DMSO 150μL，室温振荡10min，在490nm波长下测量各孔吸光度值(OD值)，按照如下公式计算各孔黑素细胞抑制率(％)，并计算IC50值。

[0052] 黑色素细胞抑制率(％)＝(1-给药组OD值/对照组OD值)×100％。

[0053] 2、测定多糖对人A-375黑色素细胞中黑色素合成的抑制作用

[0054] 取对数生长期的人A-375黑色素细胞，用完全培养基调节细胞浓度为5×104个/mL，接种于96孔板，每孔加100μL，24h后给药组分别添加100μL含有不同浓度多糖BLH-1-JZ、BLH-2-JZ、BLH-3-JZ的完全培养基继续培养48h，同时设置添加空白完全培养基的对照组和含有不同浓度熊果苷的阳性药组，每组设置6个复孔。培养到时间节点后，离心弃上清，PBS洗涤，每组取3个复孔进行细胞计数，剩余3个复孔分别加1mol/L NaOH溶液150μL于85℃水浴保温裂解1h，在490nm波长下测量各孔吸光度值(OD值)，按照如下公式计算各孔黑色素细胞中黑色素合成抑制率(％)，并计算IC50值。黑色素合成抑制率(％)＝[1-(给药组OD值/细胞数量)/(对照组OD值/细胞数量)]×100％

[0055] 3、统计学方法

[0056] 采用SPSS 17.0进行统计学分析，数据以均值±标准偏差表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

[0057] 三、实验结果

[0058] 1、多糖对人A-375黑色素细胞的增殖抑制作用

[0059] 多糖BLH-1-JZ、BLH-2-JZ、BLH-3-JZ对人A-375黑色素细胞48h增殖抑制作用的IC50值如表1所示，该结果表明多糖BLH-1-JZ、BLH-2-JZ、BLH-3-JZ对人A-375黑色素细胞具有较强的抑制作用，且显著优于阳性药熊果苷。

[0060] 表1对人A-375黑色素细胞48h增殖抑制作用的IC50值

[0061]   IC50值(mg/mL)多糖BLH-1-JZ 4.75±0.42
多糖BLH-2-JZ 1.96±0.37
多糖BLH-3-JZ 5.59±0.46
阳性药 8.23±0.55

[0062] 2、多糖对人A-375黑色素细胞中黑色素合成的抑制作用

[0063] 多糖BLH-1-JZ、BLH-2-JZ、BLH-3-JZ对人A-375黑色素细胞中黑色素合成的48h抑制作用的IC50值如表2所示，该结果表明多糖BLH-1-JZ、BLH-2-JZ、BLH-3-JZ对人A-375黑色素细胞中黑色素的合成具有较强的抑制作用，多糖BLH-1-JZ和多糖BLH-2-JZ与阳性药熊果苷相当，多糖BLH-3-JZ显著优于阳性药熊果苷。

[0064] 表2对人A-375黑色素细胞48h抑制作用的IC50值

[0065]

[0066]

[0067] 上述实验结果表明，多糖BLH-1-JZ、BLH-2-JZ、BLH-3-JZ具有优异的祛斑美白活性，作用机理可能为抑制黑色素细胞增殖并抑制其黑色素合成。

[0068] 黑色素是一种主要分布在人体表皮细胞和角质细胞中的高分子生物色素，决定了人的肤色和发色，但是当黑色素积累过多时，会引起色斑、雀斑、皮肤黑暗等问题。本发明提供了三种从冰凉花根茎中分离得到的多糖BLH-1-JZ、BLH-2-JZ、BLH-3-JZ，纯度高，并发现这三种多糖具有优异的祛斑美白活性(祛斑美白机理：抑制黑色素细胞的增殖、抑制黑色素细胞中的黑色素合成)。

[0069] 以上实施例是为了具体介绍本发明实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明保护范围局限于具体实施例。