抗人ST2抗体及其用途

摘要

本申请公开了结合人ST2的抗体或其抗原结合部分，编码所述抗体或其抗原结合部分的多核苷酸、包含所述多核苷酸的载体、包含所述多核苷酸或载体的宿主细胞、制备和纯化该抗体的方法及所述抗体或其抗原结合部分的应用。

权利要求

1.一种结合人ST2的抗体，其包含含HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列的重链可变区和含LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列的轻链可变区，其中所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:36、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；

或者

所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；或者所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示；或者所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示；或者所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示；或者所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示；或者所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示；

其中HCDR和LCDR氨基酸序列根据Kabat定义。

2.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26、

27、28、29或者30所示。

3.根据权利要求1所述的抗体，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24或者25所示。

4.根据权利要求1所述的抗体，其中

所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或者所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或者所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或者所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或者所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体，其中所述抗体为全抗体、Fab片段、F(ab’)2片段或单链Fv片段(scFv)。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体，其中所述抗体为全人源抗体。

7.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。

8.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体，其中所述抗体还包含选自IgG1亚型、IgG2亚型或IgG4亚型的重链恒定区。

9.根据权利要求8所述的抗体，其中所述重链恒定区包含人IgG1亚型重链恒定区的Fc段序列并且所述Fc序列的第234、235和331位的氨基酸序列分别为F、E和S，其中抗体恒定区氨基酸序列顺序按照EU numbering来确定。

10.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体，其中所述抗体还包含选自κ亚型或者λ亚型的轻链恒定区。

11.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体，其中所述抗体能够结合SEQ ID NO:1所示的重组人ST2、SEQ ID NO:2所示的重组鼠ST2和SEQ ID NO:3所示的重组猴ST2。

12.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体，其中所述抗体能够结合SEQ ID NO:1所示的重组人ST2和SEQ ID NO:3所示的重组猴ST2。

13.根据权利要求1-4中任一项所述的抗体，其中所述抗体抑制人ST2与人IL-33结合。

14.核酸分子，其编码权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合部分。

15.药物组合物，其包含权利要求1-13中任一项所述的抗体和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

16.权利要求1-13中任一项所述的抗体或权利要求15所述的药物组合物在制备用于预防或治疗选自以下的疾病的药物中的用途：硬皮病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、Churg-Strauss综合征、韦格纳肉芽肿(Wegener’s granulomatosis)、过敏性肺炎、特应性皮炎、哮喘、鼻炎、克罗恩病、强直性脊柱炎、银屑病关节炎。

说明书

抗人ST2抗体及其用途

技术领域

[0001] 本申请大体涉及基因工程和抗体药物领域；具体而言，涉及抗人ST2抗体领域及其用途。本申请开发了新的抗人ST2抗体，并提供了该抗体在预防或治疗ST2介导的疾病中的用途。

背景技术

[0002] 生长刺激表达基因2蛋白(Growth Stimulation Expressed Gene 2，ST2)也被称为IL1RL1、T1、DER4或Fit-1，是IL-1受体家族的成员，属于Toll样受体(TLR)/IL-1R(TIR)超家族，是Th2淋巴细胞的选择标记，是Th2反应的重要的效应分子。ST2基因于1989年由Tominaga等人在研究BALB/c-3T3细胞系时首次被发现，其后很长一段时间一直被认为是孤儿受体，直到Schmitz等人发现了IL-33可特异性激活ST2，并证实其为ST2的功能配体。ST2有4种剪切变体，一种是跨膜蛋白ST2L，主要表达于肥大细胞、Th2淋巴细胞和嗜酸性粒细胞，与IL-1RAcP(也称IL-1R3)形成IL-33受体复合物；一种是短的分泌的剪切变体sST2，C端比ST2L胞外区多9个氨基酸残基，主要表达于胚胎组织、乳腺肿瘤和成纤维细胞，是IL-33的拮抗型伪受体，抑制IL-33介导的信号传导；第三种在胃、小肠和结肠中表达的功能尚不清楚的变体称为ST2V，只有第三个胞外Ig结构域与sST2不同；第四种ST2LV与ST2L相似，但是没有跨膜结构域。

[0003] IL-33(也称IL-1F11)是IL-1家族的细胞因子，IL-33主要在皮肤、肠、肺等屏障组织表达，主要存在于非造血细胞中，尤其是基质细胞、上皮细胞和内皮细胞。全长IL-33是核蛋白，发挥转录因子作用，N端有核定位序列和染色质结合结构域，细胞坏死会导致有功能的全长IL-33释放，而当有促炎因子刺激时全长IL-33经蛋白酶切割形成成熟的IL-33释放到胞外，发挥细胞因子功能。IL-33信号传递依赖于特异受体ST2和IL1-RAcP(IL-1receptor accessory protein)。IL-33结合ST2和IL-1RAcP形成三元信号复合物，募集MYD88(myeloid differentiation primary-response protein88)、IRAK(IL-1 receptor-associated kinase)、TRAF6(TNF receptor associated factor 6)和/或MAPK(mitogen-activated protein kinase)，激活下游信号分子如NF-κB(nuclear factor κB)、IκBα(inhibitor of NF-κB-α)、ERK(extracellular signal regulated kinase)、p38、JNK1(JUN N terminal kinase 1)和AP-1(activation protein 1)。在IL-33的作用下，表达ST2的Th2淋巴细胞分泌IL-5和IL-13，肥大细胞表达IL-4、IL-5和IL-6，角质细胞表达IL-6和TNFα，小神经胶质细胞表达大量促炎因子如TNFα、IL-1β和IL-10，趋化因子如CCL2、CCL3、CCL5和CXCL10，氧化应激分子NO和iNOS。

[0004] IL-33/ST2L信号通路在自身免疫性疾病和炎性疾病等中是不良因素，促进了疾病的发生发展。

[0005] 基于临床需求，探索和研发可以结合ST2分子的药物具有重要的生物学和医学意义。

[0006] 发明概述

[0007] 第一方面，本申请提供了一种结合人ST2的抗体，其包含含HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列的重链可变区和含LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列的轻链可变区，其中[0008] 所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:36、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；或者

[0009] 所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:
31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:
33所示；或者

[0010] 所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:
31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:
33所示；或者

[0011] 所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:
31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:
33所示；或者

[0012] 所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:
31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:
33所示；或者

[0013] 所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:
34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:
35所示；或者

[0014] 所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:
34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:
35所示；或者

[0015] 所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:
34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:
35所示；或者

[0016] 所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:
34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:
35所示；或者

[0017] 所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:
34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:
35所示；

[0018] 其中HCDR和LCDR氨基酸氨基酸序列根据Kabat定义。

[0019] 在一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸如SEQ ID NO:26、27、28、29或者30所示。

[0020] 在一些实施方案中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸如SEQ ID NO:24或者25所示。

[0021] 在一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者

[0022] 所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者

[0023] 所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者

[0024] 所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者

[0025] 所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者

[0026] 所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或者

[0027] 所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或者

[0028] 所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或者

[0029] 所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或者

[0030] 所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。

[0031] 第二方面，本申请提供了一种结合人ST2的抗体，其中所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:26、27、28、29和30中任何一项具有至少90％的一致性，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:24和25中任何一项具有至少90％的一致性。

[0032] 在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。

[0033] 在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体为全抗体、Fab片段、F(ab’)2片段或单链Fv片段(scFv)。

[0034] 在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体为全人源抗体。

[0035] 在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体还包含选自IgG1亚型、IgG2亚型或IgG4亚型的重链恒定区。

[0036] 在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体还包含选自κ亚型或者λ亚型的轻链恒定区。

[0037] 在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体能够结合重组人ST2(SEQ ID NO:1)、重组鼠ST2(SEQ ID NO:2)和重组猴ST2(SEQ ID NO:3)。

[0038] 在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体能够结合重组人ST2(SEQ ID NO:1)和重组猴ST2(SEQ ID NO:3)。

[0039] 在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体抑制人ST2与人IL-33结合。

[0040] 第三方面，本申请提供了核酸分子，其编码第一方面或第二方面所述的抗体或其抗原结合部分。

[0041] 第四方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面或第二方面所述的抗体和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

[0042] 在一些实施方案中，所述药物组合物用于预防或治疗ST2介导的疾病。

[0043] 在一些实施方案中，所述ST2介导的疾病为自身免疫疾病或炎性疾病，例如硬皮病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、Churg-Strauss综合征、韦格纳肉芽肿(Wegener’s granulomatosis)、肺出血-肾炎综合征、过敏性肺炎、特应性皮炎、哮喘、鼻炎、克罗恩病、强直性脊柱炎、风湿热、纤维肌痛、银屑病关节炎、慢性肾炎、斯耶格伦氏综合征以及多发性硬化等。

[0044] 第五方面，本申请提供了第一方面或第二方面所述的抗体在制备用于预防或治疗ST2介导的疾病的药物中的用途。

[0045] 在一些实施方案中，所述ST2介导的疾病为自身免疫疾病或炎性疾病，例如硬皮病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、Churg-Strauss综合征、韦格纳肉芽肿(Wegener’s granulomatosis)、肺出血-肾炎综合征、过敏性肺炎、特应性皮炎、哮喘、鼻炎、克罗恩病、强直性脊柱炎、风湿热、纤维肌痛、银屑病关节炎、慢性肾炎、斯耶格伦氏综合征以及多发性硬化等。

[0046] 第六方面，本申请提供了预防或治疗ST2介导的疾病的方法，包括向有需要的个体给予第一方面或第二方面所述的抗体或第四方面所述的药物组合物。

[0047] 在一些实施方案中，所述ST2介导的疾病为自身免疫疾病或炎性疾病，例如硬皮病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、Churg-Strauss综合征、韦格纳肉芽肿(Wegener’s granulomatosis)、肺出血-肾炎综合征、过敏性肺炎、特应性皮炎、哮喘、鼻炎、克罗恩病、强直性脊柱炎、风湿热、纤维肌痛、银屑病关节炎、慢性肾炎、斯耶格伦氏综合征以及多发性硬化等。

附图说明

[0048] 图1显示ELISA分析抗人ST2单克隆抗体S1A4抑制ST2与IL-33结合的能力。

[0049] 图2显示ELISA分析不同抗人ST2单克隆抗体抑制ST2与IL-33结合的能力。

[0050] 图3显示抗人ST2单克隆抗体基于HEK-BlueTM IL-33细胞阻断ST2活性的检测结果。

[0051] 图4显示抗人ST2单克隆抗体抑制IL-33与IL-12共刺激的PBMC分泌IFNγ的检测结果。

[0052] 图5显示ELISA分析重组抗hST2单克隆抗体与不同种属ST2的结合能力。

[0053] 序列说明

[0054] SEQ ID NO:1显示人(homo sapiens)ST2胞外区(h ST2)的氨基酸序列。

[0055] SEQ ID NO:2显示小鼠(mus musculus)ST2胞外区(m ST2)的氨基酸序列。

[0056] SEQ ID NO:3显示猕猴(Macaca mulatta)ST2胞外区(mm ST2)的氨基酸序列。

[0057] SEQ ID NO:4显示人(homo sapiens)IL-33胞外区(hIL-33)的氨基酸序列。

[0058] SEQ ID NO:5显示His标签(His)的氨基酸序列。

[0059] SEQ ID NO:6显示人(homo sapiens)IgG1抗体的Fc段(mFc1)的氨基酸序列。

[0060] SEQ ID NO:7显示小鼠(mus musculus)IgG2a抗体的Fc段(mFc)的氨基酸序列。

[0061] SEQ ID NO:8显示人(homo sapiens)IgG1亚型重链恒定区的氨基酸序列。

[0062] SEQ ID NO:9显示人(homo sapiens)IgG2亚型重链恒定区的氨基酸序列。

[0063] SEQ ID NO:10显示人(homo sapiens)IgG4亚型重链恒定区的氨基酸序列。

[0064] SEQ ID NO:11显示小鼠(mus musculus)IgG1亚型重链恒定区的氨基酸序列。

[0065] SEQ ID NO:12小鼠(mus musculus)IgG2a亚型重链恒定区的氨基酸序列。

[0066] SEQ ID NO:13显示人(homo sapiens)κ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。

[0067] SEQ ID NO:14显示人(homo sapiens)λ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。

[0068] SEQ ID NO:15显示小鼠(mus musculus)κ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。

[0069] SEQ ID NO:16显示小鼠(mus musculus)λ亚型轻链恒定区的氨基酸序列。

[0070] SEQ ID NO:17显示全人源单链抗体S1A4的氨基酸序列。

[0071] SEQ ID NO:18显示全人源单链抗体S1A4的重链可变区(S1A4 VH)的氨基酸序列。

[0072] SEQ ID NO:19显示全人源单链抗体S1A4的轻链可变区(S1A4 VK)的氨基酸序列。

[0073] SEQ ID NO:20显示抗人ST2对照抗体MSTT1041A的重链可变区(MSTT1041A VH)氨基酸序列。

[0074] SEQ ID NO:21显示抗人ST2对照抗体MSTT1041A的轻链可变区(MSTT1041A VK)氨基酸序列。

[0075] SEQ ID NO:22显示抗人ST2对照抗体GSK3772847的重链可变区(GSK3772847 VH)氨基酸序列。

[0076] SEQ ID NO:23显示抗人ST2对照抗体GSK3772847的轻链可变区(GSK3772847 VK)氨基酸序列。

[0077] SEQ ID NO:24显示轻链可变区突变体L1D1的氨基酸序列，其CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33所示。

[0078] SEQ ID NO:25显示轻链可变区突变体L2G2的氨基酸序列，其CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:35所示。

[0079] SEQ ID NO:26显示重链可变区突变体H5E10的氨基酸序列，其CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:43所示。

[0080] SEQ ID NO:27显示重链可变区突变体H5G3的氨基酸序列，其CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37和SEQ ID NO:38所示。

[0081] SEQ ID NO:28显示重链可变区突变体H5G10的氨基酸序列，其CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40和SEQ ID NO:41所示。

[0082] SEQ ID NO:29显示重链可变区突变体H6D3的氨基酸序列，其CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:45所示。

[0083] SEQ ID NO:30显示重链可变区突变体H6D6的氨基酸序列，其CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:47所示。

[0084] SEQ ID NO:48显示人(homo sapiens)IL-12α的氨基酸序列。

[0085] SEQ ID NO:49显示人(homo sapiens)IFNγ的氨基酸序列。

[0086] 发明详细描述

[0087] 本申请的发明人通过抗体工程技术得到了新的抗人ST2抗体。在本申请的多个方面，提供了新的抗人ST2抗体或其抗原结合片段，编码该抗体或其抗原结合片段的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、包含所述核酸分子或载体的宿主细胞、制备和纯化该抗体的方法及所述抗体或其抗原结合片段的医学和生物学应用。根据本申请提供的抗体的可变区的序列，可构建全长的抗体分子作为药物用于治疗临床上由ST2介导的疾病。

[0088] 除非另外指明，本申请的实施采用本领域常规的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学以及免疫学技术。

[0089] 除非另外指明，本申请中所用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。

[0090] 定义

[0091] 如本文所用术语“抗体”，是指能够经由至少一个位于免疫球蛋白分子的可变区中的抗原识别位点特异性结合到标靶的免疫球蛋白分子。标靶包括但不限于碳水化合物、多聚核苷酸、脂质、多肽等。本文所使用的“抗体”不仅包括完整的(即全长的)抗体，而且还包括其抗原结合片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、其变异体、包含抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及任何其他包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的修改配置，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体及共价修饰的抗体。

[0092] 通常，完整或全长的抗体包含两个重链和两个轻链。每个重链含有重链变异区(VH)和第一、第二及第三恒定区(CH1、CH2及CH3)。每个轻链含有轻链变异区(VL)和恒定区(CL)。全长的抗体可以是任何种类的抗体，例如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或上述的子类)，但抗体不需要属于任何特定的类别。根据重链的恒定域的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白指定为不同的类别。通常，免疫球蛋白有五种主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，而且这些类别中有几个可以再被进一步区分成子类(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。对应于不同免疫球蛋白类别的重链恒定域分别称为α、δ、ε、γ、以及μ。不同类别的免疫球蛋白的子单元结构和三维结构是公知的。

[0093] 如本文所用术语“抗原结合片段或抗原结合部分”，是指负责结合抗原的完整抗体分子的一部分或区域。抗原结合域可以包含重链变异区(VH)、轻链变异区(VL)或上述两者。VH和VL中的每个通常含有三个互补决定区CDR1、CDR2及CDR3。

[0094] 本领域技术人员公知，互补决定区(CDR，通常有CDR1、CDR2及CDR3)是可变区中对抗体的亲和力和特异性影响最大的区域。VH或VL的CDR序列有两种常见的定义方式，即Chothia定义和kabat定义。(参阅例如Kabat,“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，National Institutes of Health,Bethesda，Md.(1991)；A1-Lazikani等人，J.Mol.Biol.273:927-948(1997)；以及Martin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9268-9272(1989)。对于给定抗体的可变区序列，可以根据Chothia定义或者Kabat定义来确定VH和VL序列中的CDR序列。在本申请的实施方案中，利用Chothia定义CDR序列。

[0095] 对于给定抗体的可变区序列，可以通过多种方式分析可变区序列的中CDR序列，例如可以利用在线软件Abysis确定(http://www.abysis.org/)。

[0096] 抗原结合片段的实例包括但不限于：(1)Fab片段，其可以是具有VL-CL链和VH-CH1链的单价片段；(2)F(ab')2片段，其可以是具有两个Fab'片段的二价片段，该两个Fab'片段由铰链区的二硫桥(即Fab'的二聚物)连接；(3)具有抗体的单臂的VL和VH域的Fv片段；(4)单链Fv(scFv)，其可以是由VH域和VL域经由胜肽连接符组成的单一多胜肽链；以及(5)(scFv)2，其可以包含两个由胜肽连接符连接的VH域和两个VL域，该两个VL域是经由二硫桥与该两个VH域组合。

[0097] 在本文描述抗体结构时，涉及氨基酸位置编号的描述参照人IgG1抗体的EU numbering定义，这是本领域技术人员公知且容易查询到的。此外，在本文结合EU numbering位置描述突变时，是指相对于天然抗体序列产生的突变。

[0098] 如本文所用术语“Fc片段”、“Fc结构域”、“Fc部分”或类似的术语是指抗体重链恒定区的一部分，包括铰链区(hinge)、恒定区的CH2片段和CH3片段。参照人IgG1抗体的EU numbering定义，Fc片段是抗体恒定区中第216-447位的氨基酸序列。

[0099] 如本文所用术语“特异性结合”，是指两个分子之间的非随机结合反应，例如抗体至抗原表位的结合。

[0100] 如本文所用术语“单克隆抗体”指由基本同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能在少量个体中存在自然发生的突变以外，组成群体的各个抗体是相同的。本文所述单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与来源于具体物种或属于具体抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，而重链和/或轻链的余下部分与来源于另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的对应序列相同或同源，并且还包括这样的抗体的片段，只要它们能表现出所期望的生物学活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984)。

[0101] 如本文所用术语“自身免疫病”是指自机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，包括但不限于硬皮病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、Churg-Strauss综合征、韦格纳肉芽肿(Wegener’s granulomatosis)和肺出血-肾炎综合征等。

[0102] 如本文所用术语“炎性疾病”是指炎症作为其主要破坏因子的疾病的统称。炎症为组织对有害刺激的生物反应，其是一种病变，并且伴随有组织退化、循环紊乱和液体渗出三种事件，以及肥大。炎性疾病的实例包括急性和慢性疾病，包括但不限于过敏性肺炎、特应性皮炎、哮喘、鼻炎、克罗恩病、强直性脊柱炎、风湿热、纤维肌痛、银屑病关节炎、慢性肾炎、斯耶格伦氏综合征以及多发性硬化等。

[0103] 第一方面，本申请提供了一种结合人ST2的抗体，其包含含HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列的重链可变区和含LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列的轻链可变区，其中[0104] 所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:36、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示；或者

[0105] 所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示，所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:
31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:
33所示；或者

[0106] 所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:
31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:
33所示；或者

[0107] 所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:
31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:
33所示；或者

[0108] 所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:
31所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:
33所示；或者

[0109] 所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:38所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:
34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:
35所示；或者

[0110] 所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:40所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:
34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:
35所示；或者

[0111] 所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:
34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:
35所示；或者

[0112] 所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:44所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:
34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:
35所示；或者

[0113] 所述HCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示、所述HCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:42所示、所述HCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:47所示、所述LCDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:
34所示、所述LCDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示、所述LCDR3氨基酸序列如SEQ ID NO:
35所示；其中HCDR和LCDR氨基酸氨基酸序列根据Kabat定义。

[0114] 在一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸如SEQ ID NO:26、27、28、29或者30所示。

[0115] 在一些实施方案中，所述抗体的轻链可变区的氨基酸如SEQ ID NO:24或者25所示。

[0116] 在一些实施方案中，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者

[0117] 所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者

[0118] 所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者

[0119] 所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者

[0120] 所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示；或者

[0121] 所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或者

[0122] 所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或者

[0123] 所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或者

[0124] 所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示；或者

[0125] 所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示。

[0126] 第二方面，本申请提供了一种结合人ST2的抗体，其中所述抗体的重链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:26、27、28、29和30中任何一项具有至少90％的一致性，并且所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列与SEQ ID NO:24和25中任何一项具有至少90％的一致性。

[0127] 在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。

[0128] 在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体为全抗体、Fab片段、F(ab’)2片段或单链Fv片段(scFv)。

[0129] 在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体为全人源抗体。

[0130] 在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体还包含选自IgG1亚型、IgG2亚型或IgG4亚型的重链恒定区。

[0131] 在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体的重链恒定区可以是人IgG1亚型、人IgG2亚型、人IgG4亚型、鼠IgG1亚型或鼠IgG2a亚型。

[0132] 在第一方面和第二方面的一些具体实施方案中，所述重链恒定区为IgG4亚型。

[0133] 在第一方面和第二方面的一些具体实施方案中，所述抗体的重链恒定区包含人IgG1亚型重链恒定区的Fc段序列并且所述Fc序列的第234、235和331位的氨基酸序列分别为F、E和S，其中抗体恒定区氨基酸序列顺序按照EU numbering来确定。

[0134] 在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体还包含选自κ亚型或者λ亚型的轻链恒定区。

[0135] 在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体的轻链恒定区可以是人κ亚型、人λ亚型、鼠κ亚型或者鼠λ亚型。

[0136] 在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体能够结合重组人ST2(SEQ ID NO:1)、重组鼠ST2(SEQ ID NO:2)和重组猴ST2(SEQ ID NO:3)。

[0137] 在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体能够结合重组人ST2(SEQ ID NO:1)和重组猴ST2(SEQ ID NO:3)。

[0138] 在第一方面和第二方面的一些实施方案中，所述抗体抑制人ST2与人IL-33结合。

[0139] 第三方面，本申请提供了核酸分子，其编码第一方面或第二方面所述的抗体或其抗原结合部分。

[0140] 在一些实施方案中，所述核酸分子可操作地连接到调控序列，调控序列可以被用所述载体转化过的宿主细胞识别。

[0141] 第四方面，本申请提供了药物组合物，其包含第一方面或第二方面所述的抗体和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。

[0142] 在一些实施方案中，所述药物组合物用于预防或治疗ST2介导的疾病。

[0143] 在一些实施方案中，所述ST2介导的疾病为自身免疫疾病或炎性疾病，例如硬皮病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、Churg-Strauss综合征、韦格纳肉芽肿(Wegener’s granulomatosis)、肺出血-肾炎综合征、过敏性肺炎、特应性皮炎、哮喘、鼻炎、克罗恩病、强直性脊柱炎、风湿热、纤维肌痛、银屑病关节炎、慢性肾炎、斯耶格伦氏综合征以及多发性硬化等。

[0144] 在一些实施方案中，所述药物组合物还可包含下述中的一种或多种：润滑剂，如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂；悬浮剂；防腐剂，如苯甲酸、山梨酸和丙酸钙；增甜剂和/或调味剂等。

[0145] 在一些实施方案中，可将本申请中的药物组合物配制为片剂、丸剂、粉剂、锭剂、酏剂、悬液、乳剂、溶液、糖浆、栓剂或胶囊等形式。

[0146] 在一些实施方案中，可以利用任何生理上可接受的给药方式递送本申请的药物组合物，这些给药方式包括但不限于：口服给药、肠胃外给药、经鼻给药、直肠给药、腹膜内给药、血管内注射、皮下给药、经皮给药、吸入给药等。

[0147] 在一些实施方案中，可以通过混合具有所需纯度的试剂与视情况的药学上可接受的载体、赋形剂等，以冻干制剂或水溶液的形式配制用于治疗用途的药物组合物用于存储。

[0148] 第五方面，本申请提供了第一方面或第二方面所述的抗体在制备用于预防或治疗ST2介导的疾病的药物中的用途。

[0149] 在一些实施方案中，所述ST2介导的疾病为自身免疫疾病或炎性疾病，例如硬皮病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、Churg-Strauss综合征、韦格纳肉芽肿(Wegener’s granulomatosis)、肺出血-肾炎综合征、过敏性肺炎、特应性皮炎、哮喘、鼻炎、克罗恩病、强直性脊柱炎、风湿热、纤维肌痛、银屑病关节炎、慢性肾炎、斯耶格伦氏综合征以及多发性硬化等。

[0150] 第六方面，本申请提供了预防或治疗ST2介导的疾病的方法，包括向有需要的个体给予第一方面或第二方面所述的抗体或第四方面所述的药物组合物。

[0151] 在一些实施方案中，所述ST2介导的疾病为自身免疫疾病或炎性疾病，例如硬皮病、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、Churg-Strauss综合征、韦格纳肉芽肿(Wegener’s granulomatosis)、肺出血-肾炎综合征、过敏性肺炎、特应性皮炎、哮喘、鼻炎、克罗恩病、强直性脊柱炎、风湿热、纤维肌痛、银屑病关节炎、慢性肾炎、斯耶格伦氏综合征以及多发性硬化等。

[0152] 在其他方面，本申请还提供编码本发明抗体或其轻链或重链的分离的核酸分子以及包含所述核酸分子的载体、包含所述载体的宿主细胞以及产生所述抗体的方法。在一些实施方案中，所述核酸分子可操作地连接到调控氨基酸序列，调控氨基酸序列可以被用所述载体转化过的宿主细胞识别。在一些实施方案中，产生抗体的方法包括培养宿主细胞以便于表达核酸。在一些实施方案中，产生抗体的方法还包括从宿主细胞培养基中回收抗体。

[0153] 此外，本文所述的特异性结合人ST2的抗体也可用于检测生物样品中ST2的存在。基于抗体的检测方法在本领域是众所周知的，并且包括例为ELISA、免疫印迹、放射免疫试验、免疫荧光、免疫沉淀以及其它相关技术。

[0154] 应当理解，以上详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。实施例

[0155] 以下实施例仅用于说明而非限制本申请范围的目的。

[0156] 实施例1：噬菌体展示抗体库的构建

[0157] 具体实验流程可参见中国专利申请第201610609651.X号的实施例1以及中国专利申请第201510097117.0号的实施例1，通过引用方式将上述两篇专利申请的全部内容并入本文。

[0158] 实施例2：重组蛋白的制备

[0159] 制备抗ST2单克隆抗体的过程中需要用到多种不同的重组蛋白，包括人ST2胞外区(hST2，SEQ ID NO:1)、小鼠ST2胞外区(mST2，SEQ ID NO:2)、猕猴ST2胞外区(mmST2，SEQ ID NO:3)以及人IL-33胞外区(hIL-33，SEQ ID NO:4)。这些蛋白具有大量的翻译后修饰(如糖基化或者二硫键等)，因而利用哺乳动物细胞表达系统将更有利于保持重组蛋白的结构和功能。此外，在这些重组蛋白的C端添加了His标签(His，SEQ ID NO:5)或者人抗体IgG1的Fc段(hFc，SEQ ID NO:6)或者鼠抗体IgG2a的Fc段(mFc，SEQ ID NO:7)，将更有利于重组蛋白的纯化和单克隆抗体功能的鉴定。抗体重链恒定区可以是人IgG1亚型(SEQ ID NO:8)、人IgG2亚型(SEQ ID NO:9)、人IgG4亚型(SEQ ID NO:10)或者鼠IgG1亚型(SEQ ID NO:11)、鼠IgG2a亚型(SEQ ID NO:12)，轻链恒定区可以是人κ亚型(SEQ ID NO:13)、人λ亚型(SEQ ID NO:14)或者鼠κ亚型(SEQ ID NO:15)、鼠λ亚型(SEQ ID NO:16)。

[0160] 根据Uniprot数据库的各种目的重组蛋白的氨基酸序列，设计并合成上述各种重组蛋白的基因(包含His标签或者hFc、mFc编码基因)。利用常规的分子生物学技术将合成的各种重组蛋白基因克隆至合适的真核表达载体(如invitrogen公司的pcDNA3.1等)，然后利用脂质体(如invitrogen公司的293fectin等)或者其他阳离子转染试剂(如PEI等)将制备的重组蛋白表达质粒转染入HEK293细胞(如invitrogen公司的HEK293F)，在无血清悬浮培养条件下培养3-4天。然后通过离心等方式收获培养上清。

[0161] His标签融合表达的重组蛋白利用金属螯合亲和层析柱(如GE公司的HisTrap FF等)对培养上清中的重组蛋白进行一步纯化。hFc和mFc融合表达的重组蛋白用ProteinA/G亲和层析柱(如GE公司的Mabselect SURE等)进行一步纯化。然后利用脱盐柱(如GE公司的Hitrap desaulting等)将重组蛋白保存缓冲液置换为PBS(pH7.0)或者其他合适的缓冲液。必要时，可以对抗体样品进行过滤除菌，然后分装保存于-20℃。

[0162] 实施例3：利用噬菌体展示抗体库技术筛选抗人ST2单克隆抗体

[0163] 3.1抗人ST2单克隆抗体的筛选

[0164] 以实施例2制备的重组人ST2-his为抗原，利用固相筛选策略(实验方案参考噬菌体展示：通用实验指南/(美)克拉克森(Clackson,T.),(美)洛曼(Lowman,H.B.)编；马岚等译。化学工业出版社，2008.5)筛选实施例1制备的展示人单链抗体库的噬菌体库，最终获得1株特异性结合人ST2的全人源单链抗体S1A4。

[0165] 3.2制备全人源抗体

[0166] 利用常规的分子生物学手段，将编码S1A4的重链可变区(S1A4 VH，SEQ ID NO:18)和轻链可变区(S1A4 VK，SEQ ID NO:19)的核酸分子分别克隆至融合有编码人重链恒定区和轻链恒定区的核酸分子的真核表达载体，组合表达全抗体。同时，参照专利US9382318B2和US9090694B2，分别制备阳性对照抗体MSTT1041A(MSTT1041A VH，SEQ ID NO:20；MSTT1041A VK，SEQ ID NO:21)和GSK3772847(GSK3772847 VH，SEQ ID NO:22；GSK3772847 VK，SEQ ID NO:23)以用于研究。

[0167] 3.3 S1A4抑制重组人IL-33与重组人ST2结合

[0168] 将重组蛋白hST2-his包被于96孔板(1μg/mL，100μl/孔)，4℃包被过夜。然后用含有0.5μg/mL重组蛋白hIL33-mFc的PBST-2％牛奶对抗体S1A4、MSTT1041A和GSK3772847进行梯度稀释。抗体的起始浓度均为200μg/mL，3倍梯度稀释，共9个浓度梯度。利用HRP山羊抗鼠IgG((中杉金桥，ZB2305)检测hIL33-mFc的结合信号，然后利用GraphPad Prism 6进行数据分析和作图。ELISA分析结果(图1)显示，S1A4能够有效抑制ST2与IL-33的结合，并且抑制能力与对照抗体MSTT1041A和GSK3772847相当，各抗体的IC50值如表1所示。其中，S1A4、MSTT1041A和GSK3772847的重链恒定区为IgG4亚型。

[0169] 表1.S1A4抑制ST2与IL33结合的IC50值

[0170]  S1A4-IgG4 MSTT1041A-IgG4 GSK3772847-IgG4
IC50(nM) 4.149 3.794 5.524

[0171] 3.4 S1A4亲和力测定

[0172] 利用Biacore X100通过表面等离子共振技术测定抗ST2抗体的亲和力。氨基偶联试剂盒(BR-1000-50)、人抗体捕获试剂盒(BR-1008-39)、CM5芯片(BR100012)和pH7.4的10×HBS-EP(BR100669)等相关试剂和耗材均购自GE healthcare。依照试剂盒中的说明书，用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride，EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(N-Hydroxysuccinimide，NHS)对羧基化CM5芯片表面进行活化，将抗人IgG(Fc)抗体(捕获抗体)用10mM pH5.0乙酸钠溶液稀释至25μg/mL，之后以流速10μL/min注射以实现大约多至10000个响应单位(RU)的偶联量。
注射捕获抗体之后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，稀释抗ST2抗体至0.5-1μg/mL，10μL/min注射，保证100RU左右的抗体被抗人Fc的抗体捕获。然后将hST2-his设置一系列的浓度梯度(例如0.625nM、1.25nM、2.5nM、5nM、10nM)，于25℃下30μL/min从低浓度到高浓度进行注射，结合时间为120s，解离时间为1800s，以10μL/min注射3M的MgCl2溶液30s对芯片表面进行再生。使用Biacore X100评估软件2.0.1版，通过1:1结合模型拟合结合和解离传感图来计算结合速率(Kon)和解离速率(Koff)。以比率Koff/Kon计算解离平衡常数(KD)，拟合结果如表2所示。

[0173] 表2.S1A4结合ST2的亲和力常数

[0174]  Kon Koff KD
S1A4-IgG4 1.646*10E6 2.215*10E-4 1.346*10E-10
MSTT1041A-IgG4 3.941*10E5 9.452*10E-5 2.398*10E-10
GSK3772847-IgG4 1.979*10E6 2.159*10E-4 1.091*10E-10

[0175] 实施例4 S1A4的亲和力成熟

[0176] 4.1轻链置换

[0177] 基于双载体噬菌体呈现系统，以单克隆抗体S1A4的重链可变区(S1A4VH)为基础，利用轻链置换(实验技术流程可参见中国专利第201510097117.0号中的实施例4)对抗体S1A4进行体外亲和力成熟，获得了两个高亲和力轻链可变区突变体L1D1(氨基酸序列为SEQ ID NO:24)和L2G2(氨基酸序列为SEQ ID NO:25)。

[0178] 4.2轻链突变体亲和力测定

[0179] 参照实施例3.2将编码S1A4的重链可变区(S1A4VH，SEQ ID NO:18)和轻链可变区突变体L1D1(S1A4VK，SEQ ID NO:24)或L2G2(氨基酸序列为SEQ ID NO:25)的核酸序列分别克隆至融合有编码人重链恒定区和轻链恒定区核酸序列的真核表达载体，组合表达全抗体S1A4VH+L1D1和S1A4VH+L2G2。参照实施例3.4，利用Biacore X100对S1A4新轻链可变区进行亲和力分析，结果如表3所示。其中，S1A4、S1A4VH+L1D1和S1A4VH+L2G2的重链恒定区为IgG4亚型。

[0180] 表3.轻链突变体结合ST2的亲和力常数

[0181]  Kon Koff KD
S1A4 1.862E+6 1.892E-4 1.106E-10
S1A4VH+L1D1 2.365E+6 3.59E-4 1.518E-10
S1A4VH+L2G2 2.45E+6 1.944E-4 7.935E-11

[0182] 4.3 S1A4重链突变库的筛选

[0183] 利用常规分子生物学手段，通过在重链S1A4VH的CDR3区引入突变，构建基于重链可变区S1A4VH的CDR3突变库，设计的突变方案如表4所示。基于双载体呈现系统(实验技术流程可参见中国专利申请第201510097117.0号中的实施例5)，通过固相筛选的方法，利用hST2-His抗原对构建的S1A4VH-CDR3突变库进行共3轮筛选富集。收集富集得到的第3轮突变库产物，吸取1OD菌液利用天根生物无内毒素质粒大提试剂盒(#DP117)提取质粒。以提取的质粒为模板，设计引物扩增S1A4VH-CDR3突变库的FR3-FR4部分序列备用，以构建的天然人抗体库可变区重链基因为模板(参见中国专利申请第201510097117.0号中的实施例1)，设计引物扩增人重链胚系基因的FR1-FR3部分序列备用。以PCR扩增制备的S1A4VH的FR3-FR4序列和人重链胚系基因的FR1-FR3序列为模板，利用重叠延伸PCR(Overlap PCR)的方法扩增构建基于S1A4VH-CDR3突变体和人重链胚系基因的组合库，构建库容1.5×10E8，正确率为80％。用于组合库设计的扩增引物如下表5、表6所示。

[0184] 表4.基于S1A4重链可变区VH的CDR3突变库的突变方案

[0185]

[0186]

[0187] 表5.扩增S1A4VH-CDR3突变库的FR3-FR4部分序列所需引物

[0188] 引物名称 引物序列PWM34-C1-CDR3-F11a ACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGATA
PWM34-C1-HCDR3R12 GGTGACCAGTGTGCCCTGGCCCCAG

[0189] 表6.扩增重链天然胚系基因FR1-FR3部分序列所需引物

[0190]引物名称 引物序列
PhVH1F11a CAGGTTCAGCTGGTGCAGTC
PhVH1F11b CAGGTGCAGCTGGTGCAGTC
PhVH1F11c CARATGCAGCTGGTGCAGTC
PhVH1F11d SAGGTCCAGCTGGTACAGTC
PhVH1F11e CAGGTCCAGCTTGTGCAGTC
PhVH1R13a CTCAGCTCCATGTAGGCTGTG
PhVH1R13b GCTCAGCTCCATGTAGACTGTG

[0191] 基于双载体噬菌体展示系统，用hST2-his抗原对上述组合库进行筛选，最终得到5个重链可变区突变体H5E10(SEQ ID NO:26)、H5G3(SEQ ID NO:27)、H5G10(SEQ ID NO:28)、H6D3(SEQ ID NO:29)、H6D6(SEQ ID NO:30)。

[0192] 4.4 S1A4突变体亲和力测定

[0193] 参照实施例3.2将编码重链可变区突变体H5E10(氨基酸序列为SEQ ID NO:26)、H5G3(氨基酸序列为SEQ ID NO:27)、H5G10(氨基酸序列为SEQ ID NO:28)、H6D3(氨基酸序列为SEQ ID NO:29)或H6D6(氨基酸序列为SEQ ID NO:30)和轻链可变区突变体L2G2(氨基酸序列为SEQ ID NO:25)的核酸分子分别克隆至融合有编码人重链恒定区和轻链恒定区核酸分子的真核表达载体，组合表达全抗体。参照实施例3.4，利用Biacore X100对S1A4突变体进行亲和力分析，结果如表7所示。其中，S1A4、H5G3+L2G2、H5E10+L2G2、H5G10+L2G2、H6D3+L2G2和H6D6+L2G2的重链恒定区为IgG4亚型。

[0194] 表7.S1A4突变体结合ST2的亲和力常数

[0195]   Kon Koff KDS1A4 1.991*10E6 2.76*10E-4 1.386*10E-10
H5G3+L2G2 1.018*10E6 1.116*10E-4 1.146*10E-10
H5E10+L2G2 3.354*10E6 2.378*10E-3 7.091*10E-10
H5G10+L2G2 4.203*10E6 3.581*10E-4 8.522*10E-11
H6D3+L2G2 3.342*10E6 1.245*10E-4 3.726*10E-11
H6D6+L2G2 2.569*10E6 1.785*10E-3 6.949*10E-10

[0196] 实施例5抗人ST2单克隆抗体竞争IL-33结合ST2

[0197] 分析不同抗人ST2单克隆抗体(H5G3+L2G2、H5E10+L2G2、H5G10+L2G2、H6D3+L2G2、H6D6+L2G2和H5G3+L1D1)抑制ST2和IL33结合的能力。

[0198] 将重组蛋白hST2-Fc包被于96孔板(3μg/mL，100μl/孔)，4℃包被过夜。然后用含有0.4μg/mL重组蛋白hIL33-his的PBST-2％牛奶对各抗ST2抗体蛋白(IgG4亚型)进行梯度稀释。抗体的起始浓度为50μg/mL，3倍梯度稀释，共10个浓度梯度。利用HRP鼠抗his IgG(康为世纪，CW0285M)检测IL33-his的结合信号，然后利用GraphPad Prism 6进行数据分析和作图。ELISA分析结果(图2)显示不同抗ST2单克隆抗体都能够有效抑制IL33与ST2的结合，各抗体的IC50值如表8所示。

[0199] 表8.抗ST2抗体抑制ST2与IL33结合的IC50值

[0200]

[0201] 实施例6抗人ST2单克隆抗体基于HEK-BlueTM IL-33细胞阻断ST2的作用

[0202] 用IL-33刺激HEK-BlueTM IL-33细胞(InvivoGen)，激活NF-κB和AP-1信号通路，启动细胞表达分泌型碱性磷酸酶(SEAP)，通过检测抗体对SEAP表达水平的影响可以判断抗ST2抗体的阻断作用。HEK-BlueTM IL-33细胞表达ST2L，是对人HEK细胞转入IL1RL1基因得到的，同时整合了IFN-β小启动子控制的SEAP报告基因，启动子融合了5个NF-κB和5个AP-1结合位点。HEK-BlueTM IL-33细胞同时阻断TNF-α和IL-1β应答，从而使HEK-BlueTM IL-33细胞只对IL-33产生应答反应。HEK细胞表达内源性IL-1RAcP。

[0203] 用测试培养基(DMEM+10％FBS+1％P.S.+100μg/mLNormocin)配制60pM的hIL-33(GenScript，Z03198)溶液，用该溶液对抗人ST2单克隆抗体(MSTT1041A、GSK3772847、H5G3+L2G2、H5G10+L2G2、H5G10+L1D1和H5G3+L1D1)进行系列稀释(抗体浓度梯度分别为1、4、16、64、256、1024、4096、16384、65536、262144pM)，抗体溶液与等体积HEK-Blue IL-33细胞(细胞密度5×105个/mL)混合，接种96孔细胞板，每孔200μL，细胞板置于CO2培养箱于37℃正常培养。23小时后细胞板1200rpm离心5分钟，取20μL上清与180μLQUANTI-BlueTM(InvivoGen)在96孔板中混合，37℃显色30分钟，测定OD630，然后利用GraphPad Prism 6进行数据分析和作图。结果显示6种抗人ST2单克隆抗体(MSTT1041A、GSK3772847、H5G3+L2G2、H5G10+L2G2、H5G10+L1D1和H5G3+L1D1)都是剂量依赖型抑制IL-33活性(图3)，各抗体的IC50值如表
9所示。其中，MSTT1041A、GSK3772847、H5G3+L2G2、H5G10+L2G2、H5G10+L1D1和H5G3+L1D1的重链恒定区为IgG4亚型，轻链恒定区为κ亚型。

[0204] 表9.抗人ST2单克隆抗体基于HEK-BlueTM IL-33细胞抑制ST2的IC50值

[0205]

[0206] 实施例7抗人ST2单克隆抗体抑制IL-33与IL-12共刺激的PBMC分泌IFNγ

[0207] 除了报告基因系统，用原代NK细胞也可以检测抗ST2抗体的阻断作用。IL-33和IL-12各自不能单独激活NK细胞，但IL-12可以显著增加NK细胞表面ST2的表达，用IL-33和IL-
12刺激新鲜分离的NK细胞，IL-33与NK细胞表面ST2结合，可以激活NK细胞大量释放IFN-γ。
通过检测抗体对IFN-γ表达水平的影响可以判断抗ST2抗体的阻断作用

[0208] 用人PBMC细胞接种96孔细胞板(1.5×106个/mL，1640培养基+10％胎牛血清+1％P.S)，每孔100μL，加入1ng/ml IL-12-His(义翘神州，CT050-H08H)+0.1nM IL-33(GenScript，Z03198)+5倍梯度稀释抗体(MSTT1041A、GSK3772847、H5G3+L1D1和H5G10+L2G2，抗体浓度梯度分别为0.00256、0.0128、0.064、0.32、1.6、8、40、200、1000、5000pM)，反应总体积200μL/孔，37℃在CO2培养箱中作用，24小时后细胞板1200rpm离心5分钟，按照说明书检测上清液中的IFN-γ(人IFN-γELISA试剂盒，达科为，DKW12-1000-096)，然后利用GraphPad Prism 6进行数据分析和作图。H5G3+L1D1和H5G10+L2G2都是剂量依赖型抑制IL-33与IL-12共刺激PBMC分泌IFNγ(图4)，各抗体的IC50值如表10所示。其中，MSTT1041A、GSK3772847、H5G3+L1D1和H5G10+L2G2的重链恒定区为IgG4亚型。

[0209] 表10.抗人ST2单克隆抗体抑制IL-33与IL-12共刺激PBMC分泌IFNγ的IC50值[0210]  MSTT1041A GSK3772847 H5G3+L1D1 H5G10+L2G2
IC50(pM) 36.96 15.70 38.00 17.46

[0211] 实施例8抗人ST2单克隆抗体的种属特异性

[0212] 将制备的人ST2(hST2-his)、猕猴ST2(mmST2-his)和小鼠ST2(mST2-his)分别包被于96孔ELISA板(1μg/mL，100μl/孔)，同时包被10％BSA作为无关对照，4℃包被过夜。利用封闭液PBS-0.1％Tween20-3％牛奶在37℃封闭1小时后，分别加入各重组抗ST2单克隆抗体(S1A4、H5G3+L2G2、H5E10+L2G2、H5G10+L2G2、H6D3+L2G2、H6D6+L2G2和H5G3+L1D1)，37℃结合1小时。用PBST缓冲液洗涤ELISA板，加入HRP鼠抗人IgG(bioss，bsm-0297M-HRP)，37℃结合1小时。PBST缓冲液洗涤ELISA板，加入OPD底物显色液，5-10分钟后用1M的H2SO4终止显色，酶标仪492nm/630nm双波长测定光密度值。ELISA分析结果(图5)显示，六种抗ST2单克隆抗体(S1A4、H5G3+L2G2、H5E10+L2G2、H6D3+L2G2、H6D6+L2G2和H5G3+L1D1)能特异识别人ST2，并且和猴ST2、鼠ST2存在交叉反应，H5G10+L2G2不结合鼠ST2。七种单克隆抗体的重链恒定区均为IgG4亚型，轻链恒定区为κ亚型。