表面结合红细胞抗原特异性抗红细胞抗体的存在性分析

摘要

一种检测人类血清中血型抗原特异性抗体的分析流程，将待分析的血清与带有天然表面血型抗原的红细胞膜接触后，血清中含有针对表面抗原的其他抗体，然后检测凝集情况，凝集说明存在至少一种红细胞膜表面抗原特异性抗体。其他抗体产生的凝集反应被阻止，从而可检测抗血型抗体。

权利要求

1.检测血清中血型抗原特异性抗体的分析流程，包括血清接触带有表面抗原的红细胞膜，特征在于：血清接触红细胞膜之前，在红细胞膜上添加至少一种特异性结合红细胞表面第一抗原的结合多肽，该结合多肽不含人类Fc区，其中结合多肽包括：F(ab)2碎片、Fab碎片、单链可变功能域碎片(scFv)、小分子抗体、双体、包含非人Fc区的抗体，至少含有1个区的蛋白，构成至少一个特异结合第一抗原的结合部位。

2.根据权利要求1的分析流程，特征在于第一抗原并非血型抗原。

3.根据权利要求2的分析流程，特征在于：血清接触红细胞膜之前，在红细胞膜上添加至少一种特异性结合血型抗原的结合多肽，该结合多肽不含人类Fc区。

4.根据权利要求1的分析流程，特征在于第一抗原是血型抗原。

5.根据权利要求1的分析流程，特征在于该结合多肽至少含有2个区的蛋白，构成至少一个特异结合第一抗原的结合部位。

6.根据前述权利要求之一的分析流程，特征在于在存在抗人抗体的环境下，血清与红细胞膜接触。

7.根据前述权利要求之一的分析流程，特征在于红细胞膜为红细胞、或红细胞膜碎片。

8.根据前述权利要求之一的分析流程，特征在于红细胞与合成载体结合，通过标记的抗人抗体检测与红细胞膜的抗体结合。

9.根据前述权利要求之一的分析流程，特征在于检测凝集。

10.根据前述权利要求之一的分析流程，特征在于第一抗原为CD38，红细胞表面抗原特异性抗体是CD38特异性抗体。

11.根据前述权利要求之一的分析流程，特征在于通过可检测的标记物标记结合多肽。

12.根据前述权利要求之一的分析流程，特征在于血清来自注射第一抗原特异性抗体的患者。

13.根据前述权利要求之一的分析流程，特征在于结合多肽的结合部位与血清中含有的相同特异性抗体的结合部位相同。

14.根据权利要求13的分析流程，特征在于结合多肽来自相同特异性的抗体。

说明书

表面结合红细胞抗原特异性抗红细胞抗体的存在性分析

[0001] 本发明涉及在人类血清中检测血型抗原特异性抗体的分析流程。该流程中，待分析的血清先接触带有天然表面血型抗原的红细胞膜，然后检测凝集情况，凝集说明存在至少一种红细胞膜表面抗原特异性抗体。另外，该方法也可以另外添加试剂，或采用促使凝集的条件，如抗人抗体，清蛋白，聚乙二醇(PEG)和(或)蛋白水解酶，和(或)在低离子强度溶剂中接触含有红细胞膜的血清(LISS)。

背景技术

[0002] WO 2006/099875描述了一种针对CD38的治疗抗体，用于治疗多发性骨髓瘤。

[0003] Chapuy等人在2015年出版的Transfusion第55卷第1545‑1554页中描述了一种用于治疗多发性骨髓瘤的抗CD38抗体，称为Daratumumab(DARA)，它在检测血清中抗血型抗体的血清分析中可导致红细胞(RBC)的凝集。DARA导致的红细胞凝集可能被含二硫苏糖醇或胰蛋白酶的红细胞处理所瓦解，导致CD38变性或清除，或通过添加抗DARA特异型抗体或可溶性CD38所瓦解。

[0004] 众所周知，Coombs测试中，在存在抗人抗体的环境下，将血清接触红细胞，用来检测血型抗原特异性人类血清抗体。抗人抗体作为针对细胞表面结合抗原的交叉抗体，将导致肉眼可见的红细胞凝集。

发明内容

[0005] 本发明旨在提供检测血清中抗血型抗体的其他分析流程。该方法尤其适用于血清中包含血细胞表面抗原(非血型抗原)特异性的抗体，特别是人为加入血清的红细胞表面抗原特异性抗体，如向患者注射含抗体的药剂。

[0006] 发明描述

[0007] 本发明中，通过依据申请权利的分析流程实现目标，尤其是检测针对血型抗原的抗体分析方法，即用红细胞膜接触待分析的血清，然后检测血清中抗体与红细胞膜的结合情况。该流程特征在于，血清接触红细胞之前，先添加至少一种红细胞膜第一表面抗原特异性的结合多肽。该结合多肽缺少人类Fc区。事先添加的结合多肽会遮蔽红细胞膜第一抗原，从而阻止了血清中的抗体与第一抗原结合，该血清随后接触红细胞膜。本流程中，通过观察红细胞凝集来检测血清抗体与红细胞膜的结合情况，另外，还可添加第二种针对血清抗体Fc区的标记抗体以观察结合情况，检测血清中第一抗原特异性抗体存在性的结果显示，无抗体与第一抗原结合。这说明，针对红细胞膜第一表面抗原的结合多肽与红细胞结合后，妨碍了血清中第一抗原特异性抗体的检测，但可以检测后续与红细胞表面其他抗原结合的其他血清抗体。

[0008] 结合多肽的特征在于缺少人类Fc区，即，IgG型抗体中包含的2条链，每条链各含一个CH2和一个CH3结构域。结合多肽构成对红细胞表面第一抗原高度特异性的结合部位，该结合多肽可以是天然的，也可以是人工合成的，可以在一个或多个关联多肽链上。这种结合多肽包含拥有至少1个、最好2个区构成至少一个专门针对第一抗原结合部位的蛋白质，如，缺少Fc区的抗体碎片、F(ab)2碎片、Fab碎片、单链可变功能域碎片(scFv)、小分子抗体、纳米抗体、双体、带有非人Fc区的抗体。

[0009] 一般来说，本文所指血清的抗体亦指血清抗体。红细胞膜接触针对第一抗原的结合多肽前，第一抗原特异性血清抗体可与带有第一抗原作为表面抗原之一的红细胞膜结合。

[0010] 一般来说，红细胞血型抗原是预定的，容许血清抗体的特异性减少到一定程度。红细胞膜可以是选择性带有一种颜色如血红蛋白的红细胞、膜微囊，或与固态载体的膜碎片结合，该载体最好可用选择性可读取图片模式、或染料标记，或通过在读取设备已知位置中的固态载体排列作上标记。这些实施例中，红细胞膜预定血型抗原的信息与固态载体有关的标记相关联，随后通过这些标记，将预定血型抗原的信息与已测定结合血清抗体的存在与否对应。固态载体为每种红细胞膜进行个别标记，至少两个固态载体可结合使用，每个载体固定一种红细胞膜，而个别标记附着在固态载体上。

[0011] 本发明流程的优点是，待分析的血清不受直接影响，因为红细胞膜接触血清前，先与第一抗原特异性结合多肽接触。相应地，除了表面第一抗原特异性血清抗体的反应，血清抗体与红细胞膜的反应不受本流程影响。

[0012] 表面第一抗原可为非血型抗原，如，所有人类的细胞表面蛋白。本实施例中，血清抗体可结合所有特异性表面抗原，但表面第一抗原特异性的血清抗体不能结合表面第一抗原。相应的，由于红细胞膜事先接触表面第一抗原特异性结合多肽，存在于所有类型红细胞膜(每种类型包含不同的血型抗原组)上的表面第一抗原特异性血清抗体与所有类型红细胞膜的结合均被阻碍，也妨碍了对带有第一抗原的所有类型红细胞膜的非特异性血清抗体检测。

[0013] 理想情况，先将含有抗体的血清注射到个别患者，即血清来源于已注射抗体，尤其是治疗性抗体的患者，该抗体直接针对红细胞膜上的第一抗原，即具有亲和力。本实施例中，结合多肽针对与注射抗体相同的第一抗原。结合多肽可拥有与注射的治疗抗体相同的结合部位。本实施例中的结合多肽是通过蛋白酶消化之类的反应，从治疗性抗体中分离Fc区，产生的F(ab)2碎片或Fab碎片。这类治疗性抗体有抗CD38抗体，如称为Daratumumab和DARZALEX的抗体，或最近进入1阶段临床试验、用于治疗CD44表达的实质肿瘤的抗CD44抗体。

[0014] 另外，第一抗原是一种血型抗原、或包含血型抗原，结合多肽则针对同样的血型抗原。本实施例中，结合多肽或结合多肽组合，是从抗体中分离Fc区获得的，如从血型抗原特异性IgG中分离。

[0015] 根据国际输血协会、红细胞表面抗原术语委员会的命名法，血型抗原最好包含属于以下血型系统的抗原：ABO、MNS、P、Rh、Lutheran、Kell、Lewis、Duffy、Kidd、Diego、Yt、Xg、Scianna、Dombrock、Colton、Landsteiner‑Wiener、Chido/Rogers、H、Kx、Gerbich、Cromer、Knops、Indian、Ok、Raph、John Milton Hagen、l、Globoside、Gill和Rh相关糖蛋白，或属于血型集合Cost、li、Er、209、210和Vel的抗原，或属于700和901系列的低频率或高频率抗原。

[0016] 一般来说，检测血清中血型抗原特异性抗体的流程包含以下步骤：

[0017] a)提供至少一种类型的预定血型抗原的红细胞膜。

[0018] b)步骤c)之前，向红细胞膜中添加至少一种不含人类Fc区的结合多肽，该多肽对红细胞表面第一抗原具有特异性，从而与红细胞膜的表面第一抗原结合。

[0019] c)血清接触上述表面第一抗原与多肽结合的红细胞膜，及

[0020] d)检测与上述红细胞膜结合的抗体。

[0021] 检测抗体，通过凝集，可以确定血清中的抗体与红细胞膜结合，最好是添加试剂加速凝集，以抗人抗体为佳。通过分层凝胶颗粒床顶的反应混合物，观察红细胞膜穿过凝胶颗粒床的运动，可确定凝集，观察红细胞膜穿过凝胶颗粒床的运动时，最好进行离心，增加重力之后再观察。本实施例中，每种单独反应中至少包括2种红细胞膜，每种带有不同的血型抗原组合，最好按照处理步骤平行处理。

[0022] 另外，红细胞膜还可连接到固态载体，通过测量固态载体上是否存在二级抗体，即标记过的抗人抗体，从而检测抗体。

[0023] 步骤b)中，向红细胞膜添加至少一种结合多肽后，可以实施清洗步骤。但未与红细胞膜结合的结合多肽不影响血清抗体与红细胞膜结合，因此步骤b)不需要从红细胞膜上清除未结合的结合多肽，即，无需后续清洗步骤。

[0024] 以下实例及图片详细说明本发明：

[0025] ‑图1，利用凝胶卡进行的抗s血清试验中，s阳性与阴性红细胞的Coombs凝集试验结果，

[0026] ‑图2，利用凝胶卡进行的抗Kell与抗Fy(a)血清试验中的Coombs凝集结果，及[0027] ‑图3，利用凝胶卡进行的患者血清的Coombs凝集试验结果。

[0028] 以上实例中，通过检测抗体与红细胞结合来确定凝集，即，检测血清抗血型抗体与带有特定血型抗原的红细胞膜的凝集情况。

[0029] 实例1：血清抗血型抗体分析

[0030] 作为红细胞膜表面第一抗原特异性抗体的实例，治疗性抗CD38抗体Daratumumab(DARA)溶于0.9％NaCl溶液作为对比(仅DARA)，或在接触红细胞膜之前添加到血清。红细胞膜则是在利用含抗人抗体(Coombs)的凝胶卡进行的凝集分析中使用的60微升红细胞。结合蛋白是Daratumumab形成的F(ab)2碎片，即在37℃下，100毫摩尔每升柠檬酸缓冲液，以超过Daratumumab的40倍摩尔质量的胃蛋白酶消化60分钟。添加三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水后(TBS,pH 8.0)终止消化反应。该结合蛋白命名为DARA‑F(ab)2。取100微升0.3微克/微升DARA‑F(ab)2加入300微升红细胞溶液，室温下摇匀，作为前期培养，对比反应中采用100微升TBS。凝集反应中，取上述红细胞溶液60微升，加入25微升血清在37℃下培养15分钟，在含有抗人抗体的凝胶卡齿孔中的凝胶床上分层，并根据厂商说明离心。

[0031] 细胞7的红细胞预定为s阳性，细胞11的为s阴性。血清为已知含有抗S抗体的人类血清(来自Biolith，1:2稀释)。

[0032] 图1显示离心后的凝胶卡，含有以下反应：

[0033]

[0034]

[0035] 齿孔1至4显示，对比反应中，血清中不含抗血型抗体，仅含抗CD38抗体DARA与抗人抗体(Coombs)。结果表明，抗CD38抗体DARA导致未处理的红细胞凝集，而经DARA‑F(ab)2预处理的红细胞无法凝集。

[0036] 齿孔5至8显示的反应中，血清仅含抗血型抗体，不含抗CD38抗体DARA。结果表明，抗s血清下，s阳性的细胞7凝集，而s阴性的细胞11不凝集，抗s血清不受DARA‑F(ab)2结合蛋白预处理红细胞的影响。

[0037] 齿孔9显示，加入抗s血清，红细胞未经结合多肽预处理，加入非血型抗原(CD38)特异性抗体(DARA)或抗血型抗体(目前是抗s抗体)，导致凝集。

[0038] 齿孔10显示添加缺少人类Fc区的第一抗原如CD38特异性的结合多肽(DARA‑F(ab)2)后，不影响抗s血清抗体与红细胞的结合。

[0039] 齿孔11显示，抗s血清下，红细胞未经结合多肽预处理，针对非血型抗原(CD38)的抗体(DARA)导致不带有血型抗原s的细胞凝集。

[0040] 齿孔12显示，添加不含人类Fc区、第一抗原如CD38特异性的结合多肽(DARA‑F(ab)2)后，不影响抗s血清抗体与不带抗原的红细胞的结合。

[0041] 相应的，添加不含人类Fc区、红细胞膜表面第一抗原特异性的结合多肽后，造成对红细胞膜第一抗原的针对性遮蔽，但不影响其他血清抗体的结合。

[0042] 实例2：血清抗血型抗体分析

[0043] 如实例1中所述，采用治疗性抗CD38抗体DARA作为示范的第一抗原CD38特异性抗体，采用DARA‑F(ab)2作为第一抗原特异性结合多肽。红细胞膜为红细胞2(Kell阳性，Fy(a)阴性)，细胞4(Kell阴性，Fy(a)阳性)，采用人类抗Kell血清(来自Grifols，1:2稀释)，或人类抗Fy(a)血清(来自Biolith，1:2稀释)。根据实例1，观察到凝集反应，则确定血清抗体已与红细胞结合。

[0044] 图2显示离心后的凝胶卡，含有以下反应：

[0045] 齿孔编号 细胞 血清 反应1 细胞2，TBS前期培养 仅抗Kell血清 凝集
2 细胞2，DARA‑F(ab)2前期培养 仅抗Kell血清 凝集
3 细胞4，TBS前期培养 仅抗Kell血清 无凝集
4 细胞4，DARA‑F(ab)2前期培养 仅抗Kell血清 无凝集
5 细胞2，TBS前期培养 仅DARA 凝集
6 细胞2，DARA‑F(ab)2前期培养 仅DARA 无凝集
7 细胞4，TBS前期培养 仅DARA 凝集
8 细胞4，DARA‑F(ab)2前期培养 仅DARA 无凝集
9 细胞2，TBS前期培养 仅抗Fy(a) 无凝集
10 细胞2，DARA‑F(ab)2前期培养 仅抗Fy(a) 无凝集
11 细胞4，TBS前期培养 仅抗Fy(a) 凝集
12 细胞4，DARA‑F(ab)2前期培养 仅抗Fy(a) 凝集
13 细胞2，TBS前期培养 DARA+抗Kell血清 凝集
14 细胞2，DARA‑F(ab)2前期培养 DARA+抗Kell血清 凝集
15 细胞4，TBS前期培养 DARA+抗Kell血清 凝集
16 细胞4，DARA‑F(ab)2前期培养 DARA+抗Kell血清 无凝集
17 细胞2，TBS前期培养 DARA+抗Fy(a)血清 凝集
18 细胞2，DARA‑F(ab)2前期培养 DARA+抗Fy(a)血清 无凝集
19 细胞4，TBS前期培养 DARA+抗Fy(a)血清 凝集
20 细胞4，DARA‑F(ab)2前期培养 DARA+抗Fy(a)血清 凝集

[0046] 齿孔1至4显示仅含红细胞的抗Kell血清的凝集情况取决于有无特异性血型抗原Kell，而红细胞接触人类血清前是否经结合多肽DARA‑F(ab)2处理则没有关联。

[0047] 齿孔9至12显示仅含红细胞的抗Fy(a)血清的凝集情况取决于有无特异性血型抗原Fy(a)，而红细胞接触人类血清前是否经结合多肽DARA‑F(ab)2处理则没有关联。

[0048] 还表明，对于血型抗原Kell与Fy(a)，各自特异性血清抗体的结合情况不受红细胞膜事先接触血清、使结合多肽与红细胞膜结合的影响。

[0049] 齿孔5至8显示，红细胞膜第一抗原特异性抗体会与细胞结合，但在接触抗体前，添加第一抗原特异性结合多肽后阻止了这种结合，但加入缺少人类Fc区的结合多肽后，凝胶卡分析中采用的抗人抗体(Coombs)并没有出现交联反应。其他齿孔显示，血清抗血型抗体的抗人抗体(Coombs)与红细胞膜结合的交联反应，不受本发明中添加的结合多肽的影响。

[0050] 齿孔13、15、17和19显示，未经第一抗原特异性结合蛋白预处理的红细胞，与第一抗原特异性抗体结合，导致凝集，这与接触红细胞的血清抗血型特异性无关。齿孔14、16、18和20显示，添加缺少人类Fc区、对第一抗原有特异性的结合多肽后，妨碍了血清中第一抗原特异性抗体的结合，并且，血清抗血型抗体与红细胞膜的结合不受事先添加前述结合多肽的影响，该多肽不是血清抗血型抗体识别的血型抗原。

[0051] 实例3：患者血清中的DARA抑制

[0052] 对应实例1，血清中的治疗性抗CD38抗体DARA是针对示范性第一抗原CD38的抗体，该血清来自于注射抗CD38抗体DARA的患者。DARA‑F(ab)2作为第一抗原特异性结合多肽。红细胞膜则为红细胞9和细胞11。根据实例1，观察到凝集反应，则确定血清抗体已与红细胞结合。

[0053] 图3显示离心后的凝胶卡，含有以下反应：

[0054]齿孔编号 细胞 血清 反应
1 细胞9，TBS前期培养 仅DARA 凝集
2 细胞9，DARA‑F(ab)2前期培养 仅DARA 无凝集
3 细胞11，TBS前期培养 仅DARA 凝集
4 细胞11，DARA‑F(ab)2前期培养 仅DARA 无凝集
5 细胞9，TBS前期培养 患者血清 凝集
6 细胞9，DARA‑F(ab)2前期培养 患者血清 无凝集
7 细胞11，TBS前期培养 患者血清 凝集
8 细胞11，DARA‑F(ab)2前期培养 患者血清 无凝集

[0055] 细胞9携载抗原类型为Rhc、Rhe、Cellano、Kp(b)、Kp(a)、Fy(a)、Fy(b)、Jk(b)、Le(b)、P1、M、S、s和Lu(b)。细胞11携载抗原类型为Rhc、Rhe、Cellano、Kp(b)、Fy(b)、Jk(a)、Le(b)、P1、N、S、Lu(b)、Xg(a)、Bga(w)

[0056] 齿孔1至4显示，对比反应中，血清中不含抗血型抗体，仅含抗CD38抗体DARA与抗人抗体(Coombs)抗体。上述结果表明，抗CD38抗体DARA导致所有未处理的红细胞凝集，而经DARA‑F(ab)2预处理的红细胞无法凝集。

[0057] 齿孔5至8显示的对比反应中，患者血清仅含未知抗体或非抗血型抗体，不含DARA处理后的抗CD38抗体。上述结果表明，DARA‑F(ab)2预处理红细胞后，可防止患者血清中的抗CD38抗体DARA造成的未处理红细胞凝集。齿孔5至8的反应说明该患者的细胞9和细胞11抗原抗体为阴性。

[0058] 结果表明，经与红细胞膜第一抗原CD38相同的第一抗原特异性结合多肽(缺少人类Fc区)预处理血细胞后，以红细胞为代表，将导致第一抗原特异性血清抗体失去活性。确定血型抗体时，经上述结合多肽预处理的红细胞膜将非结论性结果转化为结论性结果，所有阳性凝集反应转变为显示其他血清抗体效果的特异性反应。