一种紫杉醇与多肽共递送系统、制备方法及应用转让专利
申请号 : CN201910726966.6
文献号 : CN110393803B
文献日 : 2022-03-18
发明人 : 王庆杰 , 黄艺 , 林贵梅
申请人 : 山东大学齐鲁医院
摘要 :
本公开属于抗肿瘤药物递送技术领域，具体涉及一种紫杉醇与多肽共递送系统、制备方法及应用。现有技术中将免疫治疗与化学治疗联合应用于肿瘤治疗具有良好的效果。Alloferon‑1，一种碱性肽，近年来有研究表明该多肽可通过激活肿瘤微环境中的NK细胞提升免疫系统功能。发明人认为将Alloferon‑1与紫杉醇联用有望具有良好的治疗作用，为了实现两种药物的共递送，本公开提供了一种PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑Heparin/Protamine纳米共递送系统，基于肿瘤微环境中乙酸肝素酶‑1对肝素的降解作用，实现系统整体在肿瘤部位的崩解和药物的富集，特别是应用于黑色素瘤的治疗，具有良好的效果。
权利要求 :
1.一种纳米粒，其特征在于，所述纳米粒用于共递送紫杉醇与Alloferon‑1；该纳米粒中，所述紫杉醇为紫杉醇阳离子胶束形式，所述Alloferon‑1为聚电解质复合物形式；
所述紫杉醇阳离子胶束由紫杉醇、DOTAP制成；
所述聚电解质复合物原料包括Alloferon‑1、硫酸鱼精蛋白及肝素钠；
所述纳米粒的原料及用量如下：紫杉醇1.200％‑1.600％，DOTAP 15.000％‑19.000％，硫酸鱼精蛋白9.000％‑13.000％，Alloferon‑1 0.150％‑0.450％，肝素钠60.000％‑
80.000％。
2.如权利要求1所述的纳米粒，其特征在于，所述纳米粒的原料及用量如下：紫杉醇
1.300％‑1.500％，DOTAP 16.000％‑18.000％，硫酸鱼精蛋白10.000％‑12.000％，alloferon‑1 0.200％‑0.400％，肝素钠65.000％‑75.000％。
3.权利要求1‑2任一项所述纳米粒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括制备紫杉醇阳离子胶束、Alloferon‑1聚电解质复合物及纳米粒的制备；
所述紫杉醇阳离子胶束的制备方法如下：将紫杉醇及DOTAP溶于氯仿中，室温下旋蒸除去溶剂，超声水化；
所述Alloferon‑1聚电解质复合物的制备方法如下：将硫酸鱼精蛋白与Alloferon‑1混合后缓慢滴加至肝素钠溶液中并搅拌既得；
所述纳米粒的制备方法，室温下，将制备好的紫杉醇阳离子胶束滴加至Alloferon‑1聚电解质复合物中搅拌既得。
4.如权利要求3所述纳米粒的制备方法，其特征在于，超声的水化温度为20～40℃，超声时间为30～60s。
5.如权利要求3所述纳米粒的制备方法，其特征在于，透析除去过量的Alloferon‑1‑Heparin/鱼精蛋白。
6.如权利要求1‑2任一项所述纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
7.如权利要求6所述应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物为抗黑色素瘤药物。
说明书 :
一种紫杉醇与多肽共递送系统、制备方法及应用
技术领域
[0001] 本公开属于抗肿瘤药物递送技术领域，具体涉及一种PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑Heparin/Protamine共递送系统、其制备方法及在抗肿瘤药物制备中的应用。
背景技术
[0002] 公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本公开的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技
术。
术。
[0003] 黑素瘤起源于黑色素细胞，是皮肤肿瘤中恶性程度最高的瘤种。转移性黑色素瘤将患者的五年生存率从98％降低至17％。通常，肿瘤微环境(tumor microenvironment，
TME)中的基质主要由结构蛋白和糖胺聚糖组成，后者的主要成分是硫酸乙酰肝素蛋白多糖
(HSPGs)。在TME中，HSPG存储大量生物因子(例如b‑FGF，VEGF和TGF‑β)，并且这些因子在身
体和肿瘤之间的这场战争中具有高度战略性。然而，结果通常是肿瘤微环境中的乙酰肝素
酶‑1降解HSPG，允许这些生物因子的大量释放，激活随后的信号传导途径，导致新血管形
成，上皮‑间质转化(EMT)和肿瘤转移。此外，肿瘤微环境中产生的基质空隙也有助于肿瘤细
胞的侵袭和转移。这些研究表明，恶性高转移性肿瘤通常表达高水平的乙酰肝素酶‑1，尤其
在黑色素瘤中。
TME)中的基质主要由结构蛋白和糖胺聚糖组成，后者的主要成分是硫酸乙酰肝素蛋白多糖
(HSPGs)。在TME中，HSPG存储大量生物因子(例如b‑FGF，VEGF和TGF‑β)，并且这些因子在身
体和肿瘤之间的这场战争中具有高度战略性。然而，结果通常是肿瘤微环境中的乙酰肝素
酶‑1降解HSPG，允许这些生物因子的大量释放，激活随后的信号传导途径，导致新血管形
成，上皮‑间质转化(EMT)和肿瘤转移。此外，肿瘤微环境中产生的基质空隙也有助于肿瘤细
胞的侵袭和转移。这些研究表明，恶性高转移性肿瘤通常表达高水平的乙酰肝素酶‑1，尤其
在黑色素瘤中。
[0004] 对于这样的恶性肿瘤，科学家们提出了各种对策和治疗方案。一些研究人员指出，不同种族黑色素瘤的病因并不完全一致，因此早期预防和检查所采取的相应措施也有所不
同。另外有研究更新并改进了黑色素瘤分期方法，有利于在临床上制定更合理有效的治疗
方案，提高药物疗效，减少副作用。还有一些研究人员总结了过去五年黑色素瘤治疗方案的
变化，并为BRAF突变黑色素瘤患者提出了合理的一线治疗方案。总之，目前治疗黑色素瘤的
方法主要包括化疗，分子靶向治疗，免疫检查点阻断治疗和肿瘤疫苗治疗。
同。另外有研究更新并改进了黑色素瘤分期方法，有利于在临床上制定更合理有效的治疗
方案，提高药物疗效，减少副作用。还有一些研究人员总结了过去五年黑色素瘤治疗方案的
变化，并为BRAF突变黑色素瘤患者提出了合理的一线治疗方案。总之，目前治疗黑色素瘤的
方法主要包括化疗，分子靶向治疗，免疫检查点阻断治疗和肿瘤疫苗治疗。
[0005] 紫杉醇作为一种经典的广谱抗癌药物，可抑制肿瘤细胞的增殖，常用于临床治疗黑色素瘤。在正常条件下，微管和微管蛋白二聚体之间存在动态平衡，但紫杉醇可破坏这种
动态平衡，诱导微管蛋白聚合并防止解聚，并稳定微管，导致细胞在有丝分裂期间不能形成
纺锤体、进而抑制细胞分裂和增殖，并使肿瘤细胞停滞在G2/M期，从而发挥抗肿瘤作用。然
而，长期使用紫杉醇可能导致患者出现紫杉醇耐药现象。幸运的是，近年来，免疫治疗的疗
效在癌症治疗中变得越来越令人满意。研究人员尝试将免疫治疗与化疗药物联合使用，并
发现这种治疗方法大大提高了药物的疗效。
动态平衡，诱导微管蛋白聚合并防止解聚，并稳定微管，导致细胞在有丝分裂期间不能形成
纺锤体、进而抑制细胞分裂和增殖，并使肿瘤细胞停滞在G2/M期，从而发挥抗肿瘤作用。然
而，长期使用紫杉醇可能导致患者出现紫杉醇耐药现象。幸运的是，近年来，免疫治疗的疗
效在癌症治疗中变得越来越令人满意。研究人员尝试将免疫治疗与化疗药物联合使用，并
发现这种治疗方法大大提高了药物的疗效。
[0006] Alloferon‑1，(HGVSGHGQHGVHG)，一种13个氨基酸的碱性肽，当它溶于水时具有强正电荷。该肽首先用于抗病毒和抗细菌领域，但近年来也发现其对癌症治疗具有良好效果。
一些报道也证明该碱性肽可通过激活肿瘤微环境中的自然杀伤(NK)细胞，NK细胞释放IFN‑
γ，TNF‑β和穿孔素，逆转被肿瘤细胞抑制的免疫系统，从而表现出抗肿瘤作用。针对上述研
究背景，发明人认为：采用游离药物对黑色素瘤进行治疗存在比较明显的缺陷，包括：药物
的全身分布和无差别的攻击会降低疗效并对正常的身体组织造成损害。同时，没有载体保
护的药物将直接遭受巨噬细胞的吞噬作用和调理分子的中和作用，肝脏的代谢功能和肾脏
的排泄功能也会降低药物在血液循环中的半衰期。采用纳米粒递送形式可以显著的改善上
述缺陷，增加药物稳定性及药物在肿瘤部位的富集作用。
一些报道也证明该碱性肽可通过激活肿瘤微环境中的自然杀伤(NK)细胞，NK细胞释放IFN‑
γ，TNF‑β和穿孔素，逆转被肿瘤细胞抑制的免疫系统，从而表现出抗肿瘤作用。针对上述研
究背景，发明人认为：采用游离药物对黑色素瘤进行治疗存在比较明显的缺陷，包括：药物
的全身分布和无差别的攻击会降低疗效并对正常的身体组织造成损害。同时，没有载体保
护的药物将直接遭受巨噬细胞的吞噬作用和调理分子的中和作用，肝脏的代谢功能和肾脏
的排泄功能也会降低药物在血液循环中的半衰期。采用纳米粒递送形式可以显著的改善上
述缺陷，增加药物稳定性及药物在肿瘤部位的富集作用。
发明内容
[0007] 针对上述研究背景，发明人认为将紫杉醇与Alloferon‑1合用于黑色素瘤的治疗有望收到良好治疗效果。然而，由于紫杉醇和Alloferon‑1的靶细胞分别是肿瘤细胞和NK细
胞，设计一种纳米系统实现两种药物的共递送具有技术难度。众所周知，乙酰肝素酶‑1可以
降解乙酰肝素，进一步研究证明了乙酰肝素酶‑1还具有降解肝素的能力，该发现为提供一
种具有酶反应性的新载体材料提供了研究思路，还有望实现两种药物的共递送。
胞，设计一种纳米系统实现两种药物的共递送具有技术难度。众所周知，乙酰肝素酶‑1可以
降解乙酰肝素，进一步研究证明了乙酰肝素酶‑1还具有降解肝素的能力，该发现为提供一
种具有酶反应性的新载体材料提供了研究思路，还有望实现两种药物的共递送。
[0008] 本公开依据该研究思路针对紫杉醇与Alloferon‑1的共递送系统展开了研究，得到一种紫杉醇阳离子胶束与Alloferon‑1聚电解质复合物组装的纳米系统(PTX‑DOTAP@
Alloferon‑1‑Heparin/Protamine)，是一种以肝素为基础的肿瘤微环境响应性纳米粒，可
以完成紫杉醇和Alloferon‑1共载以及分步递送的效果。将化疗与免疫治疗结合，具有稳定
性好、制备工艺简单、增加药物在肿瘤处富集作用的效果。
Alloferon‑1‑Heparin/Protamine)，是一种以肝素为基础的肿瘤微环境响应性纳米粒，可
以完成紫杉醇和Alloferon‑1共载以及分步递送的效果。将化疗与免疫治疗结合，具有稳定
性好、制备工艺简单、增加药物在肿瘤处富集作用的效果。
[0009] 为了实现该技术效果，本公开提供以下技术方案：
[0010] 本公开第一方面，提供一种聚电解质复合物，所述聚电解质复合物原料包括多肽类药物、硫酸鱼精蛋白及肝素。
[0011] 优选的，所述多肽类药物为抗肿瘤药物，进一步的，为Alloferon‑1。
[0012] 优选的，所述肝素为肝素钠。
[0013] 肝素钠具有持久的抗血栓形成作用，作为抗凝血药物使用已久，另外还具有抗平滑肌细胞增殖、抗炎、抗肿瘤及抗病毒等多种生理活性，其表面负载高密度负电荷的糖链结
构。硫酸鱼精蛋白是一种主要由精氨酸组成的天然碱性蛋白，其携带大量的正电荷，通过与
肝素钠形成稳定的盐使肝素失去抗凝作用，是一对拮抗物质。两者能够形成的稳定的复合
物，用于多肽类药物的传递，一定程度上可以改善游离多肽药物的不稳定性。DOTAP是一种
通常用于制备阳离子脂质体的带正电荷的磷脂分子，可用于通过形成胶束来捕获疏水性
PTX。通过优化制备过程，具有合适粒径的带负电荷的电解质复合物完全覆盖带正电荷的
DOTAP胶束，以形成最终带负电的纳米粒子，有望形成一种长循环药物载体。
构。硫酸鱼精蛋白是一种主要由精氨酸组成的天然碱性蛋白，其携带大量的正电荷，通过与
肝素钠形成稳定的盐使肝素失去抗凝作用，是一对拮抗物质。两者能够形成的稳定的复合
物，用于多肽类药物的传递，一定程度上可以改善游离多肽药物的不稳定性。DOTAP是一种
通常用于制备阳离子脂质体的带正电荷的磷脂分子，可用于通过形成胶束来捕获疏水性
PTX。通过优化制备过程，具有合适粒径的带负电荷的电解质复合物完全覆盖带正电荷的
DOTAP胶束，以形成最终带负电的纳米粒子，有望形成一种长循环药物载体。
[0014] 本公开第二方面，提供一种纳米粒，所述纳米粒用于共递送紫杉醇与Alloferon‑1；该纳米粒中，所述紫杉醇为紫杉醇阳离子胶束形式，所述Alloferon‑1为第一方面所述聚
合物电解质形式。
合物电解质形式。
[0015] 紫杉醇作为一种细胞毒性抗肿瘤药物，其对实体瘤有良好的治疗效果，但缺乏靶向性，并且水溶性较差。德国MediGene公司开发了一种紫杉醇阳离子脂质体，以紫杉醇、1，
2‑二油酰基‑3‑三甲胺基丙烷(1，2‑dioleoyl‑3‑trimethylammonium‑propane，DOTAP)、1，
2‑二油酰基磷脂酰胆碱(1，2‑dioleoyl‑sn‑glycero‑3‑phosphocholine，DOPC)为原料制
成，是一种以肿瘤新生血管为靶标的药物。本公开提供的紫杉醇与Alloferon‑1共递送系
统，通过紫杉醇阳离子胶束与聚电解质复合物组装，整个纳米粒表面呈现强负电，有助于该
纳米粒在血液中实现长循环。
2‑二油酰基‑3‑三甲胺基丙烷(1，2‑dioleoyl‑3‑trimethylammonium‑propane，DOTAP)、1，
2‑二油酰基磷脂酰胆碱(1，2‑dioleoyl‑sn‑glycero‑3‑phosphocholine，DOPC)为原料制
成，是一种以肿瘤新生血管为靶标的药物。本公开提供的紫杉醇与Alloferon‑1共递送系
统，通过紫杉醇阳离子胶束与聚电解质复合物组装，整个纳米粒表面呈现强负电，有助于该
纳米粒在血液中实现长循环。
[0016] 另外，由于肿瘤微环境中高表达乙酰肝素酶‑1，乙酸肝素酶‑1能够迅速降解纳米颗粒外层中的肝素。由间隙中的电解质引起的离子扩散主导了纳米颗粒的解聚过程，伴随
着浓度梯度释放的鱼精蛋白，并且肝素分子的降解也导致肝素和鱼精蛋白之间的静电吸引
力降低。最终，这一系列因素将形成正反馈回路，加速纳米颗粒的崩解。以往的研究认为电
解质诱导的离子扩散是促进聚电解质复合物中带电药物分子释放的重要因素，本公开提供
的纳米粒子通过离子扩散和乙酰肝素酶‑1的协同效应促进纳米颗粒解聚和alloferon‑1释
放，更为智能。
着浓度梯度释放的鱼精蛋白，并且肝素分子的降解也导致肝素和鱼精蛋白之间的静电吸引
力降低。最终，这一系列因素将形成正反馈回路，加速纳米颗粒的崩解。以往的研究认为电
解质诱导的离子扩散是促进聚电解质复合物中带电药物分子释放的重要因素，本公开提供
的纳米粒子通过离子扩散和乙酰肝素酶‑1的协同效应促进纳米颗粒解聚和alloferon‑1释
放，更为智能。
[0017] 纳米颗粒将释放Alloferon‑1以激活NK细胞以逆转肿瘤细胞抑制的免疫系统。另一方面，在酶促水解和离子扩散的双重作用下，纳米粒核心带正电的DOTAP暴露，粒径减小
且呈正电荷的纳米颗粒更易渗透到肿瘤内部并且更容易被高度带负电的肿瘤细胞内吞，从
而提高紫杉醇在肿瘤细胞部位的富集作用，提高化学药物的治疗效果。
且呈正电荷的纳米颗粒更易渗透到肿瘤内部并且更容易被高度带负电的肿瘤细胞内吞，从
而提高紫杉醇在肿瘤细胞部位的富集作用，提高化学药物的治疗效果。
[0018] 本公开第三方面，提供第二方面所述纳米粒的制备方法，所述制备方法包括制备紫杉醇阳离子胶束、Alloferon‑1聚电解质复合物及纳米粒的制备。
[0019] 本公开第四方面，提供第一方面所述聚电解质复合物和/或第二方面所述纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0020] 相比现有技术，本公开的有益效果包括：
[0021] 1、本公开提供了一种紫杉醇与Alloferon‑1联合应用的方式，将化学治疗与免疫治疗相结合，提供了一种细胞毒药物与免疫治疗药物相结合的疗法，可以提高临床治疗效
果。
果。
[0022] 2、为了实现两种药物的共递送，本公开提供了一种紫杉醇阳离子胶束与Alloferon‑1电解质复合物组装的纳米递送系统，该递送系统利用乙酰肝素酶‑1对肝素的
降解作用，使纳米系统集中于肿瘤部位崩解。崩解后暴露的Alloferon‑1实现对肿瘤微环境
中NK细胞的激活作用，而紫杉醇则在电荷作用下更易进入肿瘤细胞，加强治疗效果。特别对
于黑色素瘤这种乙酰肝素酶高表达的肿瘤，具有良好的治疗意义。
降解作用，使纳米系统集中于肿瘤部位崩解。崩解后暴露的Alloferon‑1实现对肿瘤微环境
中NK细胞的激活作用，而紫杉醇则在电荷作用下更易进入肿瘤细胞，加强治疗效果。特别对
于黑色素瘤这种乙酰肝素酶高表达的肿瘤，具有良好的治疗意义。
[0023] 3、本公开的制备方法几乎没有化学合成过程，几乎不使用有机溶剂，制备方法简便易行。该方法制备得到的纳米粒子尺寸均匀性好，并且可以药物化用于工业生产及临床
目的。
目的。
附图说明
[0024] 构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
[0025] 图1为本公开中PTX‑DOTAP作用于肿瘤细胞示意图；
[0026] 图2为实施例1中PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑Heparin/Protamine的制备方法和表征图；
[0027] 其中，图2a)为PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑heparin/Protamine的制备流程示意图；
[0028] 图2b)为PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑heparin/Protamine的粒度减小和电荷翻转期间，PTX和alloferon‑1分布到不同的靶细胞示意图；
[0029] 图2c)为PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑heparin/Protamine的最佳比例筛选；
[0030] 图2d)为PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑heparin/Protamine的大小分布；
[0031] 图2e)为PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑heparin/Protamine的TEM照片分布；
[0032] 图2f)为PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑heparin/Protamine的ζ‑电位。
[0033] 图3为实施例1中PTX‑DOTAP和Alloferon‑1‑Heparin/Protamine的性能表征结果图；
[0034] 其中，图3a)为实施例1中protamine和heparin比例梯度曲线图；
[0035] 图3b)为实施例1中Alloferon‑1‑Heparin/Protamine纳米粒的TEM照片图；
[0036] 图3c)为实施例1中Alloferon‑1‑Heparin/Protamine纳米粒的粒径分布图；
[0037] 图3d)为实施例1中Alloferon‑1‑Heparin/Protamine纳米粒的电位分布图。
[0038] 图3e)为实施例1中PTX‑DOTAP纳米粒的粒径分布图；
[0039] 图3f)为实施例1中PTX‑DOTAP纳米粒的电位分布图。
[0040] 图4为实施例1中当PTX‑DOTAP含量略高或过高时，PTX‑DOTAP@alloferon‑1‑heparin/Protamine的粒径和TEM图像；
[0041] 其中，图4a)为(protamine+heparin)：DOTAP质量比为4.2时纳米粒TEM图；
[0042] 图4b)为(protamine+heparin)：DOTAP质量比为4.2时纳米粒粒径分布图；
[0043] 图4c)为(protamine+heparin)：DOTAP质量比为3.0纳米粒TEM图；
[0044] 图4d)为(protamine+heparin)：DOTAP质量比为3.0纳米粒粒径分布图。
[0045] 图5为实施例2中PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑heparin/Protamine释放性能表征结果图；
[0046] 其中，图5a)为B16F10黑素瘤，肝脏和正常皮肤组织中表达的乙酰肝素酶‑1的量；
[0047] 图5b)37℃下存在或不存在heparin酶的情况下游离DTX，游离alloferon‑1和PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑heparin/Protamine的体外释放曲线(n＝3，结果以平均值±SD显示)；
[0048] 图5c)为在无，酶，电解质和酶+电解质的四种缓冲环境中，PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑Heparin/Protamine在不同时间表现出明显的现象，TEM照片和示意动画。
[0049] 图6为实施例3中纳米颗粒的体外细胞摄取结果图：
[0050] 图7为实施例4中纳米粒子体外毒性检测结果图；
[0051] 图8为实施例5中给药后体内分布结果图；
[0052] 其中，图8a)为静脉注射药物后小鼠体内荧光图像，虚线表示小鼠肿瘤灶。
[0053] 图8b)为离体脏器中药物分布图；
[0054] 图8c)为离体脏器中药物含量直方图。
[0055] 图9为实施例5中肿瘤微环境中肿瘤细胞抑制的免疫系统结果图；
[0056] 其中，图9a)为各组小鼠外周血中IFN‑γ水平的变化直方图；
[0057] 图9b)为各组小鼠外周血中TNF‑α水平的变化直方图；
[0058] 图9c)为各组小鼠肿瘤切片中NKG2D含量直方图；
[0059] 图9d)为各组小鼠肿瘤切片中CD94含量直方图。
[0060] 图10为实施例5中小鼠组织病理学研究结果；
具体实施方式
[0061] 应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本公开提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属技术领域的普通技术人员通常
理解的相同含义。
理解的相同含义。
[0062] 需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式
也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包
括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包
括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0063] 正如背景技术所介绍的，现有技术中将免疫治疗与化学治疗联合应用于肿瘤治疗具有良好的效果。Alloferon‑1，一种碱性肽，近年来有研究表明该多肽可通过激活肿瘤微
环境中的NK细胞提升免疫系统功能。发明人认为将Alloferon‑1与紫杉醇联用有望具有良
好的治疗作用，为了实现两种药物的共递送，本公开提供了一种PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑
Heparin/Protamine纳米共递送系统，基于肿瘤微环境中乙酸肝素酶‑1对肝素的降解作用，
实现系统整体在肿瘤部位的崩解和药物的富集。
环境中的NK细胞提升免疫系统功能。发明人认为将Alloferon‑1与紫杉醇联用有望具有良
好的治疗作用，为了实现两种药物的共递送，本公开提供了一种PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑
Heparin/Protamine纳米共递送系统，基于肿瘤微环境中乙酸肝素酶‑1对肝素的降解作用，
实现系统整体在肿瘤部位的崩解和药物的富集。
[0064] 本公开第一方面，提供一种聚电解质复合物，所述聚电解质复合物原料包括多肽类药物、硫酸鱼精蛋白及肝素。
[0065] 优选的，所述多肽类药物为抗肿瘤药物，进一步的，为Alloferon‑1。
[0066] 优选的，所述肝素为肝素钠。
[0067] 本公开第二方面，提供一种纳米粒，所述纳米粒用于共递送紫杉醇与Alloferon‑1；该纳米粒中，所述紫杉醇为紫杉醇阳离子胶束形式，所述Alloferon‑1为第一方面所述聚
合物电解质形式。
合物电解质形式。
[0068] 在一些实施例中，所述紫杉醇阳离子胶束由紫杉醇、DOTAP制成。
[0069] 在一些实施例中，所述纳米粒的原料及用量如下：紫杉醇1.200％‑1.600％，DOTAP 15.000％‑19.000％，硫酸鱼精蛋白9.000％‑13.000％，Alloferon‑1 0.150％‑0.450％，肝
素钠60.000％‑80.000％。
素钠60.000％‑80.000％。
[0070] 更进一步的，为紫杉醇1.300％‑1.500％，DOTAP 16.000％‑18.000％，硫酸鱼精蛋白10.000％‑12.000％，alloferon‑1 0.200％‑0.400％，肝素钠65.000％‑75.000％。
[0071] 在具体的实施例中，纳米粒的用量如下：紫杉醇1.401％，DOTAP 16.853％，硫酸鱼精蛋白11.715％，alloferon‑1 0.321％，肝素钠69.709％。
[0072] 本公开第三方面，提供第二方面所述纳米粒的制备方法，所述制备方法包括制备紫杉醇阳离子胶束、Alloferon‑1聚电解质复合物及纳米粒的制备。
[0073] 在一些实施例中，所述紫杉醇阳离子胶束的制备方法如下：将紫杉醇及DOTAP溶于氯仿中，室温下旋蒸除去溶剂，超声水化；进一步的，超声的水化温度为20～40℃，超声时间
为30～60s。
为30～60s。
[0074] 在一些实施例中，所述Alloferon‑1聚电解质复合物的制备方法如下：将硫酸鱼精蛋白与Alloferon‑1混合后缓慢滴加至肝素钠溶液中并搅拌既得。
[0075] 在一些实施例中，所述纳米粒的制备步骤如下：室温下，将制备好的紫杉醇阳离子滴加至Alloferon‑1聚电解质复合物中搅拌既得；进一步的，透析除去过量的Alloferon‑1‑
Heparin/鱼精蛋白。
Heparin/鱼精蛋白。
[0076] 本公开第四方面，提供第一方面所述聚电解质复合物和/或第二方面所述纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0077] 在一些实施例中，所述抗肿瘤药物为抗黑色素瘤药物。
[0078] 为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本公开的技术方案。
[0079] 以下实施例中透射电镜照片为JEM‑2100透射电子显微镜(日本电子株式会社JEOL)拍摄。粒径分析实验采用Zetasizer Nano ZS粒径电位分析仪(Malvem公司英国)。
[0080] 实施例1 PTX‑DOTAP的制备
[0081] 1.单因素试验
[0082] 本实施例针对PTX‑DOTAP制备的条件进行考察，考察因素包括药脂比、脂质浓度、水化温度、超声时间、超声功率及旋蒸水浴温度六个因素。
[0083] 1.1药脂比
[0084] 针对PTX与DOTAP之间质量比的确定，本实施例进行了1:5,1:10,1:15,1:20,1:25(PTX:DOTAP)这五个比例的筛选，先后以包封率和载药量进行评价。
[0085] 当PTX:DOTAP在1:10之后，其包封率就已经大于90％，而后的增长不大，但其载药量却会因此大幅度下降，所以应该选择1:12,1:15,1:18进行进一步筛选，而且后续的考察
都应该以载药量为主。
都应该以载药量为主。
[0086] 1.2脂质浓度
[0087] 针对DOTAP质量浓度的确定，本实施例进行了对0.5,1,2,3,4mg/ml这五个量的筛选，以载药量为评价指标。当DOTAP脂质浓度在2mg/ml左右具有最好的载药量，所以应该选
择1.5,2.0,2.5mg/ml进行进一步筛选。
择1.5,2.0,2.5mg/ml进行进一步筛选。
[0088] 1.3水化温度
[0089] 针对超声时水化温度的确定，本实施例选择20,30,40,50,60℃这五个量进行筛选，以载药量为考察指标。当超声时水化温度在30℃左右时具有最好的载药量，所以应该选
择25,30,35℃进行进一步筛选。
择25,30,35℃进行进一步筛选。
[0090] 1.4超声时间
[0091] 针对超声时间的确定，本实施例选择了20s,40s,1min,5min,10min,15min这五个量进行筛选，以载药量为考察指标。当超声时间在40s左右时具有最好的载药量，所以应该
选择30s,40s,50s进行进一步筛选。
选择30s,40s,50s进行进一步筛选。
[0092] 1.5超声功率
[0093] 针对超声功率的确定，本实施例选择了100,80,60,40,20％这五个量进行筛选，以载药量为考察指标，不同超声功率制备的脂质体载药量基本不发生变化，超声功率的变化
对载药量基本无影响。
对载药量基本无影响。
[0094] 1.6旋蒸水浴温度
[0095] 针对旋蒸水浴温度的确定，本实施例选择了20,30,40,50,60℃这五个量进行筛选，以载药量为考察指标，温度从20℃变化至60℃，但载药量基本不发生变化，证明旋蒸水
浴温度的变化不会对载药量基本无影响。
浴温度的变化不会对载药量基本无影响。
[0096] 2.正交设计法优化处方
[0097] 单因素实验结果表明，对PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑Heparin/protamine纳米粒影响较大的因素有：药脂比(A)、脂质浓度(B)、水化温度(C)、超声时间(D)，通过正交设计L9(3
^4)表，作为考察的参数评定各个处方，下表分别是因素水平表和正交设计的考察结果。
^4)表，作为考察的参数评定各个处方，下表分别是因素水平表和正交设计的考察结果。
[0098] 表1 正交实验因素及水平表
[0099]
[0100] 表2 正交实验结果
[0101]
[0102] 结合正交试验和单因素实验确定最终处方为：PTX:DOTAP为1:12，DOTAP脂质浓度为1.5mg/ml，水化温度为35℃，超声时间为50s。当药物与脂质的比例为1:12时，PTX‑DOTAP
具有较好的载药量(7.67％±0.01)和包封率(99.70％±0.15)，脂质浓度为1.5mg/ml，水化
温度为35℃，超声时间为50秒。粒径为52.70±1.491nm(PDI：0.163±0.012)，ζ电位为44.5
±0.872mV。PTX‑DOTAP的电子显微照片显示出圆形和均匀的粒径。
具有较好的载药量(7.67％±0.01)和包封率(99.70％±0.15)，脂质浓度为1.5mg/ml，水化
温度为35℃，超声时间为50秒。粒径为52.70±1.491nm(PDI：0.163±0.012)，ζ电位为44.5
±0.872mV。PTX‑DOTAP的电子显微照片显示出圆形和均匀的粒径。
[0103] 3.Alloferon‑1‑Heparin/protamine的比例筛选
[0104] 本实施例中，针对Alloferon‑1‑Heparin/protamine的比例进行筛选，其中，Alloferon‑1的序列如SEQ ID NO:1所示。在室温搅拌下，将0.3mg/ml鱼精蛋白缓慢滴加入
至0.3mg/ml肝素中，设计出一系列protamine和heparin的比例梯度曲线。以Alloferon‑1‑
Heparin/protamine的电位变化为评价指标，结果如下表所示：
至0.3mg/ml肝素中，设计出一系列protamine和heparin的比例梯度曲线。以Alloferon‑1‑
Heparin/protamine的电位变化为评价指标，结果如下表所示：
[0105] 表3 Heparin/protamine的比例筛选
[0106]
[0107] 如图2c)所示，当protamine:heparin质量比在0.125时，制剂成分的比例达到饱和。
[0108] 4.PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑Heparin/protamine纳米粒的成分比例筛选
[0109] 本实施例中，在室温搅拌下，将PTX‑DOTAP(0.5ml 1.5mg/ml DOTAP)缓慢滴加入至0.3mg/ml Alloferon‑1‑Heparin/protamine中，设计出一系列(protamine+heparin)与
DOTAP的比例梯度曲线。以PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑Heparin/protamine的电位变化为评价
指标，结果如下：
DOTAP的比例梯度曲线。以PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑Heparin/protamine的电位变化为评价
指标，结果如下：
[0110] 表4 肝素小球‑DOTAP比例筛选表
[0111]
[0112] 如图3a)所示，当(protamine+heparin)：DOTAP质量比在4.85时，制剂成分的比例达到饱和。此时，纳米颗粒的电子显微照片显示出均匀的形状和粒径，在背景中没有多余的
heparin/Protamine。
heparin/Protamine。
[0113] 5.DOTAP比例偏多时制剂的表征
[0114] 本实施例选择了(protamine+heparin)：DOTAP质量比为4.2和3.0两个比例时进行PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑Heparin/protamine纳米粒的制备，并且未使用1000KD的透析带
除去多余的Alloferon‑1‑Heparin/protamine纳米粒。
除去多余的Alloferon‑1‑Heparin/protamine纳米粒。
[0115] 如图3所示，当制剂中DOTAP的比例升高时，纳米粒的粒径会变得十分大，超过200nm，甚至达到500nm，且粒径十分不均一，还有许多未被除去的Alloferon‑1‑Heparin/
protamine纳米粒。
protamine纳米粒。
[0116] 6.Alloferon‑1‑Heparin/protamine纳米粒理化性质考察
[0117] 6.1形态
[0118] 取适量Alloferon‑1‑Heparin/protamine纳米粒溶液于西林瓶中，观察其外观呈现淡蓝色乳光。再取一到两滴Alloferon‑1‑Heparin/protamine纳米粒溶液，用蒸溜水适当
稀释，滴加在铜片上，用2％的磷钨酸溶液染色，烘干30min，通过透射电子显微镜观察微观
形态。TEM下醇质体形态圆整，表面光滑没有黏连，粒径大小分布均匀。
稀释，滴加在铜片上，用2％的磷钨酸溶液染色，烘干30min，通过透射电子显微镜观察微观
形态。TEM下醇质体形态圆整，表面光滑没有黏连，粒径大小分布均匀。
[0119] 6.2粒径与电势
[0120] 取制备好的Alloferon‑1‑Heparin/protamine纳米粒溶液适量，稀释适当倍数后采用动态光散射仪测定用马尔文激光粒度仪测得粒径为26.19±1.631nm(PDI:0.146±
0.018)；zeta电位稳定在‑42.4±0.246–mV。
0.018)；zeta电位稳定在‑42.4±0.246–mV。
[0121] 7.PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑Heparin/Protamine的制备
[0122] (1)PTX‑DOTAP的制备
[0123] 将0.550ml 1mg/ml PTX(溶解在氯仿中)和6.616ml 1mg/ml DOTAP(溶解在氯仿中)均匀混合，然后在室温下旋转蒸发15分钟。随后，在一定温度下在超声波下将4.411ml水
缓慢加入烧瓶中，并将其超声处理一定时间。
缓慢加入烧瓶中，并将其超声处理一定时间。
[0124] 依据单因素考察的研究结果，该步骤中，超声水化温度可在20～40℃中进行选择，超声时间在30～60s中进行选择，均能实现良好的载药效果。
[0125] (2)Alloferon‑1‑Heparin/鱼精蛋白聚电解质复合物的制备
[0126] 将15.33ml 0.3mg/ml硫酸鱼精蛋白和0.42ml 0.3mg/ml alloferon‑1混合后，在室温搅拌下将混合物缓慢滴加到91.215ml 0.3mg/ml肝素钠溶液中并搅拌30分钟
(600rpm)。
(600rpm)。
[0127] (3)制备PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑肝素/鱼精蛋白
[0128] 在室温下搅拌下，将4.411ml PTX‑DOTAP缓慢滴加到106.97ml Alloferon‑1‑肝素/鱼精蛋白聚电解质复合物中，并搅拌10分钟(200rpm)。然后在1000KD透析袋中透析10分
钟以除去轻微过量的Alloferon‑1‑Heparin/鱼精蛋白。
钟以除去轻微过量的Alloferon‑1‑Heparin/鱼精蛋白。
[0129] 8.PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑Heparin/protamine纳米粒理化性质考察
[0130] 8.1形态
[0131] 取适量PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑Heparin/protamine纳米粒溶液于西林瓶中，观察其外观呈现淡蓝色乳光。再取一到两滴PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑Heparin/protamine纳
米粒溶液，用蒸溜水适当稀释，滴加在铜片上，用2％的磷钨酸溶液染色，烘干30min，通过透
射电子显微镜观察微观形态。TEM下醇质体形态圆整，表面光滑没有黏连，粒径大小分布均
匀。
米粒溶液，用蒸溜水适当稀释，滴加在铜片上，用2％的磷钨酸溶液染色，烘干30min，通过透
射电子显微镜观察微观形态。TEM下醇质体形态圆整，表面光滑没有黏连，粒径大小分布均
匀。
[0132] 8.2粒径与电势
[0133] 取制备好的PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑Heparin/protamine纳米粒溶液适量，稀释适当倍数后采用动态光散射仪测定用马尔文激光粒度仪测得粒径为106.1±1.113nm(PDI:
0.147±0.005)；zeta电位稳定在‑45.1±0.455mV。
0.147±0.005)；zeta电位稳定在‑45.1±0.455mV。
[0134] 实施例2 PTX‑DOTAP@alloferon‑1‑heparin/Protamine的体外释放行为
[0135] 本实施例中，针对PTX‑DOTAP@alloferon‑1‑heparin/Protamine的体外释放行为2+
进行研究。采用0.01nM Tris‑HCl(pH＝6.5)模拟肿瘤微环境，使用20nM Ca 模拟肿瘤微环
2+
境中的Ca 浓度并增强乙酰肝素酶‑1活性。依据图5b)所示，游离alloferon‑1和游离PTX的
释放量分别在6小时内分别为85.22±0.82％和90.01±1.41％，上述两组快速完成了释放。
50μl0.0833IU/ml肝素酶的PTX‑DOTAP@alloferon‑1‑heparin/Protamine组从0小时释放
alloferon‑1，其释放速率在10小时时显着降低。PTX组从2小时后迅速释放，因为纳米颗粒
核心中的PTX受到alloferon‑1‑heparin/Protamine层的保护，并且没有突然释放，释放速
率在16小时时显着降低。最后，PTX和alloferon‑1的释放量分别为83.82±1.12％和81.67
±0.76％。在未加肝素酶的PTX‑DOTAP@alloferon‑1‑heparin/Protamine组中，在整个释放
实验中仅释放12.77±1.58％的PTX和8.43±1.79％的alloferon‑1，表明PTX‑DOTAP@
alloferon‑1‑heparin/Protamine纳米粒子可以为内部药物提供出色的保护。如图5c)显示
释放过程中每组的表观现象和电子显微镜照片，其中，纳米颗粒的存在使溶液显示出淡蓝
色的乳光。5min时，酶组和酶+电解质组变浑浊，生成了不溶的白色絮状物，显示alloferon‑
1‑heparin/Protamine(PTX‑DOTAP@alloferon‑1‑heparin/Protamine纳米颗粒的最外层)
酶促水解，并逐渐释放肝素，暴露出一部分带正电荷的鱼精蛋白。6小时后，纳米颗粒聚集体
的颜色变得更白，表明PTX‑DOTAP@alloferon‑1‑heparin/Protamine制剂的alloferon‑1‑
heparin/Protamine层被肝素酶显着降解并通过离子扩散分离。在6小时时，电解质组变得
非常浑浊，并且溶液含有大量白絮。这是由于电解质引起的离子扩散，因此PTX‑DOTAP@
alloferon‑1‑heparin/Protamine的alloferon‑1‑heparin/Protamine层也慢慢解离，表面
排出的纳米颗粒聚集在一起。然而，没有heparin酶的参与，这种物理现象的进展显着减少。
在12小时时，酶+电解质组变得非常清澈，溶液中的白色絮凝物几乎完全消失。电子显微照
片还显示该溶液仅含有少量粒径为约50nm的独立纳米颗粒。这是heparin酶和离子扩散相
结合的结果，导致PTX‑DOTAP@alloferon‑1‑heparin/Protamine制剂的alloferon‑1‑
heparin/Protamine层几乎完全脱离，暴露内部DOTAP核心。测量结果表明此时溶液中纳米
颗粒的粒度和电位分别为59.30±0.783nm(PDI：0.234±0.032)和25.4±0.257mV。根据释
放实验测得的PTX和alloferon‑1的释放量，单独电解质的离子扩散不能促进PTX‑DOTAP@
alloferon‑1‑heparin/Protamine的解聚。只有肝素酶和离子扩散的协同效应导致制剂几
乎完全解离，实现纳米颗粒的粒度减小和电荷转换。因此，当纳米颗粒到达肿瘤部位时，颗
粒尺寸减小过程将使纳米颗粒的颗粒尺寸从大约100nm改变到50nm，以增加进入肿瘤的纳
米颗粒的量。
进行研究。采用0.01nM Tris‑HCl(pH＝6.5)模拟肿瘤微环境，使用20nM Ca 模拟肿瘤微环
2+
境中的Ca 浓度并增强乙酰肝素酶‑1活性。依据图5b)所示，游离alloferon‑1和游离PTX的
释放量分别在6小时内分别为85.22±0.82％和90.01±1.41％，上述两组快速完成了释放。
50μl0.0833IU/ml肝素酶的PTX‑DOTAP@alloferon‑1‑heparin/Protamine组从0小时释放
alloferon‑1，其释放速率在10小时时显着降低。PTX组从2小时后迅速释放，因为纳米颗粒
核心中的PTX受到alloferon‑1‑heparin/Protamine层的保护，并且没有突然释放，释放速
率在16小时时显着降低。最后，PTX和alloferon‑1的释放量分别为83.82±1.12％和81.67
±0.76％。在未加肝素酶的PTX‑DOTAP@alloferon‑1‑heparin/Protamine组中，在整个释放
实验中仅释放12.77±1.58％的PTX和8.43±1.79％的alloferon‑1，表明PTX‑DOTAP@
alloferon‑1‑heparin/Protamine纳米粒子可以为内部药物提供出色的保护。如图5c)显示
释放过程中每组的表观现象和电子显微镜照片，其中，纳米颗粒的存在使溶液显示出淡蓝
色的乳光。5min时，酶组和酶+电解质组变浑浊，生成了不溶的白色絮状物，显示alloferon‑
1‑heparin/Protamine(PTX‑DOTAP@alloferon‑1‑heparin/Protamine纳米颗粒的最外层)
酶促水解，并逐渐释放肝素，暴露出一部分带正电荷的鱼精蛋白。6小时后，纳米颗粒聚集体
的颜色变得更白，表明PTX‑DOTAP@alloferon‑1‑heparin/Protamine制剂的alloferon‑1‑
heparin/Protamine层被肝素酶显着降解并通过离子扩散分离。在6小时时，电解质组变得
非常浑浊，并且溶液含有大量白絮。这是由于电解质引起的离子扩散，因此PTX‑DOTAP@
alloferon‑1‑heparin/Protamine的alloferon‑1‑heparin/Protamine层也慢慢解离，表面
排出的纳米颗粒聚集在一起。然而，没有heparin酶的参与，这种物理现象的进展显着减少。
在12小时时，酶+电解质组变得非常清澈，溶液中的白色絮凝物几乎完全消失。电子显微照
片还显示该溶液仅含有少量粒径为约50nm的独立纳米颗粒。这是heparin酶和离子扩散相
结合的结果，导致PTX‑DOTAP@alloferon‑1‑heparin/Protamine制剂的alloferon‑1‑
heparin/Protamine层几乎完全脱离，暴露内部DOTAP核心。测量结果表明此时溶液中纳米
颗粒的粒度和电位分别为59.30±0.783nm(PDI：0.234±0.032)和25.4±0.257mV。根据释
放实验测得的PTX和alloferon‑1的释放量，单独电解质的离子扩散不能促进PTX‑DOTAP@
alloferon‑1‑heparin/Protamine的解聚。只有肝素酶和离子扩散的协同效应导致制剂几
乎完全解离，实现纳米颗粒的粒度减小和电荷转换。因此，当纳米颗粒到达肿瘤部位时，颗
粒尺寸减小过程将使纳米颗粒的颗粒尺寸从大约100nm改变到50nm，以增加进入肿瘤的纳
米颗粒的量。
[0136] 实施例3 PTX‑DOTAP@alloferon‑1‑heparin/Protamine的细胞摄取评估
[0137] 本实施例中以B16F10细胞为模型评估肿瘤细胞对纳米粒的摄取效果，通过香豆素6指示细胞摄取情况。通过荧光显微镜测定荧光强度。如图6所示，游离C6组即空白组荧光强
度最低。C6‑DOTAP组的荧光强度最强，表明肿瘤微环境中，PTX‑DOTAP@alloferon‑1‑
heparin/Protamine能够在酶促降解作用下暴露带正电荷的DOTAP，增加了纳米颗粒的细胞
摄取效率。
度最低。C6‑DOTAP组的荧光强度最强，表明肿瘤微环境中，PTX‑DOTAP@alloferon‑1‑
heparin/Protamine能够在酶促降解作用下暴露带正电荷的DOTAP，增加了纳米颗粒的细胞
摄取效率。
[0138] 另外，香豆素6‑HEP NP和肝素预孵育+香豆素6‑HEP NP对纳米颗粒的摄取远高于游离香豆素6。用肝素预孵育细胞不影响细胞摄取香豆素6‑HEP NP，表明肝素分子没有肿瘤
靶向。最后，进行香豆素6‑CS NP和香豆素6‑HA NP的摄取。与香豆素6‑HEP NP相比，结果显
示透明质酸和硫酸软骨素对肿瘤具有一定的靶向作用，并增强了肿瘤细胞对纳米颗粒的摄
取。
靶向。最后，进行香豆素6‑CS NP和香豆素6‑HA NP的摄取。与香豆素6‑HEP NP相比，结果显
示透明质酸和硫酸软骨素对肿瘤具有一定的靶向作用，并增强了肿瘤细胞对纳米颗粒的摄
取。
[0139] 实施例4 PTX‑DOTAP@alloferon‑1‑heparin/Protamine的体外细胞毒性测定
[0140] 本实施例中，采用细胞计数试剂盒(CCK)‑8(Cell Counting Kit‑8，BestBio，Shanghai，China)，测量不同纳米颗粒的体外细胞毒性。
[0141] 将B16‑F10细胞接种于96孔板中，37℃，6000个细胞/孔，在100μL完全培养基中培养过夜。将空白NP(DOTAP@heparin/Protamine)，游离PTX，游离alloferon‑1，游离组合，PTX
NP(PTX‑DOTAP@heparin/Protamine)，alloferon‑1 NP(DOTAP@alloferon‑1‑heparin/
Protamine)，PTX/alloferon‑1 NP(PTX‑DOTAP@alloferon‑1‑heparin/Protamine)和对照
组(加入等体积的空白完全培养基)以0.003,0.03,0.3，3,30和300μg/mL的紫杉醇浓度加入
各孔中(alloferon‑1的浓度为紫杉醇的八分之一)和0.14,1.4,14,140和1400μg/mL空白纳
米颗粒，并在3℃温育5％CO2持续24小时或48小时。在分析之前，加入CCK‑8溶液(10μL/孔)，
然后进一步温育1小时。设定最大吸光度为450nm，通过酶标仪(BioTek Synergy H1，BioTek
Instruments，Inc.，Winooski，VT，USA)扫描每个孔的光密度(OD)。
NP(PTX‑DOTAP@heparin/Protamine)，alloferon‑1 NP(DOTAP@alloferon‑1‑heparin/
Protamine)，PTX/alloferon‑1 NP(PTX‑DOTAP@alloferon‑1‑heparin/Protamine)和对照
组(加入等体积的空白完全培养基)以0.003,0.03,0.3，3,30和300μg/mL的紫杉醇浓度加入
各孔中(alloferon‑1的浓度为紫杉醇的八分之一)和0.14,1.4,14,140和1400μg/mL空白纳
米颗粒，并在3℃温育5％CO2持续24小时或48小时。在分析之前，加入CCK‑8溶液(10μL/孔)，
然后进一步温育1小时。设定最大吸光度为450nm，通过酶标仪(BioTek Synergy H1，BioTek
Instruments，Inc.，Winooski，VT，USA)扫描每个孔的光密度(OD)。
[0142] 相对细胞存活率(RCV)(％)计算为RCV(％)＝OD测试/OD对照×100％，其中OD测试和OD对照分别代表用测试组和对照组处理的细胞的OD。将实验独立重复六次，并使用
GraphPad Prism 7.0软件计算测试组的半数最大抑制浓度(IC50)。
GraphPad Prism 7.0软件计算测试组的半数最大抑制浓度(IC50)。
[0143] 为了在体外探索诱导细胞凋亡的特性，将B16‑F10细胞以2×105个细胞/孔的密度接种在12孔板中。在与不同组的游离药物或纳米颗粒共培养后，通过流式细胞术
(CytExpert 3.0软件)在30分钟内检测。
(CytExpert 3.0软件)在30分钟内检测。
[0144] 将B16‑F10接种于6孔板中，接种密度为5×105个细胞/孔，加入不同组的游离药物或纳米颗粒处理。温育24小时后，收集细胞通过流式细胞术(FACSCalibur，BD
Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA)分析碘化丙啶的强度和分布。使用ModFit 3.1软件
分析和处理数据。研究结果表明，同等浓度的给药剂量，PTX/alloferon‑1 NP组具有最强的
细胞毒性，能够显著降低肿瘤细胞活力，并且随着用药浓度的提高抑制作用也随之增强。各
组药物对细胞周期的影响如图7所示，PTX阻滞了G2/M期的细胞增殖周期，而PTX/
alloferon‑1 NP则进一步增加了细胞对药物的摄取。
Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA)分析碘化丙啶的强度和分布。使用ModFit 3.1软件
分析和处理数据。研究结果表明，同等浓度的给药剂量，PTX/alloferon‑1 NP组具有最强的
细胞毒性，能够显著降低肿瘤细胞活力，并且随着用药浓度的提高抑制作用也随之增强。各
组药物对细胞周期的影响如图7所示，PTX阻滞了G2/M期的细胞增殖周期，而PTX/
alloferon‑1 NP则进一步增加了细胞对药物的摄取。
[0145] 实施例5肿瘤异种移植小鼠模型和小鼠生物分布的测定
[0146] 所有体内小鼠实验均经山东大学动物保护和使用委员会批准。以1×106数量在3
C57BL/6小鼠(6‑8周龄)右侧腹侧皮下接种B16‑F10细胞。当肿瘤体积达到200mm时，将B16‑
F10荷瘤小鼠随机分组(n＝3)，静脉注射游离DiR，DiR‑HEP/DOTAP(DiR‑)DOTAP@heparin/
Protamine)，DiR‑DOTAP和DiR‑HA/DOTAP(DiR‑DOTAP@透明质酸/Protamine)，剂量为100μg/
kg。
C57BL/6小鼠(6‑8周龄)右侧腹侧皮下接种B16‑F10细胞。当肿瘤体积达到200mm时，将B16‑
F10荷瘤小鼠随机分组(n＝3)，静脉注射游离DiR，DiR‑HEP/DOTAP(DiR‑)DOTAP@heparin/
Protamine)，DiR‑DOTAP和DiR‑HA/DOTAP(DiR‑DOTAP@透明质酸/Protamine)，剂量为100μg/
kg。
[0147] 在给药后1小时、4小时、12小时和24小时，麻醉小鼠。通过Xenogen IVIS Lumina系统(Caliper Life Sciences，Waltham，MA，USA)获得实时图像。24小时后处死小鼠，收获心
脏，肺，肝，脾，肾和肿瘤用于离体成像。在Living Image 4.1软件(Caliper Life
Sciences，Waltham，MA，USA)中分析图像。结果如图8所示，DiR‑HEP/DOTAP和DiR‑HA/DOTAP
组在24小时时具有良好的长循环能力和在肿瘤处的一定积累。结果还表明，游离DiR，DiR‑
DOTAP和DiR‑HA/DOTAP具有更多的主要器官积累，而DiR‑HEP/DOTAP具有较少的肝脏积累
(图8b))。
脏，肺，肝，脾，肾和肿瘤用于离体成像。在Living Image 4.1软件(Caliper Life
Sciences，Waltham，MA，USA)中分析图像。结果如图8所示，DiR‑HEP/DOTAP和DiR‑HA/DOTAP
组在24小时时具有良好的长循环能力和在肿瘤处的一定积累。结果还表明，游离DiR，DiR‑
DOTAP和DiR‑HA/DOTAP具有更多的主要器官积累，而DiR‑HEP/DOTAP具有较少的肝脏积累
(图8b))。
[0148] (1)体内抗肿瘤研究
[0149] 为了评估纳米颗粒的抗肿瘤功效和安全性，将1×106B16‑F10细胞皮下注射到每3
只C57BL/6小鼠中。当肿瘤体积达到100mm时，将小鼠随机分成8组(n＝8)，静脉注射100μ
LPBS、空白NP(DOTAP@heparin/Protamine)、游离PTX、游离alloferon‑1、游离组合、PTX NP
(PTX‑DOTAP@heparin/Protamine)，alloferon‑1 NP(DOTAP@alloferon‑1‑heparin/
Protamine)和PTX/alloferon‑1 NP(PTX‑DOTAP@alloferon‑1‑heparin/Protamine)紫杉醇
剂量为10mg/kg，alloferon‑1剂量为1.25mg/kg。每3天测量肿瘤体积和重量以观察体内抗
肿瘤效力和毒性。给药结束后，收集肿瘤和器官(心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏)固定用于
TUNEL，Ki67和heparanese‑1染色。使用GraphPad Prism 7.0，在Kaplan‑Meier存活分数后
分析小鼠的存活时间。研究结果表明PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑Heparin/Protamine可增强
肿瘤抑制并延缓肿瘤生长。
只C57BL/6小鼠中。当肿瘤体积达到100mm时，将小鼠随机分成8组(n＝8)，静脉注射100μ
LPBS、空白NP(DOTAP@heparin/Protamine)、游离PTX、游离alloferon‑1、游离组合、PTX NP
(PTX‑DOTAP@heparin/Protamine)，alloferon‑1 NP(DOTAP@alloferon‑1‑heparin/
Protamine)和PTX/alloferon‑1 NP(PTX‑DOTAP@alloferon‑1‑heparin/Protamine)紫杉醇
剂量为10mg/kg，alloferon‑1剂量为1.25mg/kg。每3天测量肿瘤体积和重量以观察体内抗
肿瘤效力和毒性。给药结束后，收集肿瘤和器官(心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏)固定用于
TUNEL，Ki67和heparanese‑1染色。使用GraphPad Prism 7.0，在Kaplan‑Meier存活分数后
分析小鼠的存活时间。研究结果表明PTX‑DOTAP@Alloferon‑1‑Heparin/Protamine可增强
肿瘤抑制并延缓肿瘤生长。
[0150] (2)免疫相关的体内研究
[0151] 为了探索NK细胞和体内CD8+T细胞活化，本实施例通过颗粒酶B，NKG2D，CD94，IFN‑γ和TNF‑α来评估alloferon‑1诱导的抗肿瘤免疫应答。以携带B16‑F10的C57BL/6小鼠为模
型静脉内注射不同的制剂后处死小鼠，获取肿瘤组织进行免疫组织化学染色，并使用相应
的ELISA试剂盒测试外周血清免疫因子。在该研究中使用抗小鼠mAb。抗颗粒酶B、抗CD8+、
抗‑NKG2D、抗CD94、抗IFN‑γ、抗TNF‑α、IFN‑γELISA和TNF‑αELISA购自Abcam(Cambridge，
UK)和HuaBio(中国杭州)。使用激光扫描共聚焦显微镜(LSM 780，Carl Zeiss，Oberkochen
Germany)获取图像。其中，小鼠外周血中IFN‑γ和TNF‑α水平的变化如图9a)和b)所示，肿瘤
切片中NKG2D和CD94的免疫荧光结果如图9c)和d)所示。
型静脉内注射不同的制剂后处死小鼠，获取肿瘤组织进行免疫组织化学染色，并使用相应
的ELISA试剂盒测试外周血清免疫因子。在该研究中使用抗小鼠mAb。抗颗粒酶B、抗CD8+、
抗‑NKG2D、抗CD94、抗IFN‑γ、抗TNF‑α、IFN‑γELISA和TNF‑αELISA购自Abcam(Cambridge，
UK)和HuaBio(中国杭州)。使用激光扫描共聚焦显微镜(LSM 780，Carl Zeiss，Oberkochen
Germany)获取图像。其中，小鼠外周血中IFN‑γ和TNF‑α水平的变化如图9a)和b)所示，肿瘤
切片中NKG2D和CD94的免疫荧光结果如图9c)和d)所示。
[0152] (3)PTX‑DOTAP@alloferon‑1‑heparin/Protamine对主要器官的毒性研究
[0153] 为了检查纳米颗粒在体内的安全性，将固定的重要器官(心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏)包埋在石蜡中，切片，苏木精和曙红染色。使用VS120虚拟载玻片显微镜(Olympus
Corp.，Tokyo，Japan)观察染色的切片并拍照。使用丙氨酸氨基转移酶(ALT)ELISA试剂盒，
天冬氨酸氨基转移酶(AST)ELISA试剂盒和血尿素氮(BUN)ELISA试剂盒测试外周血清指标，
检测结果如表5和图10所示。
Corp.，Tokyo，Japan)观察染色的切片并拍照。使用丙氨酸氨基转移酶(ALT)ELISA试剂盒，
天冬氨酸氨基转移酶(AST)ELISA试剂盒和血尿素氮(BUN)ELISA试剂盒测试外周血清指标，
检测结果如表5和图10所示。
[0154] 表5不同用药组血清中AST,ALT,及BUN含量(n＝3)
[0155]
[0156] ALT，丙氨酸氨基转移酶；AST，天冬氨酸氨基转移酶；BUN，血尿素氮
[0157] (4)统计分析
[0158] 数据表示为平均值±标准偏差。单因素和双向方差分析用于多重比较。在比较所有组时进行Bonferroni后测试，并且在比较两组时使用双尾t检验。在两个独立实验中重复
体内肿瘤治疗研究以确保足够的样本大小和再现性。所有统计分析均使用GraphPad Prism
和SPSS 19.0软件进行。统计显着性如下：*p<0.05，**p<0.01，和***p<0.001。
体内肿瘤治疗研究以确保足够的样本大小和再现性。所有统计分析均使用GraphPad Prism
和SPSS 19.0软件进行。统计显着性如下：*p<0.05，**p<0.01，和***p<0.001。
[0159] 以上所述仅为本公开的优选实施例而已，并不用于限制本公开，对于本领域的技术人员来说，本公开可以有各种更改和变化。凡在本公开的精神和原则之内，所作的任何修
改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。
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