一种含醉茄素A的药物组合物及其应用

摘要

本发明提供了一种含醉茄素A的药物组合物及其应用，属于医学和生物学技术领域，包括醉茄素A和槲皮素，所述醉茄素A与槲皮素的质量比为1:(1～1500)。在本发明中，在醉茄素A与槲皮素的质量比下能够防治神经退行性疾病，对神经元进行保护，改善黑质酪氨酸羟化酶阳性神经元分布和形态，治疗神经炎症，不仅明显降低各自使用剂量，更能达到优于单独使用的效果。

权利要求

1.一种含醉茄素A的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由醉茄素A和槲皮素组成，所述醉茄素A与槲皮素的质量比为1:1500。

2.权利要求1所述的药物组合物在制备防治帕金森的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物以醉茄素A和槲皮素为活性成分，还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型选自片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液和缓释剂中的一种或几种。

说明书

一种含醉茄素A的药物组合物及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于医学和生物学技术领域，尤其涉及一种含醉茄素A的药物组合物及其应用。

背景技术

[0002] 神经退行性疾病是机体神经元结构或功能逐渐丧失而引发的一类疾病，包括帕金森疾病、阿尔兹海默病、亨廷顿氏病等；目前这类疾病病因尚不明确，且尚无有效治愈手段，并严重威胁着患者的生活质量。

[0003] 阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种起病隐匿的与年龄相关的慢性进行性发展的中枢神经系统变性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征，病因迄今未明。随着全球人口老龄化，阿尔茨还没到发病率呈现显著的上升趋势，同时，因其严重危害患者的身心健康和生存质量，给家庭及社会带来沉重的负担，使其成为严重的社会公共卫生问题，是当前急需解决的问题。

[0004] 帕金森病(Parkinson's disease,PD)，又名震颤麻痹，是一种常见于中老年的神经系统变性疾病。临床上以静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势平衡障碍为主要特征。其发病率较高，不仅呈年龄递增、亦呈低龄化，并有全球化高发趋势。帕金森病最主要病理改变为中脑黑质(substantia nigra,SN)多巴胺(dopamine,DA)能神经元变性死亡，黑质-纹状体(striatum)多巴胺能通路变性，纹状体多巴胺递质水平显著降低，且多巴胺递质降低程度与患者症状严重程度呈正相关；残存的多巴胺能神经元胞质内病理性标记物路易小体(lewy's body)的形成，其主要成分是α-突触核蛋白(α-synuclein)。帕金森病病因尚不完全清楚，目前认为与遗传因素、环境因素、氧化应激、兴奋性毒性、线粒体功能障碍和细胞凋亡等多种因素相关。

[0005] 现阶段帕金森病临床诊断主要依靠病史、临床症状及体征，动物模型中辅以检测黑质、纹状体酪氨酸羟化酶水平变化。其中，酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)是儿茶酚胺类活性物质生物合成的限速酶，在多巴胺生物合成的调节中发挥重要作用，因此，该酶在生物体内，尤其是在黑质、纹状体中活性和表达量的变化，直接影响L-多巴胺的生物合成。因此，酪氨酸羟化酶水平是评价黑质、纹状体中，多巴胺能神经元水平变化的常用指标。小鼠帕金森病模型中，主要以MPTP诱导黑质多巴胺能神经元凋亡，模拟临床帕金森病发病症状；以及在小鼠黑质中过表达路易小体主要成分α-突触核蛋白实现。

[0006] 现阶段，神经退行性疾病主要治疗目的是延缓疾病的进展、控制疾病的症状；治疗方法是通过药物缓解患者发病进程和患病程度；多数患者症状可因药物治疗而得到缓解，但不能阻止病变的进展，且常因副作用过大而被迫停药，或因久服药效减弱。因此，寻找一种有效预防、治疗神经退行性疾病的药物，提升患者生存质量，是当前急需解决的问题。

[0007] 醉茄素A(withaferinA)是从印度阿育吠陀传统草药南非醉茄中提取的天然甾体类化合物，易溶于有机溶剂，难溶于水。研究证明，醉茄素A具有抗炎、抗肿瘤、神经保护、心血管保护作用等，且能有效缓解焦虑、认知障碍、失眠等症状。2016年一篇发表在《Nature Medicine》上的文章指出，醉茄素A能显著抵抗高脂饮食诱导的肥胖，并改善肥胖小鼠的葡萄糖稳态。此外，也有报道表明，醉茄素A有效降低活性氧水平、调节线粒体功能、参与凋亡调控等，这些因素与帕金森病发病密切相关，提示醉茄素A可能是有效预防、治疗帕金森病的药物。

[0008] 槲皮素(quercetin)化学名为3,3',4',5,7-五羟基黄酮，存在于许多植物的花、叶、果实中，其药理作用广泛，具有抗癌、抗炎、心血管系统保护等作用。但因其水难溶性及高剂量毒性较强等特性，故临床上很少将其应用于神经系统疾病的预防和治疗。

[0009] 医药领域人员在利用醉茄素A和槲皮素时，会不可避免地抑制细胞活性，该问题无法解决，此外，因其具有一定的毒性且有轻微的中枢神经抑制作用，所以，使用醉茄素作为药物治疗神经退行性疾病，发挥神经保护作用仍存在一定的障碍。

发明内容

[0010] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种含醉茄素A的药物组合物及其应用，所述醉茄素A与槲皮素在质量比为1:(1～1500)下能够防治神经退行性疾病，不仅明显降低各自使用剂量，更能达到优于单独使用的效果。

[0011] 为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

[0012] 本发明提供了一种含醉茄素A的药物组合物，包括醉茄素A和槲皮素，所述醉茄素A与槲皮素的质量比为1:(1～1500)。

[0013] 本发明还提供了上述技术方案所述的药物组合物在制备防治神经退行性疾病的药物中的应用。

[0014] 优选的，所述神经退行性疾病包括帕金森病和/或阿尔茨海默病。

[0015] 本发明还提供了上述技术方案所述的药物组合物在制备神经元保护的药物中的应用。

[0016] 优选的，通过提升神经细胞的细胞存活，发挥神经元保护。

[0017] 优选的，通过抗凋亡发挥神经元保护作用。

[0018] 本发明还提供了上述技术方案所述的药物组合物在制备改善黑质酪氨酸羟化酶阳性神经元分布和形态的药物中的应用。

[0019] 本发明还提供了上述技术方案所述的药物组合物在制备治疗神经炎症药物中的应用。

[0020] 优选的，所述药物以醉茄素A和槲皮素为活性成分，还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分。

[0021] 优选的，所述药物的剂型包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液和缓释剂中的一种或几种。

[0022] 本发明提供了一种含醉茄素A的药物组合物及其应用，所述醉茄素A与槲皮素的质量比为1:(1～1500)。所述醉茄素A与槲皮素在质量比为1:(1～1500)下能够防治神经退行性疾病，对神经元进行保护，改善黑质酪氨酸羟化酶阳性神经元分布和形态，治疗神经炎症，不仅明显降低各自使用剂量，更能达到优于单独使用的效果。

附图说明

[0023] 图1为MPTP诱导的帕金森病模型组和对照组中，分别腹腔注射对照溶剂、醉茄素A、槲皮素以及醉茄素A+槲皮素(剂量减半)7天后，小鼠行为学指标的变化情况；

[0024] 图2为MPTP诱导的帕金森病模型组和对照组中，分别腹腔注射对照溶剂、醉茄素A、槲皮素以及醉茄素A+槲皮素(剂量减半)7天后，小鼠黑质致密部酪氨酸羟化酶阳性神经元形态；

[0025] 图3为MPTP诱导的帕金森病模型组和对照组中，分别腹腔注射对照溶剂、醉茄素A、槲皮素以及醉茄素A+槲皮素(剂量减半)7天后，小鼠纹状体酪氨酸羟化酶水平变化；

[0026] 图4为MPTP诱导的帕金森病模型组和对照组中，分别腹腔注射对照溶剂、醉茄素A、槲皮素以及醉茄素A+槲皮素(剂量减半)7天后，小鼠黑质致密部GFAP阳性和Iba1阳性细胞水平；

[0027] 图5为MPP+损伤的神经细胞加入对照溶剂，醉茄素A、槲皮素以及醉茄素A+槲皮素(剂量减半)后细胞存活率；

[0028] 图6为MPP+损伤的神经细胞加入对照溶剂，醉茄素A、槲皮素以及醉茄素A+槲皮素(剂量减半)后细胞凋亡情况；

[0029] 图7为H2O2造成的氧化损伤的神经细胞加入对照溶剂，醉茄素A、槲皮素以及醉茄素A+槲皮素(剂量减半)后细胞存活率。

具体实施方式

[0030] 本发明提供了一种含醉茄素A的药物组合物，所述醉茄素A与槲皮素的质量比为1:(1～1500)。

[0031] 本发明还提供了上述技术方案所述的药物组合物在制备防治神经退行性疾病的药物中的应用。在本发明中，所述药物优选以醉茄素A和槲皮素为活性成分，还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分。在本发明中，所述药物的剂型优选包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液和缓释剂中的一种或几种。本发明对所述醉茄素A和槲皮素在上述剂型中的用量没有特殊限定，采用常规剂型中药物的用量即可。本发明对所述上述剂型使用的辅料或者辅助性成分的种类和含量没有特殊限定，采用常规即可。

[0032] 本发明对所述醉茄素A和槲皮素的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。

[0033] 在本发明中，所述神经退行性疾病优选包括帕金森病和/或阿尔茨海默病。

[0034] 本发明还提供了上述技术方案所述的药物组合物在制备神经元保护的药物中的应用。在本发明中，通过提升神经细胞的细胞存活，发挥神经元保护；或者通过抗凋亡发挥神经元保护。在本发明中，所述药物优选以醉茄素A和槲皮素为活性成分，还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分。在本发明中，所述药物的剂型优选包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液和缓释剂中的一种或几种。本发明对所述醉茄素A和槲皮素在上述剂型中的用量没有特殊限定，采用常规剂型中药物的用量即可。本发明对所述上述剂型使用的辅料或者辅助性成分的种类和含量没有特殊限定，采用常规即可。

[0035] 本发明还提供了上述技术方案所述的药物组合物在制备改善黑质酪氨酸羟化酶阳性神经元分布和形态的药物中的应用。在本发明中，所述药物优选以醉茄素A和槲皮素为活性成分，还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分。在本发明中，所述药物的剂型优选包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液和缓释剂中的一种或几种。本发明对所述醉茄素A和槲皮素在上述剂型中的用量没有特殊限定，采用常规剂型中药物的用量即可。本发明对所述上述剂型使用的辅料或者辅助性成分的种类和含量没有特殊限定，采用常规即可。

[0036] 本发明还提供了上述技术方案所述的药物组合物在制备治疗神经炎症药物中的应用。在本发明中，所述药物优选以醉茄素A和槲皮素为活性成分，还包括药学上可接受的辅料或辅助性成分。在本发明中，所述药物的剂型优选包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液和缓释剂中的一种或几种。本发明对所述醉茄素A和槲皮素在上述剂型中的用量没有特殊限定，采用常规剂型中药物的用量即可。本发明对所述上述剂型使用的辅料或者辅助性成分的种类和含量没有特殊限定，采用常规即可。

[0037] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0038] 以下实施例所使用的小鼠为：7-8周龄雄性SPF级C57 BL/6小鼠，购买于北京大学医学部实验动物科学部。C57 BL/6小鼠饲养条件：环境温度22±0.5℃，12小时/12小时明暗交替。所有实验数据用均数±标准误表示，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，n＝10。

[0039] 实施例1

[0040] 治疗帕金森病：

[0041] (相关行为学指标)

[0042] MPTP诱导帕金森病模型建立：小鼠适应性饲养1周后，随机选择体重22g以上C57 BL/6小鼠，腹腔注射30mg/kg MPTP溶液，1天1次，连续5天。

[0043] 此时，将MPTP注射组(后文简称模型组)随机分成4组，即模型+对照溶剂组，模型+醉茄素A组，模型+槲皮素组，模型+醉茄素A+槲皮素组。其中，每组小鼠分别腹腔注射醉茄素A(20μg/kg)，槲皮素(30mg/kg),醉茄素A+槲皮素联合用药(醉茄素A10μg/kg，槲皮素15mg/kg)，以及等体积对照溶剂。

[0044] 检测每组药物和对照溶剂腹腔注射7天后，各组行为学指标的变化情况。

[0045] 行为学指标检测：MPTP诱导的帕金森病模型建立后，于各组药物注射第4天(取材前3天)开始进行，在安静、适宜的环境中，进行小鼠行为学指标检测练习，每项实验每日检测3次，以排除其他因素对行为学指标的干扰。

[0046] 1)平衡木实验

[0047] 1.将小鼠移至测试房间，习惯化1h。

[0048] 2.准备一组长100cm，直径分别为10mm、20mm、30mm的圆杆以及宽分别为5mm、15mm、30mm的方杆。

[0049] 3.构建两个离地约50cm的平台，两平台相距约80cm，其中一平台放置一个暗室。将上述最宽杆搭于两平台之间并固定。

[0050] 4.将小鼠头朝前放置于暗室对侧的平台，在其身后用强光或噪音刺激其向前行走，记录其抵达暗室所需时间以及期间后肢打滑次数。

[0051] 5.将宽杆替换为窄杆，测试步骤同理。

[0052] 6.同一批小鼠每天测试5次，连续测试三天，取平均值，结果见表1和图1。

[0053] 表1平衡木实验结果

[0054]

[0055]

[0056] 2)爬杆实验

[0057] 1.将小鼠移至测试房间，习惯化1h。

[0058] 2.准备一根长50-60cm，直径为1-1.5cm的圆杆，用纱布包裹防滑，并将其垂直立放置。

[0059] 3.将小鼠头朝上放置于圆杆顶端，记录其转为头朝下所需时间以及到达圆杆底部所需时间。

[0060] 4.同一批小鼠每天测试5次，连续测试三天，取平均值，结果见表2和图1。

[0061] 表2爬杆实验结果

[0062]

[0063] 3)后肢紧握实验

[0064] 1.将小鼠移至测试房间，习惯化1h。

[0065] 2.抓取小鼠尾巴中间部位将其提起，用摄像机记录其后肢活动状态，共记录20s。

[0066] 3.根据小鼠后肢活动情况进行评分：0分-测试过程中，后肢呈自然张开状态；1分-一侧后肢出现紧握或两侧后肢轻微紧握；2分-两侧后肢大部分时间均紧握，但仍具灵活性；3分-两侧后肢完全紧握，无灵活性。

[0067] 4.同一批小鼠每天测试3次，连续测试三天，取平均值，结果见表3和图1。

[0068] 表3后肢紧握实验结果

[0069]

[0070] 4)转动棒实验

[0071] 1.将小鼠移至测试房间，习惯化1h。

[0072] 2.将小鼠放置于测试仪器(转杆)上，初始速度为4rpm，逐渐加速，每8s增加1rpm，在5min时转速增加至40rpm后不再加速。

[0073] 3.记录小鼠从杆上掉落的时间

[0074] 4.同一批小鼠每天测试3次，每次间隔20min，连续测试三天，取平均值，结果见表4。

[0075] 其中，与正常组相比，模型组行为学指标显著下调，出现明显的运动障碍；而醉茄素A+槲皮素联合用药组能够显著恢复MPTP所引起的小鼠运动功能障碍，且效果优于单一给药组(结果见图1)。

[0076] 表4转动棒实验结果

[0077]

[0078] 实施例2

[0079] 建立MPTP诱导的小鼠帕金森病模型(方法同实施例1)。将MPTP注射组(后文简称模型组)随机分成4组，即模型+对照溶剂组，模型+醉茄素A组，模型+槲皮素组，模型+醉茄素A+槲皮素组。其中，每组小鼠分别腹腔注射醉茄素A(20μg/kg)，槲皮素(3mg/kg),醉茄素A+槲皮素联合用药(醉茄素A10μg/kg，槲皮素1.5mg/kg)，以及等体积对照溶剂。

[0080] 检测每组药物和对照溶剂腹腔注射7天后，各组行为学指标的变化情况。平衡木实验的方法同实施例1，结果见表5。

[0081] 表5平衡木实验结果

[0082]

[0083] 爬杆实验方法同实施例1，结果见表6。

[0084] 表6爬杆实验结果

[0085]

[0086] 后肢紧握实验方法同实施例1，结果见表7。

[0087] 表7后肢紧握实验结果

[0088]

[0089] 转动棒实验方法同实施例1，结果见表8。

[0090] 表8转动棒实验结果

[0091]

[0092] 结果表明，醉茄素A+槲皮素联合用药(醉茄素A10μg/kg，槲皮素1.5mg/kg)能够显著恢复MPTP所引起的小鼠运动功能障碍，且效果优于单一给药组(结果见表5-6)。

[0093] 实施例3

[0094] 对黑质及纹状体多巴胺能神经元的保护作用：

[0095] 酪氨酸羟化酶(TH)为脑内多巴胺合成的限速酶，其水平高低，代表小鼠合成多巴胺的能力，因此，常将酪氨酸羟化酶作为小鼠多巴胺分泌能力的指标。

[0096] MPTP模型建立后，MPTP模型的建立和药物的用量同实施例1，检测每组药物和对照溶剂腹腔注射7天后，利用免疫组化技术各组小鼠黑质致密部酪氨酸羟化酶水平，结果见表9。

[0097] 结果为：与正常组相比，模型组小鼠黑质致密部TH阳性神经元数量显著下降，即出现明显的多巴胺能神经元凋亡情况。而醉茄素A+槲皮素联合用药组能够显著恢复MPTP所引起的多巴胺能神经元凋亡，且效果优于单一给药组(结果见图2)。

[0098] 表9酪氨酸羟化酶(TH)阳性神经元数量统计

[0099]

[0100] 此外，模型组小鼠纹状体中多巴胺能神经元投射显著降低，而醉茄素A+槲皮素联合用药能够显著恢复这一情况，且效果优于单一给药组(图3)。

[0101] 实施例4

[0102] 治疗神经炎症：

[0103] 目前认为，神经炎症的发生与发展是神经退行性疾病发病的相关因素之一，神经炎症在神经退行性疾病进程中促进介导神经元进行性死亡的作用已被广泛证实。神经炎症的发生主要包括小胶质细胞激活、星形胶质细胞激活等炎性反应。进一步这些中枢的炎性细胞通过多种机制相互作用，产生促炎细胞因子放大炎症信号，产生直接作用在神经元的神经毒素，最后导致神经退行性疾病的发生。

[0104] MPTP模型建立后，MPTP模型的建立和药物的使用同实施例1，检测每组药物和对照溶剂腹腔注射7天后，利用免疫组化技术各组小鼠黑质致密部GFAP和Iba1阳性细胞。其中，GFAP和Iba1分别为星形胶质细胞和小胶质细胞的标志物，其异常活化指示神经炎症水平的上升，结果见表10。

[0105] 结果表明，醉茄素A+槲皮素联合用药组能够显著降低神经炎症水平，且效果优于单一给药组(结果见图4)。

[0106] 表10各组小鼠黑质GFAP阳性和Iba1阳性细胞数量统计

[0107]

[0108] 实施例5

[0109] 神经保护作用—MTT实验：

[0110] SH-SY5Y细胞为人类神经瘤母细胞细胞系，常用于神经退行性疾病的体外实验。向SH-SY5Y细胞加入毒性物质50μM MPP+后，出现显著的神经损伤情况。此时，分别向细胞中加入醉茄素A(0.1μM)，槲皮素(200μM)，对照溶剂(DMSO)以及醉茄素A+槲皮素联合组(0.1μM+100μM)。

[0111] MTT即Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide，也称Thiazolyl blue tetrazoliumbromide，中文名为噻唑蓝。分子式为C18H16BrN5S，分子量为414.32。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臢(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臢，用酶标仪测定其光吸收值。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强，即可判断药物对神经细胞的保护作用。

[0112] 1)MTT粉末(500mg)配制成5mg/ml溶解于无菌PBS溶液中(500mgMTT粉末，溶解于100ml无菌PBS中，两个50ml离心管)，完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤后，装于EP管中，避光-
20℃长期保存。

[0113] 2)胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。

[0114] 3)将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100μl,这样待测细胞的密度为5000-10000/孔(边缘孔用无菌PBS填充)。

[0115] 4)将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的药物，细胞贴壁后即可加药，约6h左右，每孔100μl，设3-6个复孔。

[0116] 4-1)将药物按不同体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度。

[0117] 4-2)在EP管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉(可以用排枪吸走)再加入100μl含不同浓度药物的培养基。

[0118] 5)5％CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。

[0119] 6)每孔加入10μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

[0120] 7.)终止培养，准备溶解结晶。

[0121] 7-1)MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。将上清去掉，该过程要注意不能把结晶移走。

[0122] 7-2)每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

[0123] 根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强结果见表11。

[0124] 结果为：醉茄素A+槲皮素联合用药能够显著提升神经细胞的细胞存活率，发挥神经元保护作用(结果见图5)。

[0125] 表11各组细胞存活率(％)

[0126]

[0127] 实施例6

[0128] 抗凋亡：

[0129] 荧光染料PI(碘化丙啶)是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是Propidium Iodide。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。

[0130] 向SH-SY5Y细胞加入毒性物质50μM MPP+后，分别向细胞中加入醉茄素A(0.1μM)，槲皮素(200μM)，对照溶剂(DMSO)以及醉茄素A+槲皮素联合组(0.1μM+100μM)。

[0131] 5％CO2，37℃孵育培养24小时后，PBS洗1-2次，加入碘化丙啶溶液(1mg/ml)和7uM Hochest(标记细胞核)孵育15分钟。弃掉染色液，PBS洗1-2次，封片。荧光显微镜拍摄，计算碘化丙啶红色荧光与Hochest蓝色荧光标记细胞比值，即得细胞凋亡情况数据，结果见表12。

[0132] 表12各组细胞凋亡情况(％)

[0133]

[0134] 实验结果表明，醉茄素A+槲皮素联合用药组，能够显著对抗细胞凋亡，发挥神经元保护作用，结果见图6。

[0135] 实施例7

[0136] 抗氧化，神经保护：

[0137] 向SH-SY5Y细胞加入毒性物质100μM H2O2后，出现显著的神经损伤情况。此时，分别向细胞中加入醉茄素A(1μM)，槲皮素(20μM)，对照溶剂(DMSO)以及醉茄素A+槲皮素联合组(0.5μM+10μM)，结果见表13。

[0138] 结果为：醉茄素A+槲皮素联合用药能够显著提升神经细胞的细胞存活率，发挥神经元保护作用(结果见图7)。

[0139] 表13各组细胞存活率(％)

[0140]

[0141] 以上实施例表明醉茄素A联合槲皮素可以明显降低各自使用剂量，仍能达到优于单独使用的效果，是一项具有巨大临床前景的联合应用发现。

[0142] 其中，氧化应激和凋亡是包含阿尔茨海默病和帕金森病在内的神经退行性疾病的主要发病机制，而本发明提供的一种药物组合(醉茄素A和槲皮素联用)，能够有效地对抗氧化应激和凋亡，保护神经元活性，具备抗阿尔茨海默病和帕金森病的作用。

[0143] 实施例8

[0144] 对β-淀粉样蛋白诱导的SH-SY5Y细胞损伤的保护作用

[0145] 阿尔茨海默病患者脑组织中β淀粉样蛋白异常积聚，进而出发与阿尔茨海默病相关的病理生理、生化相关的级联反应。因此，对抗β-淀粉样蛋白的毒性作用，能够发挥针对阿尔茨海默病的预防和治疗作用。

[0146] SH-SY5Y按细胞密度1×105接种于多孔板中，待细胞贴壁后，向SH-SY5Y细胞加入15μMβ-淀粉样蛋白后，分别向细胞中加入醉茄素A(0.1μM)，槲皮素(200μM)，对照溶剂(DMSO)以及醉茄素A+槲皮素联合组(0.1μM+100μM)，培养24h后进行实验。

[0147] 1)MTT粉末(500mg)配制成5mg/ml溶解于无菌PBS溶液中(500mgMTT粉末，溶解于100ml无菌PBS中，两个50ml离心管)，完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤后，装于EP管中，避光-
20℃长期保存。

[0148] 2)胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。

[0149] 3)将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入100μl,这样待测细胞的密度为5000-10000/孔(边缘孔用无菌PBS填充)。

[0150] 4)将接种好的细胞培养板放入培养箱中培养，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)，加入浓度梯度的药物，细胞贴壁后即可加药，约6h左右，每孔100μl，设3-6个复孔。

[0151] 4-1)将药物按不同体积加入到96孔板中，以形成浓度梯度。

[0152] 4-2)在EP管中将不同浓度的药物配好，然后将96孔板中的培养上清去掉(可以用排枪吸走)再加入100μl含不同浓度药物的培养基。

[0153] 5)5％CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察药物的作用效果。

[0154] 6)每孔加入10μl MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。

[0155] 7.)终止培养，准备溶解结晶。

[0156] 7-1)MTT加入培养4h后，结晶可充分形成。将上清去掉，该过程要注意不能把结晶移走。

[0157] 7-2)每孔加入150μl二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。

[0158] 根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强结果见表14。

[0159] 表14各组细胞存活率(％)

[0160]

[0161] 由此表可以看出，加入β-淀粉样蛋白后，会显著杀伤细胞，细胞存活率下降至正常组的33％，而醉茄素A和槲皮素联合给药组，能够显著对抗β-淀粉样蛋白毒性，保护神经元，且效果优于单一给药组。

[0162] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。