一种用于减缓脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞介导的炎症反应的联合治疗方法

摘要

本发明涉及神经医学技术领域，具体涉及一种用于减缓脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞介导的炎症反应的联合治疗方法。本发明提供移植用生物可降解水凝胶材料和CSF1R抑制剂在制备用于减缓脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞介导炎症反应的产品中的应用。本发明发现在脊髓损伤区移植明胶水凝胶联合CSF1R抑制剂PLX3397给药，能够有效促进小胶质细胞和巨噬细胞的清除，调控小胶质细胞和巨噬细胞的再殖，同时有效改变小胶质细胞和巨噬细胞的激活状态，进而能够长期、高效、特异地降低脊髓损伤中小胶质细胞/巨噬细胞介导的脊髓的整体炎症反应，促进内源神经再生和功能恢复。

权利要求

1.移植用生物可降解水凝胶材料和CSF1R抑制剂在制备用于减缓脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞介导炎症反应的产品中的应用；所述产品在应用时为将所述生物可降解水凝胶材料移植至脊髓损伤部位，并进行CSF1R抑制剂给药；所述移植和所述给药分开独立进行；

所述移植用生物可降解水凝胶材料为明胶水凝胶材料；所述CSF1R抑制剂为PLX3397。

2.一种用于减缓脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞介导炎症反应的产品，其特征在于，所述产品包含移植用生物可降解水凝胶材料和CSF1R抑制剂；所述产品在应用时为将所述生物可降解水凝胶材料移植至脊髓损伤部位，并进行CSF1R抑制剂给药；所述移植和所述给药分开独立进行；

所述移植用生物可降解水凝胶材料为明胶水凝胶材料；所述CSF1R抑制剂为PLX3397。

3.根据权利要求2所述的用于减缓脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞介导炎症反应的产品，其特征在于，所述移植用生物可降解水凝胶材料形成的水凝胶的孔径为20-200μm。

4.根据权利要求2所述的用于减缓脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞介导炎症反应的产品，其特征在于，所述明胶水凝胶材料包含甲基丙烯酸酯化明胶、二丙酯酸丙烯酸酯化明胶中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的用于减缓脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞介导炎症反应的产品，其特征在于，所述明胶水凝胶材料包含甲基丙烯酸酯化明胶5～15份，光引发剂0.01～0.2份。

6.根据权利要求5所述的用于减缓脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞介导炎症反应的产品，其特征在于，所述明胶水凝胶材料包含甲基丙烯酸酯化明胶8～12份，光引发剂0.05～0.15份。

7.根据权利要求2～6任一项所述的用于减缓脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞介导炎症反应的产品，其特征在于，所述生物可降解水凝胶材料的移植包括：配制5～15％的甲基丙烯酸酯化明胶水溶液，调节pH为6.8～7.6，加入光引发剂得到移植用明胶水凝胶溶液，将所述移植用明胶水凝胶溶液滴加至脊髓损伤部分，在光照条件下进行交联反应，在脊髓损伤部位形成明胶水凝胶。

说明书

一种用于减缓脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞介导的炎症

反应的联合治疗方法

技术领域

[0001] 本发明涉及神经医学技术领域，具体涉及移植用生物可降解水凝胶材料和CSF1R抑制剂在制备用于减缓脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞介导炎症反应的产品中的应用以及用于减缓脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞介导炎症反应的产品。

背景技术

[0002] 脊髓损伤后可以产生长久、复杂、广泛的神经炎症，从而长期侵害受损的脊髓组织，给脊髓损伤的自我修复造成严重的阻碍。然而脊髓作为“免疫豁免区”很难消退损伤所带来的长期炎症。长期炎症的消退主要包括炎症细胞的清除，降低促炎因子的分泌以及抗炎因子的分泌增加等。脊髓损伤后外周系统入侵的多形核白细胞，T细胞，B细胞等可以在14天以后被清除，但是激活的小胶质细胞/巨噬细胞却一直存在。同时，这些长期激活的小胶质细胞/巨噬细胞不但在形态上发生巨大改变以增强其吞噬作用，而且还在损伤区近端和远端分泌大量的促炎因子造成脊髓整体的炎症反应，严重阻碍着脊髓损伤的修复。

[0003] 尽管现有技术中已有关于在组织损伤后利用生物材料或者抗炎药一定程度地减弱小胶质细胞/巨噬细胞造成的急性神经炎症的报道，但是这些方法仅仅局限于损伤区，对于损伤部位以外的组织整体炎症的缓解作用以及组织的长期慢性炎症的缓解作用很差，而且也很难将过度激活的小胶质细胞/巨噬细胞替换为正常功能的小胶质细胞，从根本上缓解炎症反应。因此，目前并未有理想的治疗策略来调控小胶质细胞/巨噬细胞造成的神经炎症用于治疗脊髓损伤修复。

发明内容

[0004] 为解决现有技术中的技术问题，本发明的目的在于提供生物可降解水凝胶材料的移植和CSF1R抑制剂的联合使用以有效减缓脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞介导的炎症反应，促进脊髓损伤修复。

[0005] 为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

[0006] 一方面，本发明提供移植用生物可降解水凝胶材料和CSF1R抑制剂在制备用于减缓脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞介导炎症反应的产品中的应用。

[0007] 在脊髓损伤后，小胶质细胞可以极化为巨噬细胞，联合外周来源的巨噬细胞共同调节损伤后的免疫微环境，本发明提供的包含所述移植用生物可降解水凝胶材料和CSF1R抑制剂的产品可对小胶质细胞和巨噬细胞这两种细胞介导的炎症均发挥优异的减缓作用。

[0008] 以上应用中，所述CSF1R抑制剂为选自PLX3397、PLX5622、GW2580中的一种或多种。

[0009] 作为优选，所述CSF1R抑制剂为PLX3397。

[0010] 作为优选，所述移植用生物可降解水凝胶材料为选自明胶水凝胶材料、胶原水凝胶材料、透明质酸水凝胶材料、壳聚糖水凝胶材料、丝素水凝胶材料、海藻酸钠水凝胶材料、聚D,L-丙交酯水凝胶材料中的一种或多种。

[0011] 本发明发现，将明胶水凝胶材料等移植用生物可降解材料与CSF1R抑制剂PLX3397联合使用，即将所述生物可降解材料移植至脊髓损伤部位配合PLX3397的给药，两者能够发挥协同作用，有效促进小胶质细胞和巨噬细胞的清除，调控小胶质细胞和巨噬细胞的再殖，同时有效改变小胶质细胞和巨噬细胞的激活状态，进而高效减缓脊髓损伤导致的脊髓整体的长期炎症反应。

[0012] 进一步优选地，所述移植用生物可降解水凝胶材料形成的水凝胶的孔径为20-200μm。

[0013] 作为本发明的优选方案，本发明提供明胶水凝胶材料和PLX3397在制备用于减缓脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞介导炎症反应的产品中的应用。

[0014] 本发明发现，明胶水凝胶材料能够与PLX3397更好地协同作用，两者联合作用在促进小胶质细胞和巨噬细胞的清除、调控小胶质细胞和巨噬细胞的再殖和改变小胶质细胞和巨噬细胞的激活状态方面具有更好的作用。

[0015] 本发明中，所述产品可为药物。

[0016] 另一方面，本发明提供一种用于减缓脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞介导炎症反应的产品，所述产品包含移植用生物可降解水凝胶材料和CSF1R抑制剂。

[0017] 具体地，所述CSF1R抑制剂为选自PLX3397、PLX5622、GW2580中的一种或多种。

[0018] 作为优选，所述CSF1R抑制剂为PLX3397。

[0019] 作为优选，所述移植用生物可降解水凝胶材料为选自明胶水凝胶材料、胶原水凝胶材料、透明质酸水凝胶材料、壳聚糖水凝胶材料、丝素水凝胶材料、海藻酸钠水凝胶材料、聚D,L-丙交酯水凝胶材料中的一种或多种。

[0020] 本发明发现，将明胶水凝胶材料等移植用生物可降解材料与CSF1R抑制剂PLX3397联合使用，即将所述生物可降解材料移植至脊髓损伤部位配合PLX3397的给药，两者能够发挥协同作用，有效促进小胶质细胞和巨噬细胞的清除，调控小胶质细胞和巨噬细胞的再殖，同时有效改变小胶质细胞和巨噬细胞的激活状态，进而高效减缓脊髓损伤导致的脊髓整体的长期炎症反应。

[0021] 进一步优选地，所述移植用生物可降解水凝胶材料形成的水凝胶的孔径为20-200μm。本发明发现孔径为20-200μm的移植用生物可降解水凝胶材料能够更好地与PLX3397协同配合，更有效地对小胶质细胞和巨噬细胞的清除和再殖发挥作用，同时能够为脊髓神经元分化和生长提供有利的支架作用。

[0022] 作为本发明的所述移植用生物可降解水凝胶材料为明胶水凝胶材料。

[0023] 本发明发现，明胶水凝胶材料能够与PLX3397更好地协同作用，两者联合作用在促进小胶质细胞和巨噬细胞的清除、调控小胶质细胞和巨噬细胞的再殖和改变小胶质细胞和巨噬细胞的激活状态方面具有更好的作用。

[0024] 上述明胶水凝胶材料可为不经修饰的明胶水凝胶材料也可为经化学修饰的明胶水凝胶。

[0025] 作为优选，所述明胶水凝胶材料包含甲基丙烯酸酯化明胶、二丙酯酸丙烯酸酯化明胶中的一种或多种。

[0026] 进一步优选地，所述明胶水凝胶材料包含甲基丙烯酸酯化明胶5～15份，光引发剂0.01～0.2份；

[0027] 作为本发明的优选方案，所述明胶水凝胶材料包含甲基丙烯酸酯化明胶8～12份，光引发剂0.05～0.15份。

[0028] 本发明中，所述用于减缓脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞介导炎症反应的产品在应用时为将所述移植用生物可降解水凝胶材料移植至脊髓损伤部位，并进行CSF1R抑制剂给药。

[0029] 作为本发明的一种优选实施方式，所述生物可降解水凝胶材料的移植包括如下步骤：配制5～15％的甲基丙烯酸酯化明胶水溶液，调节pH为6.8～7.6，加入光引发剂得到移植用明胶水凝胶溶液，将所述移植用明胶水凝胶溶液滴加至脊髓损伤部分，在光照条件下进行交联反应，在脊髓损伤部位形成明胶水凝胶。

[0030] 所述交联反应时间优选为60-300s。

[0031] 作为本发明的一种优选实施方式，所述CSF1R抑制剂的给药为在生物可降解水凝胶材料的移植后持续给药。

[0032] 上述CSF1R抑制剂的给药途径包括但不限于口服、注射等。

[0033] 另一方面，本发明还提供一种用于减缓脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞介导的炎症反应的联合治疗方法，其为将本发明所述的移植用生物可降解水凝胶材料移植至脊髓损伤部位，同时联合所述CSF1R抑制剂的给药治疗方法。

[0034] 本发明的有益效果在于：本发明首次发现采用在脊髓损伤区移植明胶水凝胶以及CSF1R抑制剂PLX3397给药的联合治疗方法，两者能够发挥协同作用，有效促进小胶质细胞和巨噬细胞的清除，调控小胶质细胞和巨噬细胞的再殖，同时有效改变小胶质细胞和巨噬细胞的激活状态，进而能够高效、特异地降低脊髓损伤中小胶质细胞/巨噬细胞介导的脊髓的整体炎症反应，促进脊髓损伤的修复。本发明通过长时间点(8周)的观察实验证明，利用本发明提供的联合治疗方法能够安全、有效地在脊髓损伤小鼠体内成功构建了一个低炎症脊髓损伤微环境，促进了内源神经再生和功能恢复，具备潜在的临床应用前景，对于脊髓损伤再生修复从基础研究向临床转化应用具有指导意义。

附图说明

[0035] 图1为本发明实施例1中制备的明胶水凝胶的特性分析结果，其中，A和B为利用扫描电子显微镜检测水凝胶的孔径(Diameter)；C和D为水凝胶的压缩模量(Compressive modulus)检测。

[0036] 图2为本发明实施例2中PLX3397处理后健康小鼠脊髓中小胶质细胞的清除与再殖的荧光染色检测结果，其中，A为PLX3397处理后不同时间脊髓中的小胶质细胞的水平检测，MD-0、MD-7和MD-14分别代表PLX3397处理后的第0、7和14天的小胶质细胞清除，lba1代表小胶质细胞lba1，lba1DPAI代表小胶质细胞DPAI染色；C为对A中小胶质细胞的数量统计(Number of lba1+cells per section)；B为停止给药不同时间小胶质细胞水平的检测，MP-0、MP-7和MP-14分别代表停止给药后的第0、7和14天的小胶质细胞再生，lba1代表小胶质细胞lba1，lba1DPAI代表小胶质细胞DPAI染色；D为对B中小胶质细胞的数量统计(Number +of lba1cells per section)。

[0037] 图3为本发明实施例2中PLX3397处理对脊髓中其它神经细胞和胶质细胞的数量以及血-脊髓屏障的完整性的影响分析，其中，A为星形胶质细胞(GFAP)的荧光染色结果；B为少突胶质细胞(Olig2)的荧光染色结果；C为神经元(NeuN)的荧光染色结果；E为星形胶质细胞光密度统计(GFAP intensity)；F为神经元的数量统计统计(NeuN cells/mm2)；G为少突胶质细胞数量(Olig2cells/mm2)；D为血-脊髓屏障的完整性分析(检测各器官的伊文思蓝染料的积累)，SC为脊髓，Liver为肝脏，Spleen为脾脏，Lung为肺脏，Kidney为肾脏；WT代表正常组野生型小鼠，MD代表小胶质细胞清除，MP代表小胶质细胞再生；NS代表差异不显著。

[0038] 图4为本发明实施例3中脊髓损伤后联合治疗方法对于小胶质细胞/巨噬细胞的清除和再殖的作用，其中，A为损伤模型和实验分组示意图；B为图片采集点示意图；C为脊髓损伤第14天实验组与对照组Iba阳性细胞的荧光染色结果；D为脊髓损伤第14天和60天实验组与对照组Iba阳性细胞的数量统计；E为脊髓损伤第60天实验组与对照组Iba阳性细胞的荧光染色结果；F为小胶质细胞/巨噬细胞应激受损脊髓的形态变化；G、H、I、J分别为未经治疗(Control)、经过移植明胶水凝胶单独治疗(Gelatin)、PLX3397单独治疗(MDR)和联合治疗(MDR+Gelatin)后脊髓损伤60天后处于激活态形状的小胶质细胞/巨噬细胞的百分比；Control、Gelatin、MDR、MDR+Gelatin分别为未经治疗的空白对照组、经过移植明胶水凝胶单独治疗组、PLX3397单独治疗组、联合治疗组；Ramified、Hypertrophic、Bushy分别代表分支状小胶质细胞、肥大状小胶质细胞、灌木丛样小胶质细胞。

[0039] 图5为本发明实施例3中明胶水凝胶移植和PLX3397联合治疗对脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞介导的炎症反应的作用，其中，A、B、C、D分别为未经治疗的空白对照组(Control)、经过移植明胶水凝胶单独治疗(Gelatin)、PLX3397单独治疗(MDR)和联合治疗(MDR+Gelatin)的特异性标志蛋白CD68的免疫荧光染色结果；E为对A、B、C、D结果的统计；F、G、H、I、J、K分别为IL-6、TNF-α、CCL2、IFN-γ、iNOS和IL-1β促炎因子的mRNA表达水平检测，WT为正常组野生型小鼠，MD为小胶质细胞清除，Control、Gelatin、MDR、MDR+Gelatin分别为未经治疗的空白对照组、经过移植明胶水凝胶单独治疗组、PLX3397单独治疗组、联合治疗组。

[0040] 图6为本发明实施例4中联合治疗脊髓损伤后内源神经干细胞迁移至损伤区并分化为神经元的检测结果，其中，A为未经治疗(Control)、经过移植明胶水凝胶单独治疗(Gelatin)、PLX3397单独治疗(MDR)和联合治疗(MDR+Gelatin)的神经元标志物Tuj1的免疫荧光染色检测结果；B为对A中各组的Tuj1+细胞的数量结果的统计；C和D分别为谱系示踪小鼠追踪nestin表达的子代细胞的原理图；E为Nestin子代细胞和神经元标志物Tuj1的免疫荧光染色检测结果；F为脊髓损伤区Nestin子代细胞(tdTomato阳性)的数量统计；G为脊髓损伤区tdTomato和Tuj1双阳性细胞的数量统计。

[0041] 图7为本发明实施例5中联合治疗后脊髓损伤小鼠的Basso Mouse Scale(BMS)评分和运动诱发电位电生理检测结果，其中，A为Basso Mouse Scale(BMS)评分；B和C为运动诱发电位电生理检测；Control、Gelatin、MDR、MDR+Gelatin分别为未经治疗的空白对照组、经移植明胶水凝胶单独治疗组、PLX3397单独治疗组、联合治疗组；Normal为正常组，After surgery代表脊髓损伤处理后。

具体实施方式

[0042] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

[0043] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0044] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0045] 实施例1 明胶水凝胶移植材料的制备和性能分析

[0046] 本实施例提供用于脊髓损伤部位移植的明胶水凝胶的制备方法，具体如下：

[0047] (1)利用甲基丙烯酸酐接枝明胶在水溶液中制备获得甲基丙烯酸酯化明胶(Methacrylated Gelalin,mGL)；在无菌条件下将mGL配制成8％的溶液，并用HCl或NaOH滴定至pH7.0。

[0048] (2)将光引发剂加入到步骤(1)得到的mGL溶液中使其终浓度为0.08％(w/v)，得到含光引发剂的明胶水溶液。

[0049] (3)将得到的混合物溶液用可见光源或者紫外光源照射180秒以完全固化获得明胶水凝胶。

[0050] 将上述制备得到的明胶水凝胶冷冻干燥后，进行扫描电子显微镜检测，结果如图1所示，上述获得的明胶水凝胶的孔径尺寸为20-200μm；其压缩模量为0.01-0.5mPa。

[0051] 实施例2 PLX3397处理对未损伤脊髓中小胶质细胞的清除以及安全性评价[0052] 1、PLX3397处理后脊髓中小胶质细胞的清除与再殖情况

[0053] 选取10只健康小鼠，随机分为两组(PLX3397处理组和对照组)，PLX3397处理组饲喂含有290mg/kg PLX3397的饲料(自由采食)，对照组饲喂不含PLX3397的饲料。在第14天采用免疫荧光检测小胶质细胞的数量，结果如图2所示，脊髓中的小胶质细胞中约95％可以被清除(图2的A和C)。而且PLX3397处理组停止给药14天之后小胶质细胞的数量可以恢复到初始水平(图2的B和D)。结果表明，通过CSF1R的抑制剂PLX3397处理，脊髓中的小胶质细胞可以被有效清除，而停止PLX3397处理后小胶质细胞可以再殖至初始水平。

[0054] 2、PLX3397的安全性评价

[0055] 为评价PLX3397处理对机体的安全性，分别检测上述1中经PLX3397处理的小鼠的脊髓神经细胞和神经胶质细胞数目、血-脊髓屏障完整性的影响，并分析其是否会影响脊髓其他类型细胞数量。

[0056] 免疫荧光染色检测结果显示，经PLX3397处理后，神经元(NeuN)、星形胶质细胞(GFAP)和少突胶质细胞(Olig2)的数目并未发生较大变化(图3的A、B、C、E、F和G)。

[0057] 进一步通过Evans blue方法，检测血-脊髓屏障的完整性，发现PLX3397处理并不会破坏血-脊髓屏障的完整性(图3的D)。

[0058] 为了检测PLX3397处理以后是否会造成脊髓的炎症反应，对主要促炎因子水平进行检测，包括IL-6、TNF-α、CCL2、IFN-γ、iNOS和IL-1β。结果显示，这六种促炎因子的水平并未发生变化(图5的F、G、H、I、J、K)。

[0059] 以上结果表明，PLX3397处理既不会对小鼠脊髓中主要的神经类型细胞产生影响，也不会破坏血-脊髓屏障的完整性以及造成脊髓炎症反应，因此PLX3397是调控脊髓中小胶质细胞的一种安全、有效的方法，具有一定的临床应用前景。

[0060] 实施例3 联合治疗可以有效降低全横断脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞介导的炎症反应

[0061] 以上实施例2的结果表明PLX3397在健康小鼠中可以安全、有效的调控脊髓中的小胶质细胞，本实施例通过在脊髓损伤的小鼠中移植明胶水凝胶并联合PLX3397处理，共同调节损伤后激活小胶质细胞/巨噬细胞介导的炎症反应。

[0062] 1、联合治疗方法可以特异性调控脊髓损伤后小胶质细胞的清除和再殖

[0063] 每组各选取5只小鼠，利用戊巴比妥钠麻醉后，在脊髓的T7-T8段完全性移出1mm组织进行全横断缺损性脊髓损伤，清除创伤口的血液后立即在损伤区加入实施例1的步骤(2)制备得到的含光引发剂的明胶水溶液，并在光照的条件下交联180s形成明胶水凝胶。待小鼠苏醒恢复后实验组和对照组分别自由采食含有PLX3397(290mg/kg)或不含有PLX3397的饲料。分别在脊髓损伤的第14天和60天对小鼠进行安乐死并取材，进行后续实验。

[0064] 分别设置移植明胶水凝胶的单独治疗对照组(Gelatin)、PLX3397单独治疗对照组(MDR)、空白对照组(Control)以及联合治疗实验组(MDR+Gelatin)。

[0065] 以上实验的流程示意图如图4的A和B所示。

[0066] 经免疫荧光染色检测，结果显示，相比于各对照组，脊髓损伤后进行联合治疗(MDR+Gelatin)，小胶质细胞/巨噬细胞可以被大量清除，而停止PLX3397处理后，小胶质细胞/巨噬细胞的数量可以恢复到初始水平(图4的C、D、E)。

[0067] 经免疫荧光染色检测发现，当小胶质细胞/巨噬细胞应激受损脊髓时，形态发生巨大的变化，其分支逐渐缩回，突起消失，胞体变大(图4的F)。因此，进一步对脊髓损伤60天时，联合治疗(MDR+Gelatin)后小胶质细胞/巨噬细胞的形态进行分析和统计。结果显示，经过联合治疗，脊髓损伤60天后处于激活态形状的小胶质细胞/巨噬细胞明显减少(图4的G、H、I、J)。

[0068] 为了进一步确定激活的小胶质细胞/巨噬细胞的数量，对其表达的特异性标志蛋白CD68进行免疫荧光染色。结果显示，相比于各对照组，MDR+Gelatin组中CD68阳性的小胶质细胞/巨噬细胞大量减少(P<0.001)(图5的A、B、C、D和E)。结果表明，经过联合治疗后，激活的小胶质细胞/巨噬细胞数量明显下降，有效降低了其介导的炎症反应。

[0069] 小胶质细胞/巨噬细胞激活后除了形态改变和表达特异性的蛋白外，还会分泌大量的促炎因子。因此，在脊髓损伤第60天分别检测IL-6、TNF-α、CCL2、IFN-γ、iNOS和IL-1β促炎因子的mRNA表达水平。结果显示，在MDP+Gelatin组这六种炎症因子都出现明显下降(P<0.001)(图5的F、G、H、I、J、K)，进一步证明联合治疗可以有效的缓解小胶质细胞/巨噬细胞介导的炎症反应。

[0070] 实施例4 脊髓损伤后联合治疗促进神经干细胞迁移至损伤区并分化成为神经元[0071] 全横断缺损性脊髓损伤治疗面临的最大挑战就是大量的神经元死亡，然而脊髓内源干细胞在炎性损伤的微环境下却很难分化成为神经元。为了检验脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞介导的炎症反应是否会影响神经再生，对神经元标志物Tuj1进行免疫荧光染色检测。结果显示，相比于对照组(Control)，单独治疗组(Gelatin和MDR)，联合治疗组(Gelatin+MDR)在脊髓损伤区域出现大量新生的Tuj1阳性细胞(图6的A和B)。结果表明，本发明的联合治疗方法不但可以缓解脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞介导的炎症反应，同时还可以促进损伤区的神经再生。

[0072] 为了进一步探究这些新生神经元是否分化于体内的内源神经干细胞，利用谱系示踪小鼠(Nestin-CreERT2，LSL-tdTomato；谱系示踪小鼠购买于美国的Jackson laboratory公司)进行实验，谱系示踪小鼠可以特异性的标记并追踪神经干细胞标志物nestin表达的细胞及其子代细胞。通过他莫昔芬的注射处理，该谱系示踪小鼠可以永久的追踪nestin表达的子代细胞，这样可以十分准确的鉴定其命运(图6的C和D)。

[0073] 对谱系示踪的脊髓损伤小鼠进行联合治疗及Tuj1的免疫荧光检测，结果显示，通过联合方法处理后大量nestin阳性干细胞可以分化为Tuj1阳性的神经元(图6的E、F、G)。该结果精确证明了联合处理方法可以促进脊髓内源神经干细胞在损伤后分化为神经元，为脊髓损伤治疗提供了一定的理论基础。

[0074] 实施例5 联合治疗方法促进脊髓全横断损伤小鼠的运动功能恢复

[0075] 对未经治疗(Control组)、经过明胶水凝胶移植单独治疗(Gelatin组)、PLX3397单独治疗(MDR组)以及明胶水凝胶移植、PLX3397联合治疗(MDR+Gelatin)的脊髓损伤小鼠分别通过Basso Mouse Scale(BMS)评分和运动诱发电位电生理检测来评价其运动功能的恢复情况。

[0076] Basso Mouse Scale(BMS)评分结果如图7的A所示，相比于Control组(1.2±0.7)，Gelatin组(2.3±0.8)和MDR组(2.5±1.0)，联合治疗组(MDR+Gelatin)(2.9±0.7)的BMS评分在脊髓损伤后的第8周有显著提高(P<0.01)。

[0077] 为了进一步评价脊髓损伤小鼠的运动功能恢复，检测损伤小鼠的运动诱发电位振幅。结果显示，脊髓损伤小鼠通过联合治疗(MDR+Gelatin组)后其振幅出现明显的升高，显著高于未经治疗(Control组)、经过明胶水凝胶移植单独治疗(Gelatin组)以及PLX3397单独治疗(MDR组)(P<0.001)(图7的B和C)。

[0078] 综上所述，本发明首次采用水凝胶移植联合CSF1R抑制剂PLX3397给药的方法特异性缓解了脊髓损伤后小胶质细胞/巨噬细胞介导的炎症反应，通过减缓该炎症有效促进了脊髓神经干细胞向损伤区迁移并分化成为神经元。利用该联合治疗方法能够在脊髓损伤动物体内构建了一个低炎症、有利的微环境，从而促进脊髓神经干细胞迁移至损伤区并分化成为神经元，具有潜在的临床应用价值。

[0079] 虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。