混合培养裂殖壶藻和雨生红球藻产DHA和虾青素的方法

摘要

本发明公开了一种混合培养裂殖壶藻和雨生红球藻产DHA和虾青素的方法，在雨生红球藻生长期后的发酵液中接种裂殖壶藻进行混菌发酵培养，在发酵过程补充碳源和谷氨酸钠，培养完成后提取油脂。本发明具有简化培养过程，降低生产成本，提高油脂提取时的稳定性等特点。

权利要求

1.一种混合培养裂殖壶藻和雨生红球藻产DHA和虾青素的方法，其特征在于，在雨生红球藻生长96‑144h内的发酵液中接种裂殖壶藻进行混菌发酵培养；裂殖壶藻的接种量为雨生红球藻发酵液体积的20% 30%；

~

所述雨生红球藻生长阶段培养条件为：温度18 28℃，光照强度1000 2000 lx，光照时~ ~

间12 24h/天；雨生红球藻生长阶段培养液的pH控制在6.5 9.0；

~ ~

混菌发酵培养时发酵温度为28 30℃，通气量1 2 vvm，培养80 120 h；混菌发酵培养时~ ~ ~

采用蓝光光照，光照强度11000 lx 15000 lx，光暗比10h/14h 14h/10h；

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裂殖壶藻保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号CCTCC NO: M2012494；雨生红球藻保藏于中国科学院淡水藻种库，编号为FACHB‑1927。

2.如权利要求1所述的混合培养裂殖壶藻和雨生红球藻产DHA和虾青素的方法，其特征在于，裂殖壶藻种子扩大培养36 48h后接种至雨生红球藻中。

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3.如权利要求1所述的混合培养裂殖壶藻和雨生红球藻产DHA和虾青素的方法，其特征在于，在混菌发酵过程中控制发酵液中碳源浓度在10 20 g/L，在发酵液中补入谷氨酸钠20~

40 g/L。

~

4.如权利要求1所述的混合培养裂殖壶藻和雨生红球藻产DHA和虾青素的方法，其特征在于，裂殖壶藻种子扩大培养具体为：将活化培养的裂殖壶藻种子培养液接种到扩大培养基中振摇培养获得种子扩大培养液，培养温度26 30℃，通气量0.6 1.4vvm。

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说明书

混合培养裂殖壶藻和雨生红球藻产DHA和虾青素的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域。更具体地说，本发明涉及一种混合培养裂殖壶藻和雨生红球藻产DHA和虾青素的方法。

背景技术

[0002] 虾青素是类胡萝卜素科的秦椒黄族中的一种。秦椒黄有助于防止维生素A、维生素E及其他的类胡萝卜素发生氧化，是所有类胡萝卜素中抗氧化效果最强的，比β～胡萝卜素
强10倍，比维生素E强100倍。经营养学家证实，虾青素可以跨越从血液到大脑的屏障，所以
虾青素对大脑、中枢神经系统及双眼都可起到保护作用。

[0003] 雨生红球藻培养法是目前天然虾青素的最主要生产制备方法。采用雨生红球藻Haematococcuspluvialis等微藻制备得到的虾青素均为3S,3’S构型，抗氧化活性高，无毒
副作用，被FDA(美国食品和药物管理局)和EFSA(欧洲食品安全局)批准作为营养强化剂。但
由于雨生红球藻生长速率慢，自养培养周期长，易生物污染等因素的制约，目前虾青素的生
产成本较高且生产效率低下。雨生红球藻又被叫做湖生红球藻或湖生血球藻，是一种普遍
存在的绿藻，属于团藻目，红球藻科，是公认的自然界中生产天然虾青素的最好生物。

[0004] 目前，在培养过程中，雨生红球藻基本采用的是一步培养法和二步培养法。

[0005] 一步法即雨生红球藻的营养细胞的生长、孢子转化和虾青素累积是在同一个光生物反应器、同一培养基中完成，通过调控培养液的pH值促进孢子转化和虾青素累积。但一步
法的培养周期长，虾青素产率低，

[0006] 二步法是红球藻的营养生长和虾青素累积人为地分为两个阶段，这两个阶段分别在不同的光生物反应器中，不同的培养条件(包括培养基)下进行的，维持营养生长的条件
和诱导虾青素累积的条件有很大的不同。二步法的优点是解决了红球藻细胞生长繁殖与孢
子形成、积累虾青素所需条件不同的矛盾，其不足之处在于(1)工艺复杂；(2)诱导虾青素累
积的措施需要更换培养基啊，导致采收后的培养液不能重复使用，致使生产过程中大量排
出废水，对水环境有污染作用。

发明内容

[0007] 本发明的目的是提供一种混合培养裂殖壶藻和雨生红球藻产DHA(二十二碳六烯酸)和虾青素的方法，该方法能够简化培养过程，刺激雨生红球藻对于虾青素的积累，提高
雨生红球藻中虾青素的含量，并且能够得到的富含虾青素‑DHA的油脂产品，且产品具备良
好的稳定性。

[0008] 为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种混合培养裂殖壶藻和雨生红球藻产DHA和虾青素的方法，在雨生红球藻生长稳定期的发酵液中接种裂殖壶藻进行
混菌发酵培养。

[0009] 优选的，在雨生红球藻生长96‑144h内进行接种裂殖壶藻。

[0010] 优选的是，所述雨生红球藻藻种培养：将处于对数生长期的雨生红球藻接种到BBM培养液中进行培养并扩培。

[0011] 优选的是，所述雨生红球藻生长阶段培养条件为：温度18～28℃，光照强度1000～2000lx，光照时间12～24h/天。

[0012] 优选的是，发酵过程中控制雨生红球藻生长阶段培养液的pH控制在6.5～9.0，控制方法可以是加入4‑羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液，添加浓度为10‑50mmol/L；还可以采用加酸
的办法来降低菌液的酸碱度，所用酸可以是醋酸、乳酸和盐酸；还可以采用通入二氧化碳的
方式控制pH。

[0013] 优选的是，裂殖壶藻种子扩大培养36～48h后接种至雨生红球藻中。如前所述，雨生红球藻此时处于生长稳定期。

[0014] 优选的是，裂殖壶藻的接种量为雨生红球藻发酵液体积的20％～30％。接种的发酵液体积可以是20,22,25,27,30％等体积量。

[0015] 优选的是，在混菌发酵过程中控制发酵液中碳源浓度在10～20g/L，在发酵液中补入谷氨酸钠20～40g/L，优选为在发酵液中补入谷氨酸钠20～30g/L。

[0016] 优选的是，混菌发酵培养时发酵温度为28～30℃，通气量1～2vvm，培养80～120h。

[0017] 优选的是，混菌发酵培养时采用蓝光光照，光照强度11000lx～15000lx，光暗比10h/14h～14h/10h。

[0018] 优选的是，所述裂殖壶藻种子活化培养具体为：将裂殖壶藻接种于活化培养基中振摇培养获得种子活化培养液，培养温度25～28℃，培养时间40～48h；优选为摇床振摇转
速为150～250r/min。

[0019] 裂殖壶藻种子扩大培养具体为：将活化培养的裂殖壶藻种子培养液接种到扩大培养基中振摇培养获得种子扩大培养液，培养温度26～30℃，通气量0.6～1.4vvm，培养时间
为36～48h；优选为搅拌速度120～180r/min。

[0020] 优选的是，混菌发酵培养后提取油脂工艺为：分离菌体后于湿菌体中加入有机溶剂如正己烷，破碎后得到混合液，再将混合液通过分离得到一萃混合油及一萃菌粕；将一萃
菌粕加入有机溶剂溶剂再次破碎，然后通过分离得到二萃混合油；合并一萃、二萃混合油脱
溶得到含有DHA和虾青素的微生物油脂。

[0021] 优选的是，采用保藏于中国典型培养物保藏中心的保藏号CCTCC NO:M2012494的裂殖壶藻。

[0022] 本发明至少包括以下有益效果：混合培养裂殖壶藻与雨生红球藻，在培养雨生红球藻生长到达稳定期后，在其发酵液中接种裂殖壶藻，并在发酵液中补充一定量的裂殖壶
藻必需营养素，裂殖壶藻开始大量生长，使发酵液中营养大量流失，发酵环境快速达到氮饥
饿条件，胁迫雨生红球藻进入产物合成期；继续补充碳源，同时，雨生红球藻所产生的氧气
能够被裂殖壶藻一定程度上所利用，有利其生长及积累油脂，并继续刺激雨生红球藻生产
虾青素。最终达到发酵液中同时大量存在裂殖壶藻与雨生红球藻，发酵结束后经过提取，能
够得到含有高浓度虾青素的DHA油脂。本方法利用裂殖壶藻改变发酵环境，迫使雨生红球藻
进入产物合成期，并刺激雨生红球藻的产物累积，同时雨生红球藻所产生的氧气一定程度
上被裂殖壶藻生长代谢所利用，利用两种藻互利的性质简化了培养工艺，降低了培养成本。

[0023] 虾青素本身非常容易氧化，本发明的产物中，油脂与虾青素一同产出，虾青素可溶于油脂中，油脂包裹虾青素防止其氧化，而虾青素作为强抗氧化剂又能反过来影响所得油
脂产品的稳定性。

[0024] 本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

具体实施方式

[0025] 下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常
规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

[0026] 实施例1

[0027] (1)雨生红球藻的培养

[0028] 雨生红球藻购自中国科学院淡水藻种库，编号为FACHB‑1927。

[0029] 雨生红球藻接种到BBM培养液中进行藻种的培养和扩培，雨生红球藻生长阶段培养条件为温度23℃，光照强度1200lx，光照时间14h/天，培养液pH 8.0，培养过程中通过二
氧化碳来控制培养液pH不超过9。

[0030] BBM培养液配方为：NaNO3 0.25g/L、MgSO4·7H2O 0.14g/L、KH2PO4 0.02g/L、CaCl2 0.02g/L、EDTA 0.0004g/L、FeSO4·7H2O 0.002g/L、ZnSO4·7H2O 0.002g/L、MnCl2·4H2O 
0.00004g/L、CoNO3·6H2O 0.00006g/L、KOH 0.08g/L、H3BO3 0.0001g/L、CuSO4·5H2O 
0.00003g/L、MoO3 0.00001g/L、维生素B12 0.00003g/L、NaHCO3 0.06g/L、氨苄青霉素
0.012g/L。

[0031] (2)裂殖壶藻的培养，采用保藏于中国典型培养物保藏中心的保藏号CCTCC NO:M2012494的裂殖壶藻。

[0032] 裂殖壶藻种子活化培养：将裂殖壶藻接种到活化培养基中振摇培养，培养温度25℃，摇床振摇转速为150r/min，培养时间48h，得到种子培养液，所述活化培养基为：葡萄糖
12g/L，谷氨酸钠22g/L，酵母浸膏5g/L，氯化钠15g/L，硫酸镁0.5g/L，pH自然。

[0033] 裂殖壶藻种子扩大培养：将经过活化培养的种子培养液接种到扩大培养基中振摇培养，比例为1:10，得到种子扩大培养液。摇瓶中的扩大培养基为：葡萄糖32g/L，谷氨酸钠
23g/L，酵母浸膏5g/L，氯化钠16g/L，硫酸镁7g/L，磷酸二氢钾6g/L，氯化钙0.6g/L，pH自然。
培养温度28℃，搅拌速度150转/分钟，通气量1vvm(L/L.min)，培养时间44h。

[0034] (3)混菌发酵工艺

[0035] 雨生红球藻培养96h后，进入生长稳定期，在发酵液中接种裂殖壶藻，接种比例25％(体积比)，温度28℃，搅拌速度200转/分钟，通气量1L/(L.min)，即每升发酵液中每分
钟所需要的空气通入量为1L，压力控制在0.1Mpa，培养96h，并在发酵过程中通过流加葡萄
糖来控制发酵液中碳源浓度在12g/L，并一次补入谷氨酸钠30g/L。光照强度：12000lx，蓝
光，光暗比12h/12h。

[0036] (4)油脂提取工艺

[0037] 板框分离菌体后，于菌体中，加入正己烷，胶体磨和剪切机中分别循环破碎2次(共4次)至乳液颗粒体积平均粒径为500μm，再将混合液通过离心机得到一萃混合油及一萃菌
粕，将一萃菌粕加入正己烷，于胶体磨和剪切机中分别反复循环破碎和分离油脂，直到提取
溶剂呈无色，得到混合油；合并混合油油脱溶得到富含虾青素以及二十二碳六烯酸的微生
物油脂。

[0038] 实施例2

[0039] (1)雨生红球藻的培养

[0040] 雨生红球藻购自中国科学院淡水藻种库，编号为FACHB‑1927。

[0041] 雨生红球藻接种到BBM培养液中进行藻种的培养和扩培，雨生红球藻生长阶段培养条件为：温度23℃，光照强度1500lx，光照时间12h/天，培养液pH7，培养过程中通过盐酸
来控制培养液pH不超过9。

[0042] BBM培养液配方为：NaNO3 0.25g/L、MgSO4·7H2O 0.14g/L、KH2PO4 0.02g/L、CaCl2 0.02g/L、EDTA 0.0004g/L、FeSO4·7H2O 0.002g/L、ZnSO4·7H2O 0.002g/L、MnCl2·4H2O 
0.00004g/L、CoNO3·6H2O 0.00006g/L、KOH 0.08g/L、H3BO3 0.0001g/L、CuSO4·5H2O 
0.00003g/L、MoO3 0.00001g/L、维生素B12 0.00003g/L、NaHCO3 0.06g/L、氨苄青霉素
0.012g/L。

[0043] (2)裂殖壶藻的培养

[0044] 采用保藏于中国典型培养物保藏中心的保藏号CCTCC NO:M2012494的裂殖壶藻。

[0045] 裂殖壶藻种子活化培养：将裂殖壶藻接种到活化培养基中振摇培养，培养温度28℃，摇床振摇转速为250r/min，培养时间40h，得到种子培养液，所述活化培养基为：葡萄糖
12g/L，谷氨酸钠22g/L，酵母浸膏5g/L，氯化钠15g/L，硫酸镁0.5g/L，pH自然。

[0046] 裂殖壶藻种子扩大培养：将经过活化培养的种子培养液接种到扩大培养基中振摇培养，得到种子扩大培养液。摇瓶中的扩大培养基为：葡萄糖40g/L，谷氨酸钠33g/L，酵母浸
膏5g/L，氯化钠10g/L，硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾8g/L，氯化钙0.5g/L，pH自然，培养36h。

[0047] (3)混菌发酵工艺

[0048] 雨生红球藻培养120h后，进入生长稳定期，在发酵液中接种裂殖壶藻，接种比例30％(体积比)，发酵温度30℃，搅拌速度100转/分钟，通气量1.5L/(L*min)，即每升发酵液
中每分钟所需要的空气通入量为1L，压力控制在0.8Mpa，培养120h，并在发酵过程中通过流
加葡萄糖来控制发酵液中碳源浓度在20g/L，并一次补入谷氨酸钠30g/L。光照强度：
15000lx，蓝光，光暗比12h/12h。

[0049] (4)油脂提取工艺

[0050] 板框分离菌体后，于菌体中，加入正己烷，胶体磨和剪切机中分别循环破碎2次(共4次)至乳液颗粒体积平均粒径为500μm，再将混合液通过离心机得到一萃混合油及一萃菌
粕，将一萃菌粕加入正己烷，于胶体磨和剪切机中分别反复循环破碎和分离油脂，直到提取
溶剂呈无色，得到混合油；合并混合油油脱溶得到富含虾青素以及二十二碳六烯酸的微生
物油脂。

[0051] 实施例3

[0052] (1)雨生红球藻的培养

[0053] 雨生红球藻购自中国科学院淡水藻种库，编号为FACHB‑1927。

[0054] 雨生红球藻接种到BBM培养液中进行藻种的培养和扩培，雨生红球藻生长阶段培养条件为：温度28℃，光照强度2000lx，光照时间12h/天，培养液pH 8.0，培养过程中通过醋
酸来控制培养液pH不超过9。

[0055] BBM培养液配方为：NaNO3 0.25g/L、MgSO4·7H2O 0.14g/L、KH2PO4 0.02g/L、CaCl2 0.02g/L、EDTA 0.0004g/L、FeSO4·7H2O 0.002g/L、ZnSO4·7H2O 0.002g/L、MnCl2·4H2O 
0.00004g/L、CoNO3·6H2O 0.00006g/L、KOH 0.08g/L、H3BO3 0.0001g/L、CuSO4·5H2O 
0.00003g/L、MoO3 0.00001g/L、维生素B12 0.00003g/L、NaHCO3 0.06g/L、氨苄青霉素
0.012g/L。

[0056] (2)裂殖壶藻的培养

[0057] 采用保藏于中国典型培养物保藏中心的保藏号CCTCC NO:M2012494的裂殖壶藻。

[0058] 裂殖壶藻种子活化培养：将裂殖壶藻接种到活化培养基中振摇培养，培养温度25℃，摇床振摇转速为200r/min，培养时间45h，得到种子培养液，所述活化培养基为：葡萄糖
15g/L，谷氨酸钠30g/L，酵母浸膏8g/L，氯化钠20g/L，硫酸镁1g/L，pH自然。

[0059] 裂殖壶藻种子扩大培养：将经过活化培养的种子培养液接种到扩大培养基中振摇培养，得到种子扩大培养液。摇瓶中的扩大培养基为：葡萄糖50g/L，谷氨酸钠40g/L，酵母浸
膏5g/L，氯化钠10g/L，硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾10g/L，氯化钙0.6g/L，pH自然，培养48h。

[0060] (3)混菌发酵工艺

[0061] 雨生红球藻培养144h进入生长稳定期，在发酵液中接种裂殖壶藻，接种比例22％(体积比)，发酵温度30℃，搅拌速度300转/分钟，通气量1L/(L*min)，即每升发酵液中每分
钟所需要的空气通入量为1L，压力控制在0.1Mpa，培养80h，并在发酵过程中通过流加葡萄
糖来控制发酵液中碳源浓度在15g/L，一次补入谷氨酸钠30g/L。光照强度：13000lx，蓝光，
光暗比12h/12h。

[0062] (4)油脂提取工艺

[0063] 板框分离菌体后，于菌体中，加入正己烷，胶体磨和剪切机中分别循环破碎2次(共4次)至乳液颗粒体积平均粒径为500μm，再将混合液通过离心机得到一萃混合油及一萃菌
粕，将一萃菌粕加入正己烷，于胶体磨和剪切机中分别反复循环破碎和分离油脂，直到提取
溶剂呈无色，得到混合油；合并混合油油脱溶得到富含虾青素以及二十二碳六烯酸的微生
物油脂。

[0064] 实施例4

[0065] (1)雨生红球藻的培养

[0066] 雨生红球藻购自中国科学院淡水藻种库，编号为FACHB‑1927。

[0067] 雨生红球藻接种到BBM培养液中进行藻种的培养和扩培，雨生红球藻生长阶段培养条件为：温度23℃，光照强度1200lx，光照时间14h/天，培养液pH 8.0，培养过程中控制培
养液pH不超过9。

[0068] BBM培养液配方为：NaNO3 0.25g/L、MgSO4·7H2O 0.14g/L、KH2PO4 0.02g/L、CaCl2 0.02g/L、EDTA 0.0004g/L、FeSO4·7H2O 0.002g/L、ZnSO4·7H2O 0.002g/L、MnCl2·4H2O 
0.00004g/L、CoNO3·6H2O 0.00006g/L、KOH 0.08g/L、H3BO3 0.0001g/L、CuSO4·5H2O 
0.00003g/L、MoO3 0.00001g/L、维生素B12 0.00003g/L、NaHCO3 0.06g/L、氨苄青霉素
0.012g/L。

[0069] (2)裂殖壶藻的培养，采用保藏于中国典型培养物保藏中心的保藏号CCTCC NO:M2012494的裂殖壶藻。

[0070] 裂殖壶藻种子活化培养：将裂殖壶藻接种到活化培养基中振摇培养，培养温度25℃，摇床振摇转速为150r/min，培养时间48h，得到种子培养液，所述活化培养基为：葡萄糖
12g/L，谷氨酸钠22g/L，酵母浸膏5g/L，氯化钠15g/L，硫酸镁0.5g/L，pH自然。

[0071] 裂殖壶藻种子扩大培养：将经过活化培养的种子培养液接种到扩大培养基中振摇培养比例为1:10，得到种子扩大培养液。摇瓶中的扩大培养基为：葡萄糖32g/L，谷氨酸钠
23g/L，酵母浸膏5g/L，氯化钠16g/L，硫酸镁7g/L，磷酸二氢钾6g/L，氯化钙0.6g/L，pH自然。
培养温度28℃，搅拌速度150转/分钟，通气量1vvm(L/L.min)，培养时间44h。

[0072] (3)混菌发酵工艺

[0073] 雨生红球藻培养96h后，在发酵液中接种裂殖壶藻，接种比例16％(体积比)，温度28℃，搅拌速度200转/分钟，通气量1L/(L*min)，即每升发酵液中每分钟所需要的空气通入
量为1L，压力控制在0.1Mpa，培养96h，并在发酵过程中通过流加葡萄糖来控制发酵液中碳
源浓度在12g/L，并一次补入谷氨酸钠30g/L。光照强度：12000lx，蓝光，光暗比12h/12h。

[0074] (4)油脂提取工艺

[0075] 板框分离菌体后，于菌体中，加入正己烷，胶体磨和剪切机中分别循环破碎2次(共4次)至乳液颗粒体积平均粒径为500μm，再将混合液通过离心机得到一萃混合油及一萃菌
粕，将一萃菌粕加入正己烷，于胶体磨和剪切机中分别反复循环破碎和分离油脂，直到提取
溶剂呈无色，得到混合油；合并混合油油脱溶得到富含虾青素以及二十二碳六烯酸的微生
物油脂。

[0076] 实施例5

[0077] 实施例5与实施例4的区别在于，裂殖壶藻的接种量为35％。

[0078] 实施例6

[0079] 实施例6与实施例4的区别在于，裂殖壶藻的接种时间为雨生红球藻在生长对数期即72h时，进行接种。

[0080] 实施例7

[0081] 实施例7与实施例1的区别在于，裂殖壶藻的接种时间为雨声红球藻培养168h后

[0082] 实施例8

[0083] 实施例8与实施例1的区别在于，裂殖壶藻的种子扩大培养时间为28h。

[0084] 对比例1

[0085] (1)雨生红球藻的培养

[0086] 雨生红球藻购自中国科学院淡水藻种库，编号为FACHB‑1927。

[0087] 雨生红球藻接种到BBM培养液中进行藻种的培养和扩培，雨生红球藻生长阶段培养条件为：温度23℃，光照强度1200lx，光照时间14h/天，培养液pH 8.0，培养过程中通过二
氧化碳来控制培养液pH不超过9。

[0088] BBM培养液配方为：NaNO3 0.25g/L、MgSO4·7H2O 0.14g/L、KH2PO4 0.02g/L、CaCl2 0.02g/L、EDTA 0.0004g/L、FeSO4·7H2O 0.002g/L、ZnSO4·7H2O 0.002g/L、MnCl2·4H2O 
0.00004g/L、CoNO3·6H2O 0.00006g/L、KOH 0.08g/L、H3BO3 0.0001g/L、CuSO4·5H2O 
0.00003g/L、MoO3 0.00001g/L、维生素B12 0.00003g/L、NaHCO3 0.06g/L、氨苄青霉素
0.012g/L。

[0089] 雨生红球藻培养120h进入生长稳定期后，不接种裂殖壶藻，调整温度至30℃和光照强度为15000lx后继续发酵生长至96小时。

[0090] (2)裂殖壶藻的培养

[0091] 裂殖壶藻的培养，采用保藏于中国典型培养物保藏中心的保藏号CCTCC NO:M2012494的裂殖壶藻。

[0092] 裂殖壶藻种子活化培养：将裂殖壶藻接种到活化培养基中振摇培养，培养温度25℃，摇床振摇转速为150r/min，培养时间48h，得到种子培养液，所述活化培养基为：葡萄糖
12g/L，谷氨酸钠22g/L，酵母浸膏5g/L，氯化钠15g/L，硫酸镁0.5g/L，pH自然。

[0093] 裂殖壶藻种子扩大培养：将经过活化培养的种子培养液接种到扩大培养基中振摇培养比例为1：10，得到种子扩大培养液。摇瓶中的扩大培养基为：葡萄糖32g/L，谷氨酸钠
23g/L，酵母浸膏5g/L，氯化钠16g/L，硫酸镁7g/L，磷酸二氢钾6g/L，氯化钙0.6g/L，pH自然。
培养温度28℃，搅拌速度150转/分钟，通气量1vvm(L/L.min)，培养150h。

[0094] (3)分别提取油脂

[0095] 板框分离菌体后，于菌体中，加入正己烷，胶体磨和剪切机中分别循环破碎2次(共4次)至乳液颗粒体积平均粒径为500μm，再将混合液通过离心机得到一萃混合油及一萃菌
粕，将一萃菌粕加入正己烷，于胶体磨和剪切机中分别反复循环破碎和分离油脂，直到溶剂
呈无色，得到虾青素；

[0096] 二十二碳六烯酸(DHA)油脂的提取方法，循环破碎的次数同虾青素提取。

[0097] 实验检测

[0098] 雨生红球藻中虾青素测定方法采用国标：GB/T 31520‑2015。

[0099] DHA测定方法采用国标：GB/T 5009.168‑2003。

[0100] 油脂过氧化值的测定方法采用国标：GB/T 5538‑2005。

[0101] 检测结果见表1。

[0102] 表1

[0103]

[0104] 通过上述实施例可知，本方法不同于一步法中对于pH和光照的调节，也不同于二步法中更换培养基的做法，而是通过接入裂殖壶藻快速改善发酵环境来实现对雨生红球藻
的胁迫，此方法能够刺激雨生红球藻快速高效的积累虾青素，其虾青素的含量能提升至至
少1.4倍。

[0105] 另外，通过上述实施例可知，裂殖壶藻接入的条件关系到混菌发酵的产物结果，如果裂殖壶藻菌比例低于20％，则在后续的培养中由于菌种优势的原因，导致裂殖壶藻生长
受到限制，如果接种的裂殖壶藻比例超出30％，则使得裂殖壶藻占据较大优势，环境改变过
于剧烈，影响雨生红球藻油脂的积累代谢；如果雨生红球藻还未进入生长稳定期既接种会
使得雨生红球藻的生物量大大下降，从而影响最后虾青素的产量；实施例7镜检以后，发现
培养168h后的雨声红球藻开始形成厚壁孢子，此时裂殖壶藻再加入对其所起到的作用十分
有限，实施例8显示如果裂殖壶藻的种子扩培时间不足，则会使裂殖壶藻无法快速生长达到
刺激雨生红球藻的作用。

[0106] POV值主要是用来检测多不饱和脂肪酸的氧化程度，在表1中可以看到与虾青素一同得到的毛油产物中，多不饱和脂肪酸的氧化程度较低，这也表明油脂与虾青素一同产出
时，虾青素和油脂互相影响作用，油脂包裹虾青素可防止其氧化，而虾青素作为强抗氧化剂
又能反过来影响所得油脂产品的稳定性。

[0107] 尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地
实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限
于特定的细节和这里示出与描述的实施例。