用于防治肿瘤的病毒-载体复合物及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种用于防治肿瘤的病毒‑载体复合物及其制备方法和应用。本发明所述的病毒‑载体复合物为麻疹病毒减毒株与核外颗粒体的复合物，所述核外颗粒体包裹所述麻疹病毒减毒株。本发明用麻疹减毒活疫苗病毒感染Vero细胞株(非洲绿猴胚肾细胞株)，收集细胞培养上清中的Ecto‑MV(MV刺激Vero细胞株分泌的囊泡)，制备得到了病毒‑载体复合物(Ecto‑MV)，该复合物以Ectosome(Ecto)作为载体包裹麻疹减毒活疫苗病毒(MV)，具有显著的抑制肿瘤的作用，可用于治疗结肠癌。

权利要求

1.一种用于防治肿瘤的病毒-载体复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)细胞培养：用麻疹减毒活疫苗孵育对麻疹病毒敏感的细胞株，然后培养所述孵育后的对麻疹病毒敏感的细胞株，收集培养上清液；

(2)离心去除细胞碎片：将步骤(1)收集到的所述培养上清液离心去除细胞碎片，收集上清液；步骤(2)所述离心包括：将步骤(1)收集到的所述培养上清液在1900-2100g、0-6℃的条件下离心8-12min，取上清液在15000-17000g、0-6℃的条件下离心25-35min；

(3)收集病毒-载体复合物：将步骤(2)收集到的所述上清液过滤，去除直径超过450nm的颗粒，再将滤液离心，取沉淀，即得所述病毒-载体复合物；步骤(3)所述离心包括：将滤液在90000-110000g、0-6℃的条件下离心65-75min。

2.根据权利要求1所述的用于防治肿瘤的病毒-载体复合物的制备方法，其特征在于，所述对麻疹病毒敏感的细胞株为Vero细胞株。

3.根据权利要求1或2所述的用于防治肿瘤的病毒-载体复合物的制备方法，其特征在于，所述麻疹减毒活疫苗的MOI值为0.0001-0.0005；及/或，所述孵育的时间为2-4h；及/或，

培养所述孵育后的对麻疹病毒敏感的细胞株的培养基为含有FBS的DMEM细胞培养基；

及/或，

培养所述孵育后的对麻疹病毒敏感的细胞株的培养时间为84-108小时。

4.根据权利要求3所述的用于防治肿瘤的病毒-载体复合物的制备方法，其特征在于，所述孵育的条件为37℃、5％CO2，所述培养的条件为37℃、5％CO2。

5.一种用于防治肿瘤的病毒-载体复合物，其特征在于，其由权利要求1～4任一项所述方法制备得到。

6.权利要求5所述的病毒-载体复合物在制备防治肿瘤的药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为结直肠癌。

8.一种防治肿瘤的药物，其特征在于，其活性成分包括有权利要求5所述的病毒-载体复合物。

说明书

用于防治肿瘤的病毒-载体复合物及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种用于防治肿瘤的病毒-载体复合物及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 结直肠癌是胃肠道中常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌。在临床治疗过程中，手术、放疗以及化疗成为当今治疗肿瘤的基本手段，寻找有效、安全的抗肿瘤方法及药物是世界医学界面临的重要课题。

[0003] 麻疹减毒活疫苗接种于机体后，可刺激机体产生抗麻疹病毒的免疫力，用于预防麻疹。麻疹减毒活疫苗具有低毒性，安全性，持久免疫原性，在国内，人们已经广泛接种过麻疹减毒活疫苗，其免疫原性可持续10年以上。目前，没有将麻疹减毒活疫苗成功应用于抗肿瘤的相关文献的报道。

发明内容

[0004] 基于此，本发明提供了一种病毒-载体复合物的制备方法，该方法制备得到的病毒-载体复合物具有较为显著的防治肿瘤的作用。

[0005] 具体技术方案如下：

[0006] 一种用于防治肿瘤的病毒-载体复合物的制备方法，包括以下步骤：

[0007] (1)细胞培养：用麻疹减毒活疫苗孵育对麻疹病毒敏感的细胞株，然后培养所述孵育后的对麻疹病毒敏感的细胞株，收集培养上清液；

[0008] (2)离心去除细胞碎片：将步骤(1)收集到的所述培养上清液离心去除细胞碎片，收集上清液；

[0009] (3)收集病毒-载体复合物：将步骤(2)收集到的所述上清液过滤，去除直径超过450nm的颗粒，再将滤液离心，取沉淀，即得所述病毒-载体复合物。

[0010] 在其中一些实施例中，所述对麻疹病毒敏感的细胞株为Vero细胞株。

[0011] 在其中一些实施例中，所述麻疹减毒活疫苗的MOI值为0.0001-0.0005，进一步优选为0.0001-0.0003。

[0012] 在其中一些实施例中，所述孵育的时间为2-4h。

[0013] 在其中一些实施例中，培养所述孵育后的对麻疹病毒敏感的细胞株的培养基为含有FBS的DMEM细胞培养基。

[0014] 在其中一些实施例中，所述DMEM培养基中FBS的含量为1.8-2.2wt％。

[0015] 在其中一些实施例中，培养所述孵育后的对麻疹病毒敏感的细胞株的培养时间为84-108小时。

[0016] 在其中一些实施例中，所述孵育的条件为37℃、5％CO2，所述培养的条件为37℃、5％CO2。

[0017] 在其中一些实施例中，步骤(2)所述离心包括：将步骤(1)收集到的所述培养上清液在1900-2100g、0-6℃的条件下离心8-12min，取上清液在15000-17000g、0-6℃的条件下离心25-35min。

[0018] 在其中一些实施例中，步骤(3)所述离心包括：将滤液在90000-110000g、0-6℃的条件下离心65-75min。

[0019] 在其中一些实施例中，所述的用于防治肿瘤的病毒-载体复合物的制备方法，包括以下步骤：

[0020] (1)细胞培养：用含FBS的DMEM细胞培养基培养对麻疹病毒敏感的细胞株，待单层细胞长满，倒掉细胞培养基，细胞用PBS清洗后加入麻疹减毒活疫苗，孵育2-4h，孵育期间摇晃培养瓶2-4次使麻疹减毒活疫苗与细胞充分接触，孵育2-4h后加入含FBS的DMEM细胞培养基，继续培养84-108小时，收集培养上清液；

[0021] (2)离心去除细胞碎片：将步骤(1)收集到的所述培养上清液离心去除细胞碎片，收集上清液；

[0022] (3)收集病毒-载体复合物：将步骤(2)收集到的所述上清液过滤，去除直径超过450nm的颗粒，再将滤液离心，取沉淀用PBS重悬，即得所述病毒-载体复合物。

[0023] 在其中一些实施例中，步骤(3)所述用PBS重悬包括：取沉淀用PBS在90000-110000g、0-6℃的条件下重悬2遍，每遍65-75min。

[0024] 本发明还提供了一种病毒-载体复合物，该复合物具有较为显著的防治肿瘤的作用。

[0025] 具体技术方案如下：

[0026] 一种用于防治肿瘤的病毒-载体复合物，由上述的制备方法制备得到。

[0027] 一种用于防治肿瘤的病毒-载体复合物，由麻疹减毒活疫苗与对麻疹病毒敏感的细胞株进行共培养而制备得到。

[0028] 在其中一些实施例中，所述对麻疹病毒敏感的细胞株为Vero细胞株。

[0029] 一种用于防治肿瘤的病毒-载体复合物，所述病毒-载体复合物为麻疹病毒减毒株与核外颗粒体的复合物，所述核外颗粒体包裹所述麻疹病毒减毒株。

[0030] 本发明还提供了上述病毒-载体复合物的应用。

[0031] 具体技术方案如下：

[0032] 上述的病毒-载体复合物在制备防治肿瘤的药物中的应用。

[0033] 在其中一些实施例中，所述肿瘤为结直肠癌。

[0034] 本发明还提供了一种防治肿瘤的药物。

[0035] 具体技术方案如下：

[0036] 一种防治肿瘤的药物，其活性成分包括有上述的病毒-载体复合物。

[0037] 本发明的发明人发现麻疹减毒活疫苗的敏感细胞株Vero，能分泌大量的Ecto，本发明的发明人用麻疹减毒活疫苗病毒感染Vero细胞株(非洲猴胚肾细胞株)，收集细胞培养上清中的Ecto-MV(MV刺激Vero细胞株分泌的囊泡)，制备得到了病毒-载体复合物(Ecto-MV)，该复合物以Ectosome(Ecto)作为载体包裹麻疹减毒活疫苗中的麻疹病毒减毒株(MV)，Ectosome能被结肠癌等细胞株摄取，从而能够有效运输疹病毒减毒株到肿瘤细胞内。本发明的Ecto-MV以Ecto作为载体，将麻疹减毒活疫苗中的病毒运载到肿瘤细胞内，通过病毒在肿瘤细胞内的繁殖，靶细胞递呈MHCI类分子给CD8细胞，引起CTL细胞杀伤病毒感染的肿瘤细胞，利用机体自身免疫系统来杀伤肿瘤细胞。从而使所得Ecto-MV具有显著的抑制肿瘤的作用，可用于治疗结肠癌。

[0038] 本发明所述病毒-载体复合物选用粒径较大的Ecto作为运载麻疹减毒活疫苗的载体，相比于Exo具有更合适的粒径，提供了完整包裹麻疹减毒活疫苗的可能。以Ecto作为保护层，可以有效防止机体免疫系统免疫识别、杀伤麻疹减毒活疫苗。

[0039] 本发明的病毒-载体复合物选用麻疹减毒活疫苗，具有低毒性，安全性，持久免疫原性，以该病毒作为药物治疗肿瘤，不会引起麻疹的大范围流行。

附图说明

[0040] 图1为电镜拍摄的磷钨酸染色的Ecto和Ecto-MV；

[0041] 图2为透射电镜拍摄MV感染非洲猴胚肾细胞后，Ecto-MV，Ectos包裹病毒颗粒的超分辨率显微镜N-SIM/N-STORM的结果图；

[0042] 图3为纳米颗粒跟踪分析Ecto的粒径分布图，范围多在100-300nm之间；

[0043] 图4为纳米颗粒跟踪分析Ecto-MV的粒径分布图，范围多在100-300nm之间；

[0044] 图5为抗ADP核糖基化因子6，甘油醛-3-磷酸脱氢酶在Ecto和Ecto-MV中的表达；

[0045] 图6为病毒核苷酸蛋白在Ecto和Ecto-MV处理过的非洲猴胚肾细胞株中的表达；

[0046] 图7为Ecto和Ecto-MV处理后的非洲猴胚肾细胞株病毒核苷酸蛋白的mRNA表达水平；

[0047] 图8为Ecto-MV刺激非洲猴胚肾细胞株病毒核苷酸蛋白表达结果图；

[0048] 图9为免疫荧光方法检测肝素抑制非洲猴胚肾细胞摄取Ecto-MV的结果图；

[0049] 图10为肝素抑制非洲猴胚肾细胞摄取Ecto-MV，从而导致非洲猴胚肾细胞株病毒核苷酸蛋白的表达水平降低的结果图；

[0050] 图11为肝素抑制非洲猴胚肾细胞摄取Ecto-MV，从而导致Ecto-MV处理过的非洲猴胚肾细胞株空斑形成数量减少的结果图；

[0051] 图12为肝素抑制非洲猴胚肾细胞摄取Ecto-MV，从而导致Ecto-MV处理过的非洲猴胚肾细胞株病毒核苷酸蛋白的mRNA表达水平降低的结果图；

[0052] 图13为MV感染非洲猴胚肾细胞后病毒的mRNA表达水平；

[0053] 图14为MV感染非洲猴胚肾细胞后病毒的病毒核苷酸蛋白的表达水平；

[0054] 图15为Ecto-MV注射2-3周后，肿瘤的生长速度图；

[0055] 图16为Ecto-MV注射4周后，肿瘤的生长速度图；

[0056] 图17为Ecto-MV注射4周后，小鼠的生存率。

具体实施方式

[0057] 以下通过具体实施例对本发明的用于防治肿瘤的病毒-载体复合物及其制备方法和应用做进一步详细的描述。

[0058] 本发明所述核外颗粒体(Ectosome，简称为Ecto)，是指细胞分泌的囊泡，粒径在420nm以内。

[0059] 本发明所述Vero细胞株即非洲猴胚肾细胞株。

[0060] 本发明所述PBS是指磷酸盐缓冲液。

[0061] 以下实施例中所使用的麻疹病毒减毒株由北京天坛生物制品股份有限公司馈赠。

[0062] 实施例1 病毒-载体复合物以及核外颗粒体Ectosome(Ecto)的制备

[0063] 本实施例中的病毒-载体复合物中的载体是指麻疹减毒活疫苗刺激Vero细胞株分泌的核外颗粒体(Ectosome，该核外颗粒体属于囊泡)，即病毒-载体复合物是指核外颗粒体(Ectosome)和麻疹减毒活疫苗中的麻疹病毒减毒株(MV)的复合物，本发明中称为Ecto-MV。

[0064] (1)Ecto-MV的制备：

[0065] ①细胞培养，收集培养上清液：用T75培养瓶培养Vero细胞株，用含2wt％FBS的DMEM培养基培养Vero细胞株，待到Vero细胞株单层细胞长满，倒掉细胞培养基，细胞用PBS洗两遍，加入2ml麻疹减毒活疫苗(将疫苗冻干粉用无菌双蒸水溶解，以下简称病毒稀释液)，其MOI值为0.0002，置于37℃，5％CO2的敷箱孵育3h，每隔一小时摇晃培养瓶一次，保证病毒稀释液与细胞充分接触，3h后每瓶加入10ml的含2％FBS的DMEM细胞培养液，继续于37℃，5％CO2的敷箱培养96h，96h后收集病毒上清液。

[0066] ②离心去除细胞碎片：将步骤①收集到的病毒上清液用高速冷冻离心机在2000g、4℃的条件下离心10min，收集上清液转移到新离心管，在16000g、4℃的条件下再次离心
30min，进一步去除细胞及细胞碎片，弃沉淀，收集上清液。

[0067] ③过滤收集Ecto-MV：将步骤②收集到的上清液通过0.45μm滤器过滤，去除直径超过450nm的颗粒，将滤液转移到超高速离心机专用离心管，在100，000g、4℃的条件下离心70min，得到含有Ecto-MV的沉淀，沉淀用PBS重悬(100，000g，4℃，70min)洗2遍，即得Ecto-MV。

[0068] (2)Ecto的制备：

[0069] ①细胞培养，收集培养上清液：用T75培养瓶培养Vero细胞株，用含2％FBS的DMEM培养基培养Vero细胞株，待单层细胞长满，收集上清液。

[0070] ②离心去除细胞碎片：将步骤①收集到的上清液用高速冷冻离心机在2000g、4℃的条件下离心10min，收集上清液转移到新离心管，在16000g、4℃的条件下再次离心30min，进一步去除细胞及细胞碎片，弃沉淀，收集上清液。

[0071] ③过滤收集Ecto：将步骤②收集到的上清液通过0.45μm滤器过滤，去除直径超过450nm的颗粒，将滤液转移到超高速离心机专用离心管，在100，000g、4℃的条件下离心
70min，得到含有Ecto的沉淀，沉淀用PBS重悬(100，000g，4℃，70min)洗2遍，即得Ecto。

[0072] 实施例2 Ecto、Ecto-MV的鉴定

[0073] 对实施例1制备得到的Ecto、Ecto-MV进行鉴定

[0074] (1)Ecto、Ecto-MV的电镜鉴定

[0075] 分别取实施例1中离心后的Ecto、Ecto-MV沉淀700μg，PBS洗2遍，用100μl PBS重悬，吸取10μl，做5×，10×稀释，每样本各取50μl，铜网钨磷酸负染，透射电镜拍摄，每个样本选取10个视野，即可用透射电镜观察Ecto、Ecto-MV结构。结果如图1所示，从结果可以看出MV刺激前后Vero细胞分泌的Ecto具有双层脂质膜结构(图1)。

[0076] (2)超分辨率显微镜N-SIM/N-STORM验证Ecto-MV

[0077] 取离心后的Ectosome沉淀，PBS洗2遍，200μL PBS重悬后，取40μL与60μL PBS混合后加入共聚焦小皿中，孵育Measles Nuleoprotein抗体(病毒核苷酸蛋白抗体)和PKH67染料，超分辨率显微镜下观察(图2)。Ectosome、Ecto-MV、MV用PKH67染色(激发波长为488nm)，Measles necluoprotein抗体孵育后用Alexa 647染色(激发波长为647)：观察到Ecto-MV存在PKH67和Measlesnecluoprotein共表达(图2中的A图)。Ecto-MV用PKH67染色(激发波长为488nm)；Measles necluoprotein抗体结合后用Alexa 594染色(激发波长为561)：观察到囊泡呈绿色，囊泡内可见红色高亮的MV颗粒(图2中的B图)。

[0078] (2)Ecto、Ecto-MV的粒径鉴定

[0079] 分别取实施例1中离心后的Ecto、Ecto-MV沉淀200μg，PBS洗2遍，用50μl PBS重悬，测试时做200倍稀释，通过NTA鉴定Ecto、Ecto-MV的粒径大小。结果如图3和图4所示，从结果可以看出Ecto和Ecto-MV的粒径多分布在100-300nm之间，Ecto的均值为208.3nm，标准差为122.8nm；Ecto-MV的均值为216.4nm，标准差为175.3nm。

[0080] (3)Western Blot的验证

[0081] ①裂解核外颗粒体：取PBS洗过的实施例1制备的Ecto、Ecto-MV沉淀各4000ug，对照组Ecto，实验组Ecto-MV，分别加细胞裂解液，50μl/管，用100μl的枪吹打均匀，无肉眼可见团块，涡旋器涡旋1min，冰上静置10min。

[0082] ②超声：冰上超声7s，1次，冰上静置10min，离心12000rpm，4℃，30min，取上清。

[0083] ③测浓度：BCA法测定上清中蛋白的浓度。

[0084]

[0085] 变性：上样量30μg，5x loading buffer变性

[0086] 上样体积＝上样量(ng)/样品浓度+5x loading buffer

[0087] 混匀，99℃，5min，4℃保存

[0088] ④Western Blot

[0089] 清洗玻璃板：洗洁精轻轻擦洗玻璃板，用自来水反复冲洗，最后用蒸馏水冲1遍，放于67℃烤箱烤干；梳子按上述方法冲洗，晾干。

[0090] 配胶：将玻璃板长、短板对齐后放入夹中卡紧，配制10％的分离胶溶液，依次将蒸馏水、30％Acr-Bis(29：1)、Tris、PH8.8、10％SDS、10％过硫酸铵、TEMED加入烧杯中，摇晃混匀，吸5ml至两块玻璃板之间，迅速吸1ml的无水乙醇压线，室温静置30min，倒出无水乙醇，滤纸吸干剩下的乙醇；配10％浓缩胶，摇匀，将玻璃板加满，插入小梳子，避免气泡，室温静置30min。

[0091] 上样：将玻璃板取下，插入小架子中固定，放于电泳槽，拔出梳子，将小架子中加满电泳液，加入目的蛋白，最外侧加4μl Marker，中间孔加入样品蛋白Ecto、Ecto-MV。

[0092] 电泳：放入电泳盒中，盒中加满电泳液，放上盖子，打开电泳机，电压调整至80V 30min，Marker达到分离胶后调至110V 80min。

[0093] 转膜：取胶，沿两块玻璃板中间轻轻撬开玻璃板，将分离胶，浓缩胶轻轻刮离玻璃板；黑色板在下面，按滤纸—胶—膜—滤纸的顺序放置，赶走气泡；PVDF膜事先放置于甲醇中浸泡3min，水中浸泡1min；将裁好的胶放于转膜夹子的滤纸上，盖上浸过甲醇的PVDF膜，赶走胶和膜之间的气泡，将浸泡过转膜液的滤纸轻轻压在膜上面，放上海绵，旋紧夹子；将转膜夹放入电泳槽，倒满转膜缓冲液，电泳槽外面放冰；转膜：ARF-6(抗ADP核糖基化因子)：150mA，60min；GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)：150mA，45min；

[0094] ⑤免疫反应

[0095] 洗膜：取出一小盒，加入20ml TBST，把膜取出，放于甲醇中固定3min，放入TBST中，于摇床上，洗5次，3min/次。

[0096] 封闭：将膜，放于5％牛奶中封闭非特异性抗原，室温摇床上慢摇1小时[0097] 孵一抗：一抗用前先离心，将鼠单克隆抗体ARF-6，GAPDH，分别吸入WB一抗稀释液中，GAPDH抗体比例为1：500，ARF-6用量比例为1:1000，500μl的枪充分混匀后离心3min；将膜置于直径为15cm的大皿中，配制好的一抗均匀滴在膜上，其上覆盖保鲜膜，放于4℃冰箱中过夜；取出膜，PBST中洗，洗5次，3min/次。

[0098] 孵二抗：将辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗吸入5％的牛奶中，比例为1：5000，混匀，摇床上，室温孵育1h。

[0099] ⑥化学发光

[0100] 洗膜：取出膜，放于PBST中洗，5次，3min/次。

[0101] 配发光液：避光，A和B液各500μl，A、B的比例为1：1，共1ml。

[0102] 发光显影：天能发光仪器，待软件温度降至-32℃开始使用，将显影液滴至膜上，200μl/条，ARF-6发60s，GAPDH发30s。

[0103] ⑦检测结果

[0104] 结果如图5所示，从结果可以看出MV刺激前后的Vero细胞分泌的Ecto表达囊泡标记物ARF-6，同时检测到GAPDH的表达，说明本发明的核外颗粒体Ecto属于囊泡。

[0105] 实施例3 Ecto包裹麻疹减毒疫苗株的验证

[0106] 本实施例检测Ecto-MV是否成功包裹麻疹病毒减毒株。

[0107] (1)Ecto-MV包裹病毒验证

[0108] ①Western Blot验证Ecto-MV刺激后细胞内病毒蛋白表达水平

[0109] 铺六孔板：用胰酶消化培养瓶中Vero细胞1分钟，加入2mL的含10％FBS的DMEM重悬，用枪头吹打混匀，吸取10μL于计数板计数，铺六孔板，每孔细胞数为1×106/mL，室温静置30分钟，置于37℃，5％CO2敷箱培养5小时，待细胞贴壁。

[0110] Ecto-MV或者Ecto预处理：吸取实施例1制备的Ecto-MV(实验组)或者Ecto(对照组)沉淀于新的超高速离心管，加0.45μm滤器过滤过的PBS配平，放于超高速离心机，100，000g，70min，4℃，洗2遍，取沉淀。

[0111] Ecto-MV或者Ecto定量：用50μL PBS重悬Ecto-MV或者Ecto沉淀，吹打均匀，直至无肉眼可见团块，用BCA法测Ecto-MV或者Ecto的浓度；每个孔140μg Ecto-MV或者Ecto，即140μg/L×106个/mL

[0112] 过滤：实验组将Ecto-MV沉淀加到含1％双抗的2％的维持液中(对照组为Ecto沉淀)，用0.45μm的过滤器过滤3遍。

[0113] 加液：将过滤过的液体加入到六孔板中，3mL/孔，共培养96h，观察病毒空斑出现个数，记录空斑。

[0114] 55h时拍照，收蛋白，跑WB，方法同实施例2所述。

[0115] ②RT-qPCR验证细胞内病毒基因的表达水平

[0116] 提取RNA：前面步骤与上述①中叙述的相同，55h时，从敷箱中拿出Vero六孔板，吸走培养基上清，PBS洗两遍，吸干PBS，加入1mL的Tori 20l吹打，当液体由粘稠变为稀薄时停止吹打，再加200μL的氯仿，剧烈震荡15s，提取RNA，上机测RNA浓度。

[0117] 反转录：定RNA的最终质量为500ng，加入所需RNA的量，2μl 5×Prim3 cript RT mastermix(2×)，最终用DEPC水将反转录的体系定为10μL离心，充分混匀，放于PCR仪器中，37℃,15min，85℃,5s，最后得到cDNA，加入40μL的DEPC水稀释混匀，放于-20℃保存待用。

[0118] 加样：设对照组GAPDH，每孔GAPDH上、下游引物各加0.4μL，10μL,SYBR premix Ex Tap(2×)，6.8μL DEPC水，0.4μL Rox Reference DyeII(50×)，2μL的cDNA模板；实验组为病毒核苷酸蛋白，每孔病毒核苷酸蛋白的上、下游引物各加0.4μL其余加试剂与对照组相同；待加样完毕，将样本离心，确保离心管中无气泡存在。

[0119] 上机，扩增目的基因：反应条件为94℃预变性4min；94℃,30sec，55℃30sec,72℃1min,35个循环。

[0120] ③免疫荧光验证细胞内病毒蛋白的表达

[0121] 铺共聚焦小皿：用胰酶消化培养瓶中Vero细胞1分钟，加入2mL的含10％FBS的DMEM重悬，用枪头吹打混匀，吸取10μL于计数板计数，铺共聚焦小皿，每皿细胞数为1×105/mL，室温静置30分钟，置于37℃，5％CO2敷箱培养。

[0122] Ecto和Ecto-MV预处理：吸取实施例1制备的Ecto和Ecto-MV沉淀于新的超高速离心管，加过滤过的PBS配平，放于超高速离心机，100,000g，70min，4℃，洗2遍，取沉淀。

[0123] 往沉淀中加500μL DilluentC，反复轻轻的吹打，确保沉淀完全分散开，无肉眼可见团块，注意不要涡旋，不要将细胞置于DilluentC中过长的时间，操作于常温20-25℃。

[0124] 吸取500μL的DilluentC于1.5mL的EP管中，立即添加2μL2×染料溶液，混合均匀，将上述液体混合在一起，用枪头吹打，周期性混匀，时间为1-5min。

[0125] 添加同体积(1mL)的血清，或者5mL的含10％FBS的DMEM，混合均匀，终止染色，时间为1min，用含10％FBS的DMEM配平超高速离心机专用离心管，将超高速离心管放于离心机中，离心100,000g，4℃，70min，去上清，再次加入10％的DMEM，相同条件下离心，取沉淀，用100μL的含2％FBS DMEM重悬沉淀，得到Ecto-MV悬液或者Ecto悬液。

[0126] 将Ecto-MV悬液或者Ecto悬液，加入到含1％双抗的2％的维持液中，用枪头吹打混合均匀，0.45μm过滤器过滤3遍，加入到共聚焦小皿中，140μg/孔，细胞与PKH67标记的Ecto-MV，37℃，5％CO2，共同孵育72h。

[0127] 72h后吸走细胞上清，PBS轻轻的洗2遍，4％多聚甲醛固定10min，室温，摇床上PBS洗3遍，3min/次；每个小皿加100μL山羊血清封闭液，室温条件下30分钟，封闭非特异性抗原；30分钟后，摇床上PBS洗3遍，每孔加100μL配好的鼠单克隆抗体病毒核苷酸蛋白(一抗用一抗稀释液配制，比例为1：200)；4℃过夜孵育。摇床上，PBS洗3遍，每个皿加100μL荧光二抗，37℃孵育30分钟，荧光二抗用PBS配制，比例为1：100；30分钟后，把小皿从敷箱中拿出来，摇床上PBS洗5遍，吸走PBS，DAPI染色，每个小皿加100μL配制好的DAPI，室温下染色15min，DAPI用PBS配，DAPI比例为1：50；15分钟后，摇床上PBS洗5遍，3min/次，避光保存，12h内拍照。

[0128] 免疫荧光验证Vero细胞株摄取Ecto-MV，并造成细胞的感染。

[0129] ④肝素抑制细胞摄取Ecto-MV。

[0130] Western Blot检测肝素处理后核苷酸蛋白的表达：加肝素处理组为实验组：不加肝素处理组为对照组。六孔板中的Vero细胞株用含20μg/mL肝素的完全培养基处理，37℃、5％CO2孵育30min，吸走细胞培养液，加过滤好的含有肝素的Ecto-MV悬液，3mL/孔，Ecto-MV含量140μg/mL，放于37℃，5％CO2的敷箱中培养72h，做Western Blot检测实验组和对照组核苷酸蛋白的表达水平，方法与上述①中叙述相同；同时于不同时间点48h、60h、72h、84h计数六孔板中的空斑形成数量，比较不同处理组空斑形成数量的差异。

[0131] RT-qPCR检测肝素处理后的病毒核苷酸基因水平mRNA的表达：加肝素处理组为实验组：不加肝素处理组为对照组。六孔板中的Vero细胞株用含20μg/mL肝素的完全培养基处理，37℃,5％CO2孵育30min，吸走细胞培养液，加过滤好的含有肝素的Ecto-MV悬液，3mL/孔，Ecto-MV含量140μg/mL，放于37℃，5％CO2的敷箱中培养72h，拿出培养板，PBS洗涤两次，提取RNA，方法同上述②中叙述所述。通过RT-qPCR检测病毒核苷酸基因的mRNA表达水平。

[0132] 免疫荧光检测肝素抑制Ecto-MV的摄取：实验组，PKH67预染的Ecto-MV悬液，加入到含1％双抗的2％的维持液中，维持液含20μg/mL肝素，用枪头吹打混合均匀，0.45μm过滤器过滤3遍，加入到共聚焦小皿中，140μg/孔，37℃，5％CO2，共同孵育72h；对照组不加肝素，其余条件与实验组相同。72h后吸走细胞上清，PBS轻轻的洗2遍，4％多聚甲醛固定10min，室温，摇床上PBS洗3遍，3min/次；吸走PBS，DAPI染色，每个小皿加100μL配制好的DAPI，室温下染色15min，DAPI用PBS配，DAPI比例为1：50；15分钟后，摇床上PBS洗5遍，3min/次，避光保存，12h内拍照；

[0133] ⑤肝素对病毒活力影响验证

[0134] 实验组将MV与Vero细胞株共培养，培养基用浓度为20mg/mL的肝素的2％维持液，对照组只用2％的维持液培养，其他条件不变，84h后提取RNA，测肝素处理前后Nucleoprotein的mRNA表达水平；同时提取蛋白，用Western Blot测肝素处理前后的蛋白表达水平。

[0135] (3)结果

[0136] ①Western Blot验证细胞内病毒蛋白表达水平

[0137] 将Vero细胞与Ecto或者MV-Ecto共培养72h，经Western Blot检测，结果显示：处理组的细胞内病毒核苷酸蛋白较对照组有高表达，说明Ecto-MV与Vero细胞株共培养能够引发Vero细胞株病毒感染，说明Ecto-MV中含有病毒(图6)；

[0138] ②RT-qPCR验证细胞内病毒核苷酸蛋白基因表达水平

[0139] Vero与Ecto或者MV-Ecto共培养72h，提取RNA，结果显示：病毒核苷酸蛋白基因表达水平mRNA的基因表达量显著高于对照组。说明MV-Ecto中含有病毒，能够引发Vero细胞株的病毒感染；*表示P<0.01(图7)。

[0140] ③免疫荧光验证细胞内病毒蛋白的表达

[0141] Vero细胞株与Ecto或者Ecto-MV共培养96h，结果显示：处理组与实验组均有PKH 67标记的核外颗粒体的摄取，MV-Ecto处理组，检测到病毒空斑内核苷酸蛋白病毒核苷酸蛋白的表达，说明MV-Ecto包裹有病毒。(图8)

[0142] ④排除游离病毒的影响(免疫荧光检测肝素抑制核外颗粒体的摄取)

[0143] 将Ecto-MV与Vero细胞株共培养72h，另设肝素抑制Ecto-MV摄取组，免疫荧光方法检测细胞内的PKH67预染的Ecto-MV，绿色荧光代表PKH67标记的Ecto-MV，结果显示，肝素处理组Vero细胞摄取的Ecto-MV减少(图9)。

[0144] Western Blot检测肝素处理后核苷酸蛋白的表达

[0145] Vero细胞株与Ecto-MV共培养，实验组的培养基中加入20ug/mL的肝素，对照组不加肝素处理，分别于不同的时间点计数空斑形成的个数，72h后提取Vero细胞的蛋白，经Western Blot检测，结果显示：肝素处理组的病毒核苷酸蛋白表达水平降低(图10)，空斑形成数量低于对照组(图11)。说明肝素抑制细胞摄取Ecto-MV，病毒核苷酸表达降低的部分是由核外颗粒体包裹病毒(Ecto-MV)引起的。

[0146] RT-qPCR检测肝素处理后的核苷酸基因水平mRNA的表达

[0147] Vero细胞株与Ecto-MV共培养，处理组用含20ug/mL的肝素的维持液共培养，对照组用不含肝素的维持液培养，72h后，分别提取Vero细胞株的RNA，经RT-qPCR检测病毒核苷酸蛋白的mRNA水平；结果显示：肝素处理组的病毒核苷酸蛋白的mRNA水平显著低于对照组。说明肝素通过抑制细胞摄取核外颗粒体引起病毒核苷酸蛋白的mRNA水平降低，mRNA降低的部分由核外颗粒体包裹的病毒引起，说明核外颗粒体能够包裹病毒(图12)。

[0148] ⑤肝素影响病毒活力的验证

[0149] 在含肝素的培养基中，对照组为Vero细胞株与稀释过的麻疹病毒疫苗株MV共培养，实验组为含20ug/mL肝素的培养基，48h后观察病毒核苷酸蛋白的mRNA水平和蛋白表达量。结果显示：对照组和实验组的病毒核苷酸蛋白的mRNA水平没有差异，p＝0.28，说明肝素不影响病毒感染细胞的mRNA表达水平(图13)；Western Blot结果显示：两组的病毒核苷酸蛋白的蛋白表达水平差异不明显，说明肝素对病毒感染后的细胞蛋白表达水平影响较小(图14)。

[0150] 本实施例将Ecto、Ecto-MV与Vero细胞株共培养，检测细胞株中病毒核蛋白mRNA、病毒核苷酸蛋白的表达水平增高，能够感染细胞株形成空斑，说明Ecto-MV中包裹了病毒，包裹的是有活力的病毒，感染靶细胞后引起病毒蛋白的转录、翻译水平增高。通过肝素抑制靶细胞摄取Ecto-MV，感染的靶细胞病毒mRNA、病毒核苷酸蛋白的表达水平降低，具有统计学意义；对照组用肝素、MV同时与靶细胞共培养，靶细胞的核蛋白和mRNA表达水平未有明显变化(р>0.05)；说明肝素抑制靶细胞摄取Ecto-MV，靶细胞内mRNA和蛋白表达水平降低的部分由Ecto-MV包裹的病毒引起。

[0151] 实施例4 Ecto-MV对动物皮下瘤的影响

[0152] ①小鼠皮下成瘤实验

[0153] 胰酶消化CT26细胞，制成细胞悬液，无血清的培养基洗3遍，细胞计数，调整密度。6
取Balb/c小鼠30只，将细胞注射到小鼠右下背侧皮下，注射细胞数为4×10个。

[0154] ②皮下瘤内注射Ecto-MV、PBS、Ecto

[0155] 注射CT26细胞后约10天，皮下瘤体积约700mm3时，实验组皮下瘤内注射实施例1制备的Ecto-MV，用PBS重悬Ecto-MV沉淀，80ug/只，调整浓度，每只注射20ul。另设对照组Ecto组和PBS组，Ecto组注射Ecto悬液80μg/只，PBS组注射20μL PBS。在0d、2d、4d各注射一次。每隔天游标卡尺测量皮下瘤体积大小，连续观察4-5周。待小鼠自然死亡，记录小鼠的生存时间，做出生存分析图像。

[0156] 结果如15和16所示，从结果可以看出，注射Ecto-MV 2-3周，肿瘤的生长速度明显减慢，具有统计学意义。4周之后，Ecto-MV处理组的皮下瘤生长速度慢于PBS对照组，具有统计学意义。如图17所示，Ecto-MV处理组的生存率高于对照组。

[0157] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

[0158] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。