单核苷酸多态性rs976754检测他汀相关性肌病装置和应用

摘要

本发明提供了一种他汀相关性肌病检测装置，所述装置针对待测样本的单核苷酸多态性位点rs976754进行Massarray SNP分型检测，该装置包括以下组成机构：引物合成机构；样本检测定量机构；PCR反应机构；单碱基延伸反应机构；和计算机检测和分析机构。此位点的基因型对识别肌病高风险人群，早期调整用药具有重要的指导意义。对于需要服用他汀类降脂药物的患者，早期进行肌病风险基因的筛选，预测肌病发生的风险，并给予个体化用药指导，对降低药物不良反应的发生，原发病的预后转归及提升患者生存质量具有重要的意义。

权利要求

1.单核苷酸多态性位点rs976754的PCR引物和/或单碱基延伸引物在制备用于针对待测样本的单核苷酸多态性位点rs976754进行Massarray SNP分型检测阿托伐他汀相关性肌病的检测装置中的应用；

其中，所述PCR引物的正向引物序列为SEQ ID No:1，反向引物序列为SEQ ID No:2。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，该装置包括以下组成机构：引物合成机构，其中，所述引物为单核苷酸多态性位点rs976754的PCR引物和单碱基延伸引物；

样本检测定量机构；

PCR反应机构；

单碱基延伸反应机构；和

计算机检测和分析机构。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述装置还包括选自以下的一种或多种组成机构：单核苷酸多态性位点rs976754序列分析机构；

引物设计机构；

SAP纯化反应机构；和

树脂纯化机构。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述引物合成机构包括但不限于：固相亚磷酰胺三酯合成机构，BioRP/OPC纯化机构，HPLC纯化机构，和/或PAGE纯化机构；

所述样本检测定量机构包括但不限于：紫外分光光度机构，电泳机构；

所述PCR反应机构包括但不限于：热启动PCR机构，降落PCR机构，和/或巢式PCR机构；

所述SAP纯化反应机构包括但不限于：去磷酸化处理机构；

所述单碱基延伸反应机构包括但不限于：SNaPshot机构；

所述计算机检测和分析机构包括但不限于：统计学分析机构；

所述单核苷酸多态性位点rs976754序列分析机构包括但不限于：电泳机构；

所述引物设计机构包括但不限于：基因序列获取机构；

所述树脂纯化机构包括但不限于：离子交换树脂机构。

5.单核苷酸多态性位点rs976754的PCR引物和/或单碱基延伸引物在制备用于检测阿托伐他汀相关性肌病的产品中的应用；

其中，所述PCR引物的正向引物序列为SEQ ID No:1，反向引物序列为SEQ ID No:2。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述产品为阿托伐他汀相关性肌病的早期诊断产品。

7.针对待测样本的单核苷酸多态性位点rs976754进行Massarray SNP分型检测阿托伐他汀相关性肌病的检测装置的非诊断目的的操作方法，其特征在于，所述装置包括以下组成机构：引物合成机构，其中，所述引物为单核苷酸多态性位点rs976754的PCR引物和单碱基延伸引物；所述PCR引物的正向引物序列为SEQ ID No:1，反向引物序列为SEQ ID No:2；

样本检测定量机构；

PCR反应机构；

单碱基延伸反应机构；

计算机检测和分析机构；

单核苷酸多态性位点rs976754序列分析机构；

引物设计机构；

SAP纯化反应机构；和

树脂纯化机构；

并且，所述方法包括：

(1)通过引物合成机构合成引物；其中，在引物合成前通过单核苷酸多态性位点rs976754序列分析机构对序列进行分析，并通过引物设计机构进行引物设计；

(2)通过样本检测定量机构进行DNA提取及质量检测；

(3)通过PCR反应机构对利用步骤(1)合成的引物对步骤(2)提取的DNA进行扩增，在所述PCR反应后通过SAP纯化反应机构对产物进行碱性磷酸酶处理；

(4)通过单碱基延伸反应机构对步骤(3)所得的产物进行单碱基延伸反应，在所述单碱基延伸反应后对产物进行树脂纯化；

(5)通过计算机检测和分析机构对步骤(4)所得产物进行检测和分析。

说明书

单核苷酸多态性rs976754检测他汀相关性肌病装置和应用

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种单核苷酸多态性rs976754检测他汀相关性肌病装置和应用。

背景技术

[0002] 颅内动脉粥样硬化是缺血性脑血管病发生的独立危险因素，高血脂可促进动脉粥样硬化斑块的形成。而阿托伐他汀(atorvastatin)作为降脂治疗的一线用药能够竞争性抑制胆固醇合成限速酶3羟基‑甲基戊二酞辅酶A(3‑hydroxy‑3methylglutaryl CoA,HMG‑CoA)还原酶，使胆固醇合成减少，同时促进浓度依赖的LDL受体活性提高，加速LDL的分解代谢从而能显著降低血脂水平、稳定斑块，对缺血性脑血管病的预防非常有益。

[0003] 通常阿托伐他汀的使用是有效和安全的，但是随着其在临床中的广泛应用，药物不良反应也随之出现。其中，最常见的不良反应就是他汀相关性肌病，包括良性肌痛、更为严重的肌炎以及危及生命的横纹肌溶解症在内的肌肉并发症。根据现有的文献，他汀相关性肌病的发生率约为5％。但是，这很可能低估了临床实践中的真实发生率。在随机抽取的门诊患者中所进行的临床观察表明，他汀类药物导致肌肉毒性的实际发生率为9％～27％。虽然大多数他汀相关性肌病并不会导致肌肉损伤或增加健康风险，但即使是良性肌痛也可影响患者的生活质量，并容易促使患者因此而中断治疗，增加脑缺血事件的发生风险。因此若能准确识别肌病高风险人群，并早期进行个体化用药治疗，可显著提高患者生存质量。

[0004] 他汀相关性肌病的发生机制目前尚不明确，可能与遗传因素和非遗传因素有关。有资料显示年龄、性别、服药剂量及联合用药等非遗传因素在一定程度上与肌病发生风险相关，但遗传因素有可能是肌病发生的最重要的因素。他汀类药物在体内的代谢通路如下：
药物经肠道CYP450超家族的CYP3A4、CYP3A5催化后生成活性和非活性代谢产物，原形药物和代谢产物主要通过肝细胞膜上的有机阴离子转运多肽1B1(OATP1B1)转运入肝脏，少量可以直接经血流进入肝脏，进而发挥生物学效应，同时在肝脏内多种药物代谢酶的作用下进一步分解为其他有活性或无活性的代谢产物，最后经肝脏排泄或直接渗透入血经肾脏排泄。

[0005] 由于他汀是在肝脏发挥生物学效应，而血中的药物浓度则与其不良反应的发生相关，一般认为随着他汀血药浓度的升高其不良反应的发生率也是增加的。从药物动力学角度来说，他汀类药物吸收、转运和代谢相关的基因变异均可能导致其血药浓度的升高而增加不良反应的发生率。目前研究较多的是SLCO1B1基因多态性与肌病发生的相关性。有机阴离子转运多肽1B1(OATP1B1)为跨膜转运蛋白，主要分布于肝脏，是运输他汀类药物进入肝脏的主要运载蛋白，研究认为编码该蛋白的基因SLCO1B1多态性与他汀不良反应相关。有研究发现SLCO1B1c.521T>C(rs4149056，splicing)突变引起氨基酸(p.174V>A)的改变，从而导致OATP1B1转运活性降低，引起他汀在机体内的血药浓度升高，进而导致肌病等不良反应的发生。SLCO1B1c.521T>C改变可作为肌病风险的独立遗传预测因子，基于大量临床研究，美国FDA对携带521C等位基因的患者采用降脂药物的种类及剂量进行了推荐。然而在临床实际工作中本发明人发现，未携带521C等位基因的患者在服药期间肌痛、肌无力或CK升高也时有发生。因此虽然SLCO1B1c.521T>C的位点突变与肌病发生的关系已经得到证明，但是由于其作用有限，对患者该基因进行常规检测使临床获益的证据并不充分，且既往的研究多为白种人群，不同种族人群的基因频率和连锁状态存在很大不同，因此有必要对SLCO1B1其他SNP位点进行筛选，寻找肌病发生的遗传学病因，预测肌病发生风险，降低肌病的发生率。

[0006] 单核苷酸多态性(SingleNucleotidePolymorphisms，SNP)，是指在某一人群的正常个体基因组内特定核苷酸位置存在的单个不同碱基，且频率至少大于1％。由于SNP的低突变率、高密度、易于检测使SNP被认为是继第一代限制性片段长度多态性标记和第二代微卫星多态性标记之后的第三代遗传标记。人类目前已经发现了几百万个单核苷酸多态性位点，并且进一步研究了它在基因组上的频率和分布，利用SNP探索人群对药物疗效及毒副作用的个体差异也有了许多实例。最有代表性的是CYP2C19不同基因型与抗血小板药物氯吡格雷的疗效的遗传研究。利用SNP多态性的相关分析，研究人员发现CYP2C19基因的*2/*3基因型与氯吡格雷抵抗相关。因此利用SNP找到影响药物疗效以及毒副作用的突变基因，将以SNP为基础的研究应用于临床，这样才能给予个体化给药，提升患者生存质量。

发明内容

[0007] 因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种单核苷酸多态性rs976754检测他汀相关性肌病装置和应用。

[0008] 在阐述本发明内容之前，定义本文中所使用的术语如下：

[0009] 术语“他汀相关性肌病”是指：他汀治疗可诱发包括良性肌痛、更为严重的肌炎以及罕见的致死性横纹肌溶解症在内的肌肉并发症即他汀相关性肌病。

[0010] 为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种他汀相关性肌病检测装置，所述装置针对待测样本的单核苷酸多态性位点rs976754进行Massarray SNP分型检测，该装置包括以下组成机构：

[0011] 引物合成机构，优选地，所述引物为：所述正向引物序列为SEQ ID No:1，所述反向引物序列为SEQ ID No:2；

[0012] 样本检测定量机构；

[0013] PCR反应机构；

[0014] 单碱基延伸反应机构；和

[0015] 计算机检测和分析机构；

[0016] 优选地，所述他汀相关性肌病为阿托伐他汀相关性肌病。

[0017] 根据本发明第一方面的检测装置，其中，所述装置还包括选自以下的一种或多种组成机构：

[0018] 单核苷酸多态性位点rs976754序列分析机构；

[0019] 引物设计机构；

[0020] SAP纯化反应机构；和

[0021] 树脂纯化机构。

[0022] 根据本发明第一方面的检测装置，其中，所述引物合成机构包括但不限于：固相亚磷酰胺三酯合成机构，BioRP/OPC纯化机构，HPLC纯化机构，和/或PAGE纯化机构；

[0023] 所述样本检测定量机构包括但不限于：紫外分光光度机构，电泳机构；

[0024] 所述PCR反应机构包括但不限于：热启动PCR机构，降落PCR机构，和/或巢式PCR机构；

[0025] 所述SAP纯化反应机构包括但不限于：去磷酸化处理机构；

[0026] 所述单碱基延伸反应机构包括但不限于：SNaPshot机构；

[0027] 所述计算机检测和分析机构包括但不限于：统计学分析机构；

[0028] 所述单核苷酸多态性位点rs976754序列分析机构包括但不限于：电泳机构；

[0029] 所述引物设计机构包括但不限于：基因序列获取机构；

[0030] 所述树脂纯化机构包括但不限于：离子交换树脂机构。

[0031] 本发明的第二方面提供了第一方面所述的检测装置的操作方法，所述方法包括：

[0032] (1)通过引物合成机构合成引物；优选地，在引物合成前通过单核苷酸多态性位点rs976754序列分析机构对序列进行分析，并通过引物设计机构进行引物设计；

[0033] (2)通过样本检测定量机构进行DNA提取及质量检测；

[0034] (3)通过PCR反应机构对利用步骤(1)合成的引物对步骤(2)提取的DNA进行扩增；优选地，在所述PCR反应后通过SAP纯化反应机构对产物进行碱性磷酸酶处理；

[0035] (4)通过单碱基延伸反应机构对步骤(3)所得的产物进行单碱基延伸反应；优选地，在所述单碱基延伸反应后对产物进行树脂纯化；

[0036] (5)通过计算机检测和分析机构对步骤(4)所得产物进行检测和分析。

[0037] 本发明的第三方面提供了一种单核苷酸多态性rs976754的PCR引物和/或单碱基延伸引物，所述正向引物序列为SEQ ID No:1，所述反向引物序列为SEQ ID No:2。

[0038] 本发明的第四方面提供了一种检测他汀相关性肌病试剂盒，所述试剂盒中包括：单核苷酸多态性rs976754的多态性或基因型的物质；和

[0039] 基因分型试剂。

[0040] 根据本发明第四方面的试剂盒，其中，所述单核苷酸多态性rs976754的多态性或基因型的物质为第三方面所述的PCR引物和/或单碱基延伸引物。

[0041] 根据本发明第四方面的试剂盒，其中，所述基因分型试剂包括：dNTP Mix，HotStar Taq，iPLEX Termination mix，iPLEX Enzyme。

[0042] 本发明的第五方面提供了单核苷酸多态性rs976754的多态性或基因型的物质、第一方面的检测装置、第三方面的引物或第四方面的试剂盒在制备用于检测他汀相关性肌病或用于筛查他汀相关性肌病的产品中的应用。

[0043] 本发明的第五方面提供了单核苷酸多态性rs976754的多态性或基因型的物质、第一方面的检测装置、第三方面的引物或第四方面的试剂盒在制备用于他汀相关性肌病早期诊断的产品中的应用。

[0044] 同一种药物的药物毒性在不同人群存在个体差异，严重影响药物的治疗效果和原发病的预后。利用分子生物学方法筛选他汀相关性肌病差异SNP位点，可以有助于预测肌病发生风险，为预防他汀药物肌毒性的发生提供分子手段和理论基础，有利于个体化调整用药，提高患者生存质量，具有重要的经济价值和社会效益。

[0045] 他汀类降脂药物是目前中国人群中服用较为普遍的一种药物。他汀相关性肌病发生严重影响患者的生存质量。因此对他汀相关性肌病的高风险人群进行早期准确识别，并给予个体化用药治疗，对原发病的预后转归具有十分重要的意义。然而他汀相关性疾病的发生影响因素较多，准确地识别存在一定困难。遗传因素在肌病发生中发挥着重要的作用。有机阴离子转运多肽1B1(OATP1B1)为跨膜转运蛋白，主要分布于肝脏，是运输他汀类药物进入肝脏的主要运载蛋白，编码该蛋白的基因SLCO1B1多态性可能与他汀不良反应相关。

[0046] 因此为解决上述现实问题，本发明采用MALDI‑TOF MS对病例和对照样本进行了SLCO1B1的21个位点的分型检测，并发现rs976754在两组间分布具有差异性。此位点的基因型对识别肌病高风险人群，早期调整用药具有重要的指导意义。

[0047] 对于需要服用他汀类降脂药物的患者，早期进行肌病风险基因的筛选，预测肌病发生的风险，并给予个体化用药指导，对降低药物不良反应的发生，原发病的预后转归及提升患者生存质量具有重要的意义。

[0048] 本发明的检测装置可以具有但不限于以下有益效果：

[0049] 他汀类降脂药物是目前中国人群中服用较为普遍的一种药物。他汀相关性肌病发生严重影响患者的生存质量。因此对他汀相关性肌病的高风险人群进行早期准确识别，并给予个体化用药治疗，对原发病的预后转归具有十分重要的意义。然而他汀相关性疾病的发生影响因素较多，准确地识别存在一定困难。遗传因素在肌病发生中发挥着重要的作用。有机阴离子转运多肽1B1(OATP1B1)为跨膜转运蛋白，主要分布于肝脏，是运输他汀类药物进入肝脏的主要运载蛋白，编码该蛋白的基因SLCO1B1多态性可能与他汀不良反应相关。

[0050] 因此为解决上述现实问题，本发明采用MALDI‑TOF MS对病例和对照样本进行了SLCO1B1的21个位点的分型检测，并发现rs976754在两组间分布具有差异性。此位点的基因型对识别肌病高风险人群，早期调整用药具有重要的指导意义。对于需要服用他汀类降脂药物的患者，早期进行肌病风险基因的筛选，预测肌病发生的风险，并给予个体化用药指导，对降低药物不良反应的发生，原发病的预后转归及提升患者生存质量具有重要的意义。

附图说明

[0051] 以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

[0052] 图1示出了本发明Massarray SNP分型实验流程。

[0053] 图2示出了实施例1中获取基因序列的网站的NCBI网页。

[0054] 图3示出了实施例1中将SNP位点所在序列发送到My agena网站注册的邮箱中。

[0055] 图4示出了实施例1中将产生的结果复制在新的文本文件.txt中。

[0056] 图5示出了实施例1中引物设计过程。

[0057] 图6示出了实施例1中DNA质量检测结果。

[0058] 图7示出了实施例1中SNP分型检测散点图。

具体实施方式

[0059] 下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

[0060] 本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

[0061] 以下实施例中使用的试剂和仪器如下：

[0062] 试剂：

[0063] PBS，TE，SDS，蛋白酶K购自北京普利莱基因技术有限公司；

[0064] 饱和酚，氯仿，异戊醇，NaAC，乙醇均购自北京化学试剂公司；；

[0065] 树脂，PCR Buffer，MgCl2，dNTP Mix，HotStar Taq，SAP，iPLEX Buffer Plus，iPLEX Termination mix，iPLEX Enzyme均购自Agena公司；

[0066] DNA提取试剂盒，上样缓冲液购自BioTeKe公司；

[0067] 琼脂糖(含EB)凝胶购自BIOWEST公司；

[0068] PCR反应板，Dimple板购自Axygen公司；

[0069] EDTA抗凝采血管，购自BD公司。

[0070] 仪器：

[0071] PCR仪，购自美国ABI公司、型号ABI veriti‑384PCR仪；

[0072] 点样仪，购自MassARRAY Nanodispenser，型号RS1000。

[0073] 实施例1

[0074] 选取于首都医科大学附属北京天坛医院就诊的缺血性脑卒中患者。所有患者阿托伐他汀(立普妥)的给药方案为80mg/d；没有任何患者使用其它降脂药物及影响阿托伐他汀代谢的药物；无活动性肝肾疾病。无其他可引起CK升高的疾病，未服用可引起CK升高的药物。根据患者临床资料及随访结果，入组有肌病发生的病例组61例，同时年龄性别相匹配的无肌病发生的对照组110例。

[0075] 1.Massarray SNP分型实验流程

[0076] 如图1所示，Massarray SNP分型实验流程包括以下步骤：

[0077] (1)整理SNP序列信息成标准格式；(2)输入到软件进行SNP未点引物设计，确定目的位点；(3)合成引物；(4)样本检测定量；(5)PCR反应；(6)SAP纯化反应；(7)单碱基延伸反应；(8)树脂纯化；(9)上机检测；(10)收集数据。

[0078] 2.Massarray SNP分型实验操作步骤

[0079] 2.1引物设计及合成、稀释

[0080] 2.1.1基因序列的获取

[0081] (1)在My agena网站中注册成用户。

[0082] (2)在NCBI网页(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)中输[0083] 入该SNP位点的名称,按照dbSNP batch reportor格式显示，如图2所示。

[0084] (3)将SNP位点所在序列SEQ ID NO：3发送到My agena网站注册

[0085] 的邮箱中，如图3所示。

[0086] (4)在My agena网站的TOOLS工具栏中选择Genotyping。

[0087] (5)点击RS format，在Browse按钮中选择NCBI网站发送到邮箱的文件。

[0088] (6)网站对序列的格式化完成后在Sent to栏中，选择ProxSNP。

[0089] (7)开始ProxSNP，点击Begin Start。

[0090] (8)上述步骤完成后，在Sent to栏中选择PreXTEND。

[0091] (9)开始ProxSNP，点击Begin Start。

[0092] (10)在产生的结果中，选择OUTPUT，并把文件内容复制在新的文本文件.txt中，如图4所示。

[0093] 2.1.2结合文献并采用AssayDesigner3.1软件进行引物设计PCR反应和单碱基扩展引物，并交由由华大基因公司进行合成。

[0094] (1)在软件SNP Group栏中选择Browse按钮，找到上述产生的txt文件。

[0095] (2)在Aassy Design栏中选择SBE Mass Extend，并在SBE stop mix栏中选择iPlex，在Multiplex Level中选择45个反应重数，如图5所示。

[0096] (3)SNP capture，Extend primer design，MASS Mμltiplexing均选择默认参数。

[0097] (4)参数设定后，点击Run。

[0098] (5)在txt文件目录相应位置找到产生的引物序列文件。

[0099] 正向引物F序列为SEQ ID No:1；

[0100] 反向引物R序列为SEQ ID No:2。

[0101] (6)引物稀释

[0102] 1)PCR master mix引物配置：用纯水对引物进行稀释，使单管PCR master至浓度100μM，加入去离子水混合所有单管PCR master使最终反应PCR master mix浓度为0.5μM。

[0103] 2)EXTEND Mix引物配置：用纯水稀释单管延伸引物至终浓度500μM，加入引物混合后使得各引物浓度为8μM、10μM、15μM。按照DNA合成产品使用说明计算该条引物分子量、质量数和摩尔数，进而根据所需的浓度计算需加入去离子水的量。将混合好的单管延伸引物根据分子量大小，分别取(小于6300Da)1倍，(6300Da至7200Da)1.2倍，(大于7200Da)1.5倍体积量进行混合待用。

[0104] 2.2DNA提取及质量检测

[0105] 2.2.1DNA提取

[0106] 蛋白酶K‑酚氯仿抽提基因组DNA的方法来抽提血标本中的基因组DNA。详细步骤见下：

[0107] A.取200微升EDTA抗凝血液加入500微升PBS洗涤，2500g离心5min。

[0108] B.弃掉上清，向沉淀中加500微升PBS进行第二次洗涤，2500g离心5min。

[0109] C.弃掉上清，向沉淀中加500微升TE，25微升20％SDS和4微升10mg/ml的蛋白酶K。

[0110] D.55℃温育3小时，不定期地摇匀。

[0111] E.加入700微升Tris饱和酚，上下颠倒混匀10min，直至两相形成。

[0112] F.12000g高速离心10min，取上清液。

[0113] G.加700微升Tris饱和酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，上下颠倒混匀10min。

[0114] H.12000g高速离心15min，取上清液。

[0115] I.加700微升氯仿：异戊醇(24：1)，上下颠倒混匀10min。

[0116] J.12000g高速离心,15min，取上清液。

[0117] K.加入1/10体积的3M NaAC(PH4.8)和2.5倍体积0℃预冷无水乙醇。

[0118] L.12000g，4℃高速离心15min。

[0119] M.弃上清，加200微升预冷70％乙醇。

[0120] N.12000g，4"C高速离心15min。

[0121] O.去掉70％乙醇，室温风干。

[0122] P.加入20微升无菌去离子水，‑20℃保存备用。

[0123] 2.2.2DNA质量检测

[0124] 使用试剂盒(BioTeKe公司)提取血样中的DNA。使用NanoDrop2000仪器进行OD值检测。取5微升按照2.2.1方法提取的DNA样品和1微升上样缓冲液(6X)混匀，于0.8％的琼脂糖(含EB)凝胶上电泳，120V电压电泳30分钟左右，紫外灯下观察电泳结果DNA质量检测如图6所示，经分析DNA度达到实验要求，电泳结果显示所有样本均得到完整清晰的DNA条带，表明DNA无断裂或严重降解。所有DNA样本均‑20℃储存备用。

[0125] 2.3Agena MassArray系统基因分型步骤

[0126] 2.3.1分型原理：

[0127] 通过PCR反应扩增出含有待检SNP位点的目的片段，然后用SAP酶去除PCR体系中剩余的脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和引物,再加入单碱基延伸引物，其3’末端碱基紧挨SNP位点，且与目的片段上的碱基完全互补，采用四种ddNTP替代dNTP，这样，探针在SNP位点处仅延伸一个碱基，连接上的ddNTP与SNP位点的等位基因对应。用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI‑TOF MS)检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异,确定该点处碱基。

[0128] 2.3.2PCR扩增反应

[0129] (1)取1.5mlEP管中配置PCR master mix，并振荡低速离心。反应组分如表1所示。

[0130] 表1 PCR master mix反应相关试剂配制组分

[0131]

[0132]

[0133] (2)选用8道或12道移液器，在384孔板的每个加样孔中加入4μl PCR master mix，最后加入1μl模板DNA(20ng/μl)混匀，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象。1000rpm离心1minute。

[0134] (3)设置如表2所示的PCR扩增反应程序，将PCR反应板放置于PCR仪上，启动程序。

[0135] 表2 PCR扩增反应程序

[0136]

[0137] 2.3.3产物碱性磷酸酶处理

[0138] (1)在PCR反应结束后，将PCR产物用SAP(shrimp alkaline phosphatase，虾碱性磷酸酶)处理，以去除体系中游离的dNTPs。

[0139] (2)在新1.5mlEP管中配制碱性磷酸酶处理反应液，SAP Mix反应组分如表3所示：

[0140] 表3 SAP反应组分

[0141]SAP mix试剂 浓度 体积(1rxn)
纯水(HPLC grad) NA 1.53μl
SAP Buffer 10x 0.17μl
SAP Enzyme 1U/μl 0.30μl
总体积 ‑ 2.00μl

[0142] (3)将SAP mix加入384孔PCR反应板，对于每个碱性磷酸酶处理反应孔，反应总体积为7μl，其中PCR产物5μl，SAP mix 2μl。

[0143] (4)移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象，离心后进行如下反应程序。

[0144] (5)设置SAP反应程序：37℃20min；85℃5min；4℃∞。并将384孔反应板放置于PCR仪上，启动程序。

[0145] 2.3.4单碱基延伸反应

[0146] (1)在碱性磷酸酶处理结束后，进行单碱基延伸反应，反应体系总体积9μl。

[0147] (2)在新1.5mlEP管中配制单碱基延伸反应液，EXTEND Mix反应组分如表4所示。

[0148] 表4延伸反应组分

[0149]

[0150] (3)将EXTEND Mix对应加入384孔反应板。对于每个反应孔，单碱基延伸反应体系如表5所示。

[0151] 表5单碱基延伸反应体系

[0152]试剂 体积(μl)
EXTEND Mix 2
SAP+PCR反应 7
总体积[μl] 9

[0153] (4)移液完成后，小心盖上384孔封板膜，并压牢每个孔，防止PCR程序时出现蒸发等现象，离心后进行如下反应程序。

[0154] (5)设置延伸反应程序，如表6所示。

[0155] 表6单碱基延伸反应体系延伸反应程序

[0156]

[0157] 2.3.5树脂纯化

[0158] (1)在384/6MG Dimple板里均匀填充阴离子交换树脂并放置10分钟使其晾干。

[0159] (2)在384样本板的每个孔中加16μL水。

[0160] (3)将384样本板轻轻翻转过来扣在Dimple板上，然后轻敲使树脂落入样本板的每个孔中。

[0161] (4)将384样本板放置翻转离心机中室温旋转混匀30分钟。

[0162] 2.3.6芯片点样

[0163] 启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至384‑well SpectroCHIP bioarray上。

[0164] 2.3.7质谱检测及数据输出

[0165] 将点样后的SpectroCHIP芯片使用MALDI‑TOF质谱仪分析，检测结果使用TYPER4.0软件获取原始数据及基因分型图，检查数据文件的完整性和正确性，将结果保存入相应存储媒介。

[0166] 2.3.8统计学分析

[0167] 对于符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示其平均水平，不符合正态分布则用中位数(四分位数间距)来表示其平均水平；计数资料用频数和构成比来表示。计量资料如果符合正态分布，两组间差异比较采用t检验，如不符合正态分布，采用秩和检验；计数资料比较用卡方检验。采用卡方检验分析SNP位点基因频率分布是否符合Hardy‑Weinberg遗传平衡定律，P≥0.01认为样本来自遗传平衡的群体，具有较好的代表性。基因型/等位基2
因频率分布在病例组及对照组间的比较采用Pearson'sχ检验，并采用Logistic回归模型分析不同位点基因多态性与他汀相关性肌病发生的关联，计算比值比(odds ratio，OR)及
95％可信区间(confidence interval，CI)。所有统计学分析用P‑link和SPSS17.0软件进行分析，P＜0.05表示差异有显著性。

[0168] 3、SNP分型检测散点图：

[0169] 聚类图也称散点图：是根据DNA产物峰面积大小计算得到SNP位点所有分型点状图。正常聚类图中2个纯合子分型根据产物峰高分别在靠近横、纵轴聚类，在二者之间单独聚类的一组为杂合子。从图7可见本次分型成功，结果可信。

[0170] 通过统计分析发现1个SNP位点(rs976754)在他汀相关性肌病患者血液中呈差异化表达。(本发明中给出的rs976754的等位基因A和G，在Pubmed数据库中给出的rs976754的等位基因为其互补链上的等位基因T和C)。他汀相关性肌病患者rs976754具有较低的G等位基因频率。rs976754在本研究中的MAF为0.338，HWE检验(Hardy‑Weinberg)为0.251(P>0.05)。结果显示样本具有较好的群体代表性。

[0171] 通过卡方检验对rs976754的不同基因型进行统计分析，本发明人发现rs976754位点对照组和病例组之间等位基因(p＝0.04237)，三种基因型GG/AG/AA(P＝0.04632),差异具有统计学意义，如表7所示。

[0172] 表7对照组和病例组rs976754基因型/等位基因分布及统计学分析

[0173]

[0174] 尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。