一种基因重组工程菌及其在催化合成D-泛酰内酯中的应用

摘要

本发明公开了一种基因重组工程菌及其在催化合成D‑泛解酸内酯中的应用，属于生物催化研究领域。所述基因重组工程菌，以大肠杆菌为宿主菌，所述宿主菌内含有包含了共轭聚酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的重组表达质粒，所述共轭聚酮还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该工程菌经诱导同时表达聚酮还原酶和葡萄糖脱氢酶，将其应用于不对称催化合成D‑泛解酸内酯，通过上述双酶的协同作用，实现辅酶NADPH的原位再生，可达到从酮基泛解酸内酯到D‑泛解酸内酯高效生产的目的。该方法简化了生产工艺，同时避免了额外辅酶的添加，降低了生产成本。

权利要求

1.一种基因重组工程菌在不对称催化合成D-泛酰内酯中的应用，其特征在于，所述基因重组工程菌以大肠杆菌为宿主菌，所述宿主菌内含有包含了共轭聚酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的重组表达质粒，所述共轭聚酮还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述葡萄糖脱氢酶基因如SEQ ID NO.2所示；所述重组表达质粒的原始载体为双表达质粒载体pACYCDuet-1；所述共轭聚酮还原酶基因位于双表达质粒载体pACYCDuet-1中酶切位点BamH I和Hind III之间，葡萄糖脱氢酶基因位于pACYCDuet-1中Nde I和Xho I之间；

所述应用包括：以所述基因重组工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以酮泛解酸内酯为底物，以pH为5.0 8.0的磷酸缓冲液为反应介质，反应体系中添加葡萄糖，在25 40~ ~℃，100 300 rpm条件下进行反应，获得所述D-泛酰内酯；

~

反应体系中催化剂的用量以湿菌体重量计为80 120 g/L，底物酮泛解酸内酯以0.55~ ~

0.75mmol/h的流速持续加入至反应体系中，葡萄糖与酮泛解酸内酯的摩尔比≥1.25:1。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因重组工程菌发酵培养的方法包括：将所述基因重组工程菌接种于含抗生素的LB培养基中，培养至OD600值达到0.6~0.8，加入

0.1 0.5 mM异丙基硫代半乳糖苷，于18℃，200 rpm条件下继续培养10 12 h，离心，收集菌~ ~体获得所述湿菌体。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，反应介质的pH值为6.5，催化反应条件为35℃，200rpm。

说明书

一种基因重组工程菌及其在催化合成D-泛酰内酯中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物催化研究领域，具体涉及一种基因工程菌及利用该工程菌不对称催化合成D-泛解酸内酯的方法。

背景技术

[0002] 泛酸又称维生素B5，是水溶性维生素B族的一种，广泛存在于自然界动、植物食物中，人体肠内有益菌也可以自行合成。泛酸在体内主要以辅酶A(Coenzyme A)形式参与糖、脂、蛋白质代谢，是大脑和神经必需的营养物质。另外，泛酸具有抗脂质过氧化作用。自然界的泛酸存在D-和L-两种构型，但仅D-型具有生理活性。由于D-泛酸的稳定性较差，通常以D-泛酸钙为其商品形式，广泛应用于医药、食品、饲料和日化等领域。随着人们生活质量的提升，D-泛酸和D-泛酸钙的需求量将进一步增加。D-泛酸钙的逆合成反应式为：

[0003]

[0004] D-泛酰内酯(D-PL)是合成D-泛酸钙的关键手性中间体。目前，工业生产D-泛酰内酯主要采用酶法水解动力学拆分法(如ZL 200510123566.4；ZL201610361405.7等)。首先，通过异丁醛和甲醛的羟醛缩合反应，在酸性条件下与氰化氢加成，进一步酯化合成外消旋的DL-泛酰内酯。DL-泛酰内酯再通过水解酶选择性催化，获得高光学纯度的D-泛酰内酯。该方法的主要缺点体现在高毒性化合物氰化氢，以及大量强酸强碱的使用，不符合绿色化工发展的要求。

[0005] 氧化还原酶不对称还原前手性羰基化合物合成手性醇被认为是最高效的方法。共轭聚酮还原酶(Conjugated polyketone reductases,CPRs)不对称催化酮泛解酸内酯，即二氢-4,4-二甲基-2,3-呋喃二酮(KPL)合成D-泛酰内酯，与水解酶拆分工艺比较优势体现在：(1)CPRs具有很高的催化立体选择性，保证产物具有高对映体光学纯度，对映体过量值(enantiomeric excess,e.e.)＞99.9％；(2)以异丁醛和草酸二乙酯等为合成原料，避免传统工艺中剧毒化合物氢氰酸，以及强酸强碱的大量使用。然而，共轭聚酮还原酶基因资源相对匮乏，目前仅有来源于Candida parapsilosis  IFO  0708的CPR-C1和CPR-2(Appl.Microbiol.Biotechnol.2004,64:359-366)，来源于Candida orthopsilosis的CorCPR(J.Biotechnol.2019,291:26-34)和来源于Candida dubliniensis的CduCPR(Enzyme Microb.Tech.2019,126:77-85)等基因报道。而且，CPR-C1和CPR-C2等基因在大肠杆菌中表达水平较低，直接导致重组细胞的催化效率较低。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种基因重组工程菌，同时表达共轭聚酮还原酶和葡萄糖脱氢酶，将其应用于催化酮泛解酸内酯(KPL)不对称还原生产D-泛酰内酯。

[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0008] 一种基因重组工程菌，以大肠杆菌为宿主菌，所述宿主菌内含有包含了共轭聚酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因的重组表达质粒，所述共轭聚酮还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0009] 本发明基于已报道共轭聚酮还原酶的序列特征，采用基因探矿策略从GenBank数据库中筛选来源于Candida albicans的共轭聚酮还原酶基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并构建重组表达质粒。研究表达，该基因可在大肠杆菌中高效表达，具有催化合成D-泛酰内酯的活力和选择性。同时，本发明克隆葡萄糖脱氢酶基因到重组表达质粒中，实现辅酶NADPH的原位再生。

[0010] 具体步骤为：通过基因克隆，分别获得共轭聚酮还原酶基因序列和葡萄糖脱氢酶基因序列，将两段序列连接到双表达质粒载体上，获得重组表达质粒。将重组表达质粒转化到宿主细胞大肠杆菌中，获得基因重组工程菌。

[0011] 所述基因重组工程菌经诱导同时表达共轭聚酮还原酶和葡萄糖脱氢酶，应用于催化酮泛解酸内酯的不对称还原，合成光学纯D-泛酰内酯，其反应式为：

[0012]

[0013] 如上述反应式，在反应过程中，共轭聚酮还原酶在不对称催化底物酮泛解酸内酯连续生成D-泛酰内酯，需要消耗化学等量的还原性酶酶II，NADPH。同时表达重组葡萄糖脱氢酶，以葡萄糖为底物，实现辅酶NADPH的再生。

[0014] 作为优选，所述葡萄糖脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述葡萄糖脱氢酶基因来源于Bacillus subtilis 168菌，但不局限于该菌。

[0015] 作为优选，所述重组表达质粒的原始载体为双表达质粒载体pACYCDuet-1。

[0016] 具体地，所述共轭聚酮还原酶基因位于双表达质粒载体pACYCDuet-1中酶切位点BamH I和Hind III之间，葡萄糖脱氢酶基因位于pACYCDuet-1中Nde I和Xho I之间。

[0017] 作为优选，所述宿主菌为大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

[0018] 本发明提供了所述的基因重组工程菌在不对称催化合成D-泛酰内酯中的应用。

[0019] 所述应用，包括以下步骤：以所述基因重组工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以酮泛解酸内酯为底物，以pH为5.0～8.0的磷酸缓冲液为反应介质，反应体系中添加葡萄糖，在25～40℃，100～300rpm条件下进行反应，获得所述D-泛酰内酯。

[0020] 所述基因重组工程菌发酵培养的方法包括：将所述基因重组工程菌接种于含抗生素的LB培养基中，35～40℃，转速为180～220rpm条件下培养至OD600值达到0.6～0.8，加入0.1～0.5mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，于18℃，200rpm条件下继续培养10～12h，离心，收集菌体获得所述湿菌体。

[0021] 用磷酸盐缓冲液重悬基因工程菌细胞，获得静息细胞悬液；往静息细胞悬液中添加酮基泛解酸内酯、葡萄糖进行反应，反应完成后，从反应液中分离纯化得到D-泛解酸内酯。

[0022] 作为优选，反应体系中催化剂的用量以湿菌体重量计为80～120g/L，底物酮泛解酸内酯以0.55～0.75mmol/h的流速持续加入至反应体系中，葡萄糖与酮泛解酸内酯的摩尔比≥1.25:1。

[0023] 催化反应过程中，持续流加底物KPL，使其在反应体系中不积累，迅速被催化剂转化形成产物，降低底物KPL的自发水解，有利于D-泛酰内酯的不对称合成。

[0024] 适宜的反应温度和反应溶液pH值有利于反应的进行，所述反应的温度为25～35℃，pH为6.5～8.0。若温度过高、pH值偏酸或偏碱容易造成反应过程中酶类的失活。更为优选，反应温度为35℃，pH为6.5，此反应条件下酶类催化效果最佳，D-泛解酸内酯的产率最高。

[0025] 基因工程菌细胞内辅酶可以自给自足，反应体系中不需要加入NADP+。

[0026] 本发明具备的有益效果：

[0027] 本发明将共轭聚酮还原酶基因和葡萄糖脱氢酶基因依次插入到表达载体中，构建重组表达质粒；再将其导入宿主细胞构建基因工程菌，可实现聚酮还原酶和葡萄糖脱氢酶的高效共表达。通过上述双酶的协同作用，实现辅酶NADPH的原位再生，可达到从酮基泛解酸内酯到D-泛解酸内酯高效生产的目的，目标产物的光学选择性(e.e.值)>99％，转化率大于95％，时空产率达到157g·L-1·d-1。该基因工程菌表现出良好的催化稳定性、高催化活力等优点，有望成为生物法制备D-泛酰内酯的良好工业催化剂，并促进其合成工艺的升级。

[0028] 利用该工程菌用于催化合成高光学纯D-泛酰内酯，与传统工艺比较避免了高毒试剂氢氰酸的使用，简化了生产工艺，同时避免了额外辅酶的添加，降低了生产成本。

附图说明

[0029] 图1为共轭聚酮还原酶基因CPR的核酸电泳图，其中M：核酸Marker；1：基因CPR样品。

[0030] 图2为基因工程菌E.coli LP01诱导表达蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中M：蛋白质Marker；1：pACYCDuet-1空质粒对照；2：基因工程菌E.coli LP01诱导菌体破胞上清；3：基因工程菌E.coli LP01诱导菌体破胞沉淀；4：CPR酶在载体pACYCDuet-1载体上表达的样品对照；5：GDH酶在载体pACYCDuet-1载体上表达的样品对照。

[0031] 图3为反应温度对基因工程菌催化制备D-PL的影响。

[0032] 图4为反应pH对基因工程菌催化制备D-PL的影响。

[0033] 图5为葡萄糖与KPL摩尔比对基因工程菌催化制备D-PL的影响。

[0034] 图6为辅酶添加量对基因工程菌催化制备D-PL的影响。

[0035] 图7为基因工程菌连续补料策略制备D-PL的催化反应进程。

[0036] 图8为底物酮基泛解酸内酯(KPL)的气相分析标准图谱。

[0037] 图9为DL-泛酰内酯(DL-PL)的气相分析标准图谱。

[0038] 图10为基因工程菌E.coli PL01催化合成的D-PLDE气相分析图谱。

[0039] 图11为合成产物D-PL的1H NMR谱图。

[0040] 图12为合成产物D-PL的13C NMR谱图。

具体实施方式

[0041] 下面结合具体实施例对本发明进一步描述，但所给出的实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，本发明的保护范围并不仅限于此。

[0042] 实施例1重组表达质粒pACYC-CPR-GDH的构建

[0043] 采用引物F_GDH/R_GDH克隆来自Bacillus subtilis 168菌的葡萄糖脱氢酶GDH基因。引物F_GDH和R_GDH的核酸序列分别为：

[0044] 5’-GGAATTCCATATGTACCCGGACCTGAAAGG-3’；

[0045] 5’-CCGCTCGAGTTAACCACGACCAGCCTGGA-3’。

[0046] 采用Nde I和Xho I双酶切GDH基因，回收酶切后的基因片段；同时采用Nde I和Xho I双酶切表达质粒pACYCDuet-1，回收酶切后的质粒片段。采用T4连接酶进行连接，连接后产物转化克隆宿主E.coli DH5α。用含氯霉素抗性的LB固体平板筛选，挑选阳性转化子，测序结果表明基因序列无误后的重组质粒，即为重组表达质粒pACYC-GDH，于-20℃保存备用。

[0047] 采用F_CPR/R_CPR克隆来源于Candida albicans的共轭聚酮还原酶基因，如图1所示。引物F_CPR和R_CPR的序列分别为：

[0048] 5’-CGGGATCCATGACAAGTCATACACATCCAGTTAAA-3’；

[0049] 5’-CCCAAGCTTTAAATCTTTAAAGGCTTCATGAAAAAA-3’。

[0050] 采用BamH I和Hind III双酶切共轭聚酮还原酶CPR基因，回收酶切后的基因片段；同时采用BamH I和Hind III双酶切重组质粒pACYC-GDH，回收酶切后的重组质粒片段。采用T4连接酶进行连接，酶连产物转化克隆宿主E.coli DH5α。用含氯霉素抗性的LB固体平板筛选，挑选阳性转化子，测序结果表明基因序列无误后的重组质粒，即为重组质粒pACYC-CPR-GDH，于-20℃冰箱中保存备用。

[0051] 实施例2基因工程菌E.coli PL01的构建和催化剂制备

[0052] 将实施例1中构建的重组表达质粒pACYC-CPR-GDH转化表达宿主E.coli BL21(DE3)，即得基因工程菌E.coli PL01。将E.coli PL01接种于10mL试管装液体LB培养基(38μg/mL氯霉素)中，在37℃，200rpm条件下振荡培养12～16h。将该培养液按1～5％的接种量接种于250mL三角锥形瓶装的液体50mL LB培养基(38μg/mL氯霉素)中，于37℃，200rpm条件下振荡培养2～3h，当菌种密度OD600值达到0.6～0.8时，加入0.1～0.5mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，于18℃，200rpm条件下继续培养12h。

[0053] 在5000～10000×g条件下离心5～10min收集细胞，即作为用于不对称合成D-泛酰内酯的催化剂。在冰浴中，采用超声破碎细胞，在12000～15000×g条件下离心20～40min，分别收细胞破碎上清液和破碎沉淀，采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测，SDS-PAGE电泳图如图2所示。

[0054] 实施例3基因工程菌E.coli PL01催化合成D-泛酰内酯反应条件的优化[0055] 在5mL 0.1M磷酸钾缓冲液(pH 6.5)反应体系中，含有0.5g基因工程菌E.coli PL01静息细胞，100mM KPL，125mM葡萄糖在35℃和200rpm下进行反应20min。

[0056] E.coli PL01催化合成D-PL的最适pH值为6.5(图3)，最适反应温度为35℃(图4)，反应液中添加葡萄糖和底物KPL的摩尔比为1.25:1(图5)，基因工程菌细胞内辅酶可以自给自足，反应体系中不需要加入NADP+(图6)。

[0057] 实施例4基因工程菌E.coli PL01催化D-泛酰内酯的合成

[0058] 收集及基因工程菌E.coli PL01发酵液，8000～12000rpm，4～20℃，离心5～10min获取菌体，弃尽上清，用H2O清洗两次，再磷酸盐缓冲液(0.2M·L-1,pH 6.5)重悬菌体，即得基因工程菌E.coli PL01静息细胞菌悬液。

[0059] 在5mL 0.1M磷酸钾缓冲液(pH 6.5)反应体系中，含有0.5g基因工程菌E.coli PL01细胞，1.13g葡萄糖在35℃和200rpm下进行反应。通过将0.640g底物KPL分五次溶解在5mL 0.1M磷酸氢二钾-柠檬酸(pH 2.5)中来制备底物储备溶液，每次底物KPL的浓度为1M。
通过注射泵缓慢流加储液，流速为0.67mL/h。每次待前1mL底物储备溶液流加完后，再进行下一次的底物储备溶液的配置。反应过程中，通过用1M Na2CO3将反应pH值维持在pH 6.5。反应在35℃和200rpm下进行，在流加结束0.5h后终止反应。

[0060] 反应过程中，每隔1小时，从中取出四个等分试样(各100μL)。其中两个样品经内酯化(通过将反应混合物与等体积的1M HCl混合进行内酯化，并将所得溶液煮沸10分钟)后通过GC分析底物的水解情况，另外两个样品直接分析。

[0061] 反应产物D-泛酰内酯的产率和光学纯度分析：

[0062] 反应产物D-泛解酸内酯的e.e.值是通过使用装备有RT-β右旋柱(内径30m，0.25mm)的安捷伦7890A气相色谱仪进行分析。分析条件：色谱柱：RT-β右旋柱(内径30m，
0.25mm)；气相条件：气化温度设为230℃；检测器温度设为250℃；柱温箱采用程序升温程序，起始温度设为60℃，10℃/min加热至150℃，保持5min；使用氮气为载气，流量为恒流
2.0mL/min。产率和e.e.值得计算公式：

[0063] 产物产率(％)＝产物浓度/理论产物最大浓度×100％；

[0064] D-泛解酸内酯的e.e.值(％)＝[(AR-AS)/(AR+AS)]×100％。

[0065] 结果如图7所示，8小时后，反应总体积为12.5mL，D-泛酰内酯的浓度为379mM，对映体过量值＞99％。同时产物的转化率为95％，时空产率达到157g·L-1·d-1。

[0066] 此外，在催化过程中没有检查到KPL表明所建立的过程是高效的并且底物连续进料策略显著减轻了自发水解对D-泛酰内酯的不对称合成的影响。

[0067] 最后，经过萃取，蒸发和干燥后，以68％的分离产率获得白色固体D-泛酰内酯。

[0068] 底物KPL、DL-PL和催化反应产物的气相图谱如图8～10所示，其对映体过量值(e.e.)＞99％。催化产物的1H NMR谱图和13C NMR谱图如图11和12所示，进一步证明催化所得产物为高光学纯的D-泛酰内酯。