一种提高根瘤菌USDA110竞争结瘤能力的方法

摘要

本发明公开了一种提高根瘤菌USDA110竞争结瘤能力的方法，通过pK19mob构建dgoK1单插入突变菌株USDA110(dgoKmut)，在土壤盆栽条件下，与接种USDA110的植物相比，接种USDA110(dgoKmut)使植物鲜重、瘤数、瘤重和酶活都有显著性增加，与土著性根瘤菌相比，USDA110(dgoKmut)的竞争结瘤能力提高24.5％，可达31.8％。因此USDA110(dgoKmut)具有良好的共生固氮和竞争结瘤能力，可作为有潜力的优良菌株应用到田间试验。

权利要求

1.一种大豆根瘤菌USDA110突变体，其特征在于，通过将pK19mob质粒插入根瘤菌USDA110的dgoK1基因序列中，得到根瘤菌USDA110的突变体。

2.权利要求1所述大豆根瘤菌USDA110突变体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)根据dgoK1基因序列，设计上下游引物，PCR扩增获得目的片段；

2)将目的片段与载体pMD19-T连接，测序；

3)将测序正确的菌抽质粒进行酶切回收，连接到pK19mob上；

4)将插入失活质粒转化到E.coliDH5α中，抽质粒，转化到E.coli S17-1，通过两亲本接合转移导入野生型菌USDA110中。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述的上下游引物具体为：F:CGGGATCC CCGCCTTGAAGCTTGCAA；

R:GGAATTCCAGGTCCTGGCCGAACG。

说明书

一种提高根瘤菌USDA110竞争结瘤能力的方法

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种提高根瘤菌USDA110竞争结瘤能力的方法。

背景技术

[0002] 中国占世界耕地面积的8％-10％，但化肥的使用量却占世界的35％。过量的化肥使用不仅增加了农民的经济负担，而且严重破坏了自然环境。我国主要粮食作物的化肥利用率只有20％-35％，而发达国家却有40％-50％。同时，我国每年向自然环境排放2000多万吨氮肥和1000多万吨磷肥。过量使用氮肥已经造成了地表和地下水污染和土壤酸化，我们必须重视化肥过度使用造成的环境污染，采取措施以降低污染。通过豆科植物与根瘤菌固氮的方式，每年可提供3500万吨氮，不仅能提高作物产量，还能减少化学氮肥的使用，从而减少环境污染，缓解土壤硬化。尤其在干旱地区，豆科植物是改善土壤理化性质的重要植物。因此，接种根瘤菌剂对提高大豆产量和减少环境污染具有重要作用。

[0003] 美国、巴西和阿根廷等国家，根瘤菌剂的使用面积达35％-100％，而我国根瘤菌剂的使用面积还不到5％，这些数据表明，我国大豆产量和根瘤菌剂的施用量都远远落后于国外。其中很重要的一个原因是我国是大豆起源国，土壤中存在着许多土著根瘤菌，土壤中的土著根瘤菌竞争能力强但固氮能力弱，这降低了接种根瘤菌的占瘤率，从而使接种菌达不到预期效果。本发明通过基因工程手段构建竞争结瘤能力强的根瘤菌株以提高根瘤菌接种剂的接种效果。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提高USDA110的竞争结瘤能力，通过本方法改造的根瘤菌株具有良好的固氮能力。

[0005] 为了实现本发明的技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

[0006] 一种提高根瘤菌USDA110竞争结瘤能力的方法，通过将pK19mob质粒插入根瘤菌USDA110的dgoK1基因序列中，得到根瘤菌USDA110的突变体。

[0007] 具体本发明包括以下步骤：

[0008] 1)根据dgoK1基因序列，设计上下游引物，PCR扩增获得目的片段；

[0009] 2)将目的片段与载体pMD19-T连接，测序；

[0010] 3)将测序正确的克隆抽质粒进行酶切回收，连接到pK19mob上；

[0011] 4)将插入失活质粒转化E.coli DH5α，抽质粒，进一步转化到E.coli S17-1中，通过两亲本接合转移导入野生菌株USDA110中。

[0012] 进一步的，所述的上下游引物具体为：

[0013] F:CGGGATCC CCGCCTTGAAGCTTGCAA；

[0014] R:GGAATTCCAGGTCCTGGCCGAACG。

[0015] 本发明的有益效果为：

[0016] 1)USDA110为优良的大豆根瘤菌，但遗传操作难，本发明通过快速突变的方法对其改造，从而获得优良菌株；

[0017] 2)能够显著提高根瘤菌的固氮能力和竞争结瘤能力，具有应用前景。

[0018] 3)在土壤盆栽条件下，接种本发明突变后的根瘤菌使植物鲜重、瘤数、瘤重和酶活都有显著性增加，与土著性根瘤菌相比，竞争结瘤能力提高24.8％，可达31.8％。因此突变后的根瘤菌具有良好的共生固氮和竞争结瘤能力，可作为有潜力的优良菌株应用到田间试验。

附图说明

[0019] 图1是dgoK1插入失活突变菌株PCR验证；其中，1，2为目的条带，3为野生型菌株阴性对照，M为marker DL2000；

[0020] 图2是USDA110(dgoKmut)蛭石盆栽实验大豆地上、地下整体长势；

[0021] 图3是蛭石条件下USDA110(dgoKmut)接种植物地上部分鲜重、瘤数、瘤重和酶活测定；

[0022] 图4是USDA110(dgoKmut)土壤盆栽实验大豆地上、地下整体长势；

[0023] 图5是土壤条件下USDA110(dgoKmut)接种植物地上部分鲜重、瘤数、瘤重和酶活测定；

[0024] 图6是蛭石条件下USDA110(dgoKmut)与USDA110(mcherry)混合接种植物根瘤荧光显微镜观察；

[0025] 图7是USDA110(mcherry)接种植物根瘤荧光显微镜观察；1，2，3表示取自3株植物的根瘤；

[0026] 图8是PCR验证USDA110(dgoKmut)根瘤，1，2，3表示取自3株植物的根瘤，23为野生型阴性对照，24为USDA110(dgoKmut)DNA阳性对照，M为marker DL2000。

具体实施方式

[0027] 下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

[0028] 本发明实施例所用试剂如下：

[0029] Extaq DNA聚合酶、限制性内切酶、T4-DNA连接酶购买于Fermentas公司和TaKaRa公司，PCR反应相关试剂和琼脂糖凝胶电泳Marker购买于东盛公司，PCR产物凝胶回收试剂盒购买于上海华舜(Watson)公司，抗生素及培养基相关组分等常规分子试剂购买于中国国药集团。本研究所用PCR引物由武汉天一辉远生物科技有限公司合成，DNA测序工作由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

[0030] 实施例1突变体菌株构建

[0031] 根据野生型菌株Bradyrhizobium japonicum USDA110基因组，在NCBI中找到dgoK1基因序列，选取靠近5’端大约500bp的序列，设计上下游引物，添加合适的酶切位点，通过PCR获得目的片段，经过回收，将目的片段与T载体(pMD19-T)进行连接，送公司进行测序。

[0032] 引物信息：

[0033] F:CGGGATCC CCGCCTTGAAGCTTGCAA BamH1

[0034] R:GGAATTCCAGGTCCTGGCCGAACG EcoR1

[0035] 构建pK19mob插入失活质粒。将测序正确的菌抽质粒进行酶切回收，连接到pK19mob上。将插入失活质粒转化到E.coli DH5α中，抽质粒，转化到E.coli S17-1，通过两亲本接合转移导入野生型菌USDA110中。

[0036] 转化子筛选。将USDA110混合菌液涂于AMS+Kan上，28℃培养7d后进行PCR验证。pK19mob-dgoK1插入染色体后，用载体上引物M13R，与基因组上引物dgoK1-map-R进行验证，目的片段大约904bp，回收送公司测序。

[0037] 结果如图1所示，扩增到目的片段904bp，野生型USDA110为模板PCR验证无条带，即证明筛选到USDA110dgoK1插入失活突变菌株。

[0038] 实施例2盆栽实验检测共生固氮性状

[0039] (1)种子处理：用灭菌蛭石栽培大豆时，种子用75％乙醇消毒30s，倒去乙醇，再用5％NaClO消毒3min，无菌水洗10次，铺在1-2％的水琼脂平板上，28度黑暗培养2d；以土壤为基质种植时，种子不灭菌，用水泡1h后，种于土壤。

[0040] (2)栽培：大豆用蛭石种植，将干净蛭石灭菌1h，大盆和盘子经紫外灭菌，装入蛭石，每个盘子放6个盆子，每盘种3颗大豆，将无氮营养液浇于盘子中。如用土种植大豆，土样不灭菌，直接种植。

[0041] (3)根瘤菌接种：在大豆发芽，长出第一片真叶后，接种根瘤菌。USDA110在YMA平板上进行活化，转接到YMA液体培养基中，28度震荡培养6d。收菌，无菌水洗2次，OD600值调到0.5，每株植物接1mL菌悬液。

[0042] (4)各项共生固氮性状的检测：紫云英和大豆在接菌后28d收获，观察植物长势，拍照。测定植物鲜重，统计瘤数，根瘤鲜重和固氮酶活。固氮酶活采用乙炔还原法测定。

[0043] 在蛭石条件下USDA110(dgoKmut)的共生表型测定结果，如图2所示，接种USDA110(dgoKmut)的植物与接种UADA110的植物，长势无差异，说明在蛭石中USDA110dgoK1基因突变不会影响植物地上生物量。从图3可以看出，与接种USDA110的植物相比，接种USDA110(dgoKmut)使植物鲜重，瘤重和酶活有增加，但无显著性差异，瘤数有所降低，但无显著性差异(p<0.05)。

[0044] 在土壤条件下USDA110(dgoKmut)的共生表型测定结果，如图4所示，在实验室土壤条件下，接种USDA110(dgoKmut)的植物比接USDA110(mcherry)的植物长得更粗壮，根系也较大，说明USDA110dgoK1基因突变可能会影响植物地上生物量。从图5可以看出，与接种USDA110(mcherry)的植物相比，接种USDA110(dgoKmut)使植物鲜重、瘤数、瘤重和酶活都有显著性增加(p<0.05)。说明在土壤条件下，USDA110dgoK1基因突变可使植物地上生物量、瘤数、瘤重和酶活都显著性增加。

[0045] 实施例3盆栽实验检测竞争结瘤能力

[0046] 1)无菌蛭石中竞争结瘤能力检测

[0047] ①无菌蛭石中种植威廉姆斯82，种子处理与栽培方法与2相同。

[0048] ②根瘤菌接种：接菌前所有菌OD600调到0.5，USDA110(dgoK mut)与USDA110(mcherry)，分别进行1:1、10:1、1:10比例混合，混合均匀后给植物接菌，每株接2mL。

[0049] ③竞争结瘤检测：收取植物，摘掉根瘤，荧光显微镜观察，进行拍照，统计不发光的根瘤，即为重组菌占瘤率。

[0050] 结果如图6所示，1:1混合接种时，USDA110(dgoKmut)占瘤率为84％大于50％，1:10混合接种时，USDA110(dgoKmut)占瘤率为81％大于10％，10:1混合接种时，USDA110(dgoKmut)占瘤率为99％大于90％。综上可知，USDA110(dgoKmut)有很强的占瘤率，可进一步做土壤盆栽实验进行验证。

[0051] 2)土壤中竞争结瘤能力检测

[0052] ①在土壤中种植威廉姆斯82，种子处理与栽培方法与2相同。

[0053] ②根瘤菌接种：接菌前所有菌OD600调到1.2，USDA110(dgoKmut)与USDA110(mcherry)分别接种植物，每株接1mL。

[0054] ③竞争结瘤检测：28d收获植物，摘掉根瘤，接USDA110(dgoKmut)的植物，每株随机取22个根瘤，直接提取根瘤菌DNA，作为PCR模板，引物用M13R和dgoK1-map-R，大小为924bp，通过目的基因扩增，扩出来条带数除以验证总数，可知USDA110(dgoKmut)在土壤中的占瘤率。随机取3株USDA110(mcherry)根瘤，对每株根瘤进行荧光显微镜观察，可知其占瘤率，即野生型根瘤菌的占瘤率。

[0055] 结果如图7和图8所示。由图7统计出1，2，3中发光根瘤即目标根瘤USDA110(mcherry)与总瘤数的比率分别是6/46、1/27和1/19，可计算出USDA110(mcherry)平均占瘤率为7.3％，即野生型USDA110在土壤中的占瘤率为7.3％。

[0056] 由图8统计出1，2，3中目的条带USDA110(dgoKmut)与验证总数的比率分别是7/22、6/22和8/22，可计算出USDA110(dgoKmut)平均占瘤率为31.8％，比USDA110占瘤率提高
24.5％。因此本发明所构建的根瘤菌USDA110(dgoKmut)具有良好的共生固氮和竞争结瘤能力，可作为有潜力的优良菌株应用到田间试验。

[0057] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。