一种获取神经元的方法

摘要

本发明提供了一种获取神经元的方法，属于生物医药技术领域，包括以下步骤：1)将神经核团与木瓜蛋白酶混合，将得到的混合物进行酶解、吹打，得到滤液；所述混合物中木瓜蛋白酶的酶活力单位为18～22U/ml；2)将所述步骤1)得到的滤液与红细胞裂解液混合后进行裂解，得到裂解物；3)将所述步骤2)得到的裂解物离心后，得到的沉淀为神经元。神经核团经木瓜蛋白酶酶解释放出神经元，得到的滤液中除含有神经元外还含有红细胞，红细胞裂解液将红细胞裂解后，再经过离心，将细胞碎片除去，得到神经元。神经元的胞体直径平均为10μm，活性高、聚团率低，适用于10×单细胞测序。

权利要求

1.一种获取神经元的方法，其特征在于，步骤如下：

1)将神经核团与木瓜蛋白酶混合，将得到的混合物进行酶解、吹打、过滤，得到滤液；所述混合物中木瓜蛋白酶的酶活力单位为18～22U/ml；

2)将所述步骤1)得到的滤液与红细胞裂解液混合后进行裂解，得到裂解物；

3)将所述步骤2)得到的裂解物离心后，得到的沉淀为神经元；

神经核团与木瓜蛋白酶混合时，还与L-半胱氨酸、Na2EDTA、DNase-I混合后，得到混合物；所述混合物中L-半胱氨酸的浓度为0.8～1.2M，所述混合物中Na2EDTA的浓度为0.4～

0.6mM，所述混合物中DNase-I的酶活力单位为90～110U/ml；

将所述裂解物置于离心液的上方后进行离心，所述离心的温度时间为4～6min，所述离心的离心力为280～320g；

所述离心液的组分包括：8～12mg/ML卵黏蛋白抑制剂和8～12mg/ML牛血清白蛋白；

所述红细胞裂解液的组分包括：0.1～0.2M NH4CL、8～12mM KHCO3、0.05～0.15Mm Na2EDTA、0.03～0.08mM DL-AP5和0.03～0.08mM犬尿氨酸；

所述滤液与红细胞裂解液的体积比为0.5～1.5:2.5～3.5；

所述步骤2)裂解的时间为8～12min；

所述步骤1)酶解的条件包括：所述酶解的温度为35～42℃，所述酶解的时间为50～

70min，所述酶解在振荡下进行，所述振荡的转速为90～110rpm；

将得到的神经元置于细胞维持液中维持，所述细胞维持液的组分包括：1X EBSS、0.04～0.06mM DL-AP5、0.04～0.06mM KA和140～160mM海藻糖。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)吹打使用的工具为过火抛光的玻璃巴斯德移液管。

说明书

一种获取神经元的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种获取神经元的方法。

背景技术

[0002] 单细胞测序是指在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组等进行高通量测序分析的新技术，用于揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性，并被Science列为2013年度最值得关注的六大领域榜首。单细胞测序可应用于神经系统细胞、发育生物学等方向的研究。大脑的神经系统由成千上万种不同类型的神经细胞构成，这些神经细胞在细胞形态，突触连结及生理功能上具有高度的多样性。不同种类的神经细胞中，其基因组、蛋白组、化学分子组成、代谢也都有着很大的差别。单细胞转录组测序通过对单个神经元的RNA进行测序，分析每个细胞中的基因表达情况，对细胞进行分类比较，为神经发育、神经调控代谢、药效预测、新药研发等提供新的方向。

[0003] 为了对每个细胞中的RNA进行单独标记用于数据分辨，标记完成前的细胞必须是单个悬浮且完整的活细胞，因此单细胞测序对样本要求较高，包括细胞悬浮状态、浓度、活性等。而神经元又由于其脆弱性，更对单细胞提取提出挑战，因此有必要开发一种新的样本处理方法，更便捷地获得合适的样本进行单细胞转录组测序。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种获取神经元的方法，采用本发明得到的神经元的胞体直径平均为10μm，活性高、聚团率低，适用于10×单细胞测序。

[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

[0006] 本发明提供了一种获取神经元的方法，包括以下步骤：

[0007] 1)将神经核团与木瓜蛋白酶混合，将得到的混合物进行酶解、吹打，得到滤液；所述混合物中木瓜蛋白酶的酶活力单位为18～22U/ml；

[0008] 2)将所述步骤1)得到的滤液与红细胞裂解液混合后进行裂解，得到裂解物；

[0009] 3)将所述步骤2)得到的裂解物离心后，得到的沉淀为神经元。

[0010] 优选的，所述红细胞裂解液的组分包括：0.1～0.2M NH4CL、8～12mM KHCO3、0.05～0.15mM Na2EDTA、0.03～0.08mM DL-AP5和0.03～0.08mM犬尿氨酸。

[0011] 优选的，所述滤液与红细胞裂解液的体积比为(0.5～1.5):(2.5～3.5)。

[0012] 优选的，所述步骤2)裂解的时间为8～12min。

[0013] 优选的，所述步骤1)神经核团与木瓜蛋白酶混合时，还与L-半胱氨酸、Na2EDTA、DNase-I混合后，得到混合物；所述混合物中L-半胱氨酸的浓度为0.8～1.2M，所述混合物中Na2EDTA的浓度为0.4～0.6mM，所述混合物中DNase-I的酶活力单位为90～110U/ml。

[0014] 优选的，所述步骤1)酶解的条件包括：所述酶解的温度为35～42℃，所述酶解的时间为50～70min，所述酶解在振荡下进行，所述振荡的转速为90～110rpm。

[0015] 优选的，所述步骤1)吹打使用的工具为过火抛光的玻璃巴斯德移液管。

[0016] 优选的，步骤3)中，将所述裂解物置于离心液的上方后进行离心，所述离心的温度时间为4～6min，所述离心的离心力为280～320g。

[0017] 优选的，所述离心液的组分包括：8～12mg/ML卵黏蛋白抑制剂和8～12mg/ML牛血清白蛋白。

[0018] 优选的，将得到的神经元置于细胞维持液中维持，所述细胞维持液的组分包括：1X EBSS、0.04～0.06mM DL-AP5、0.04～0.06mM KA和140～160mM海藻糖。

[0019] 本发明提供了一种获取神经元的方法，包括以下步骤：1)将神经核团与木瓜蛋白酶混合，将得到的混合物进行酶解、吹打，得到滤液；所述混合物中木瓜蛋白酶的酶活力单位为18～22U/ml；2)将所述步骤1)得到的滤液与红细胞裂解液混合后进行裂解，得到裂解物；3)将所述步骤2)得到的裂解物离心后，得到的沉淀为神经元。神经核团经木瓜蛋白酶酶解释放出神经元，得到的滤液中除含有神经元外还含有红细胞，红细胞裂解液将红细胞裂解后，再经过离心，将细胞碎片除去，得到神经元。神经元的胞体直径平均为10μm，活性高、聚团率低，适用于10×单细胞测序。

附图说明

[0020] 图1为实施例1获得的神经元的检测；

[0021] 图2为对比例1获得的神经元的检测。

具体实施方式

[0022] 本发明提供了一种获取神经元的方法，包括以下步骤：

[0023] 1)将神经核团与木瓜蛋白酶混合，将得到的混合物进行酶解、吹打、过滤，得到滤液；所述混合物中木瓜蛋白酶的酶活力单位为18～22U/ml；

[0024] 2)将所述步骤1)得到的滤液与红细胞裂解液混合后进行裂解，得到裂解物；

[0025] 3)将所述步骤2)得到的裂解物离心后，得到的沉淀为神经元。

[0026] 本发明将神经核团与木瓜蛋白酶混合，将得到的混合物进行酶解、吹打、过滤，得到滤液；所述混合物中木瓜蛋白酶的酶活力单位为18～22U/ml。

[0027] 在本发明中，所述神经核团优选取自脑组织，所述脑组织的来源优选为小鼠，本发明优选将所述脑组织用眼科镊夹碎，夹碎后呈糜状。

[0028] 在本发明中，所述混合物中木瓜蛋白酶的酶活力单位为18～22U/ml，优选为20U/ml。在本发明中，所述木瓜蛋白酶将酶解脑组织中细胞间的蛋白骨架，释放神经元。在本发明中，所述神经核团与木瓜蛋白酶混合时，还优选与L-半胱氨酸、Na2EDTA、DNase-I混合后，得到混合物；所述混合物中L-半胱氨酸的浓度优选为0.8～1.2M，更优选为1M；所述混合物中Na2EDTA的浓度优选为0.4～0.6mM，更优选为0.5M；所述混合物中DNase-I的酶活力单位优选为90～110U/ml，更优选为100U/ml。在本发明中，所述L-半胱氨酸的作用是保护神经元。在本发明中，所述Na2EDTA作为金属螯合剂，螯合Ca2+等，和这些离子螯合后，加速细胞和培养皿的脱离，促进酶解。在本发明中，所述DNase-I的作用是减少细胞成团。

[0029] 在本发明中，所述酶解的条件优选包括：所述酶解的温度优选为35～42℃，更优选为37℃；所述酶解的时间优选为50～70min，更优选为60min；所述酶解优选在振荡下进行，所述振荡的转速优选为90～110rpm，更优选为100rpm。本发明优选使用过火抛光的玻璃巴斯德移液管进行轻轻吹打。在本发明中，所述过滤使用的滤网的孔径优选为20μm。在本发明中，所述滤液中除含有神经元外，还含有红细胞。

[0030] 本发明将得到的滤液与红细胞裂解液混合后进行裂解，得到裂解物。

[0031] 在本发明中，所述滤液与红细胞裂解液的体积比优选为(0.5～1.5):(2.5～3.5)，更优选为1:3。在本发明中，所述红细胞裂解液的组分优选包括：0.1～0.2M NH4CL、8～12mM KHCO3、0.05～0.15mM Na2EDTA、0.03～0.08mM DL-AP5和0.03～0.08mM犬尿氨酸；更优选包括：0.15M NH4CL、10mM KHCO3、0.1mM Na2EDTA、0.05mM DL-AP5和0.05mM犬尿氨酸。在本发明中，所述裂解的时间优选为8～12min，更优选为10min。在本发明中，将所述滤液和红细胞裂解液混合后在冰上静置进行裂解。在本发明中，所述裂解将红细胞裂解成细胞碎片。

[0032] 本发明将得到的裂解物离心后，得到的沉淀为神经元。

[0033] 本发明优选将所述裂解物置于离心液的上方后进行离心，所述离心的温度时间优选为4～6min，更优选为5min；所述离心的离心力优选为280～320g。更优选为300g。在本发明中，所述离心将所述细胞碎片除去，得到的沉淀为神经元。

[0034] 本发明得到的神经元的胞体直径平均为10μm，活性高、聚团率低，适用于10×单细胞测序。

[0035] 在本发明中，所述离心液的组分优选包括：8～12mg/ML卵黏蛋白抑制剂和8～12mg/ML牛血清白蛋白，更优选包括10mg/ML卵黏蛋白抑制剂和10mg/ML牛血清白蛋白。

[0036] 本发明优选将得到的神经元置于细胞维持液中维持，所述细胞维持液的组分优选包括：1X EBSS、0.04～0.06mM DL-AP5、0.04～0.06mM KA和140～160mM海藻糖；更优选包括1X EBSS、0.05mM DL-AP5、0.05mM KA和150mM海藻糖。

[0037] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0038] 实施例1

[0039] C57BL/6J神经元的分离

[0040] 实验动物：8周的C57BL/6J 5只

[0041] (一)试剂配制

[0042] 1.神经元消化液:20U/ML木瓜蛋白酶，1mM L-半胱氨酸，0.5mM Na2EDTA，100U/ML DNase-I。

[0043] 2.红细胞裂解液：0.15M NH4CL，10mM KHCO3，0.1mM Na2EDTA，0.05mM DL-AP5，0.05mM犬尿氨酸(KynurenicAcid,KA)。

[0044] 3.梯度离心液：梯度离心溶液为10mg/ML的卵黏蛋白抑制剂和10mg/ML牛血清白蛋白。

[0045] 4.细胞维持液：1X EBSS，0.05mM DL-AP5，0.05mM KA，150mM海藻糖。

[0046] (二)神经元分离

[0047] 1.37℃预热：神经元消化液在二氧化碳恒温培养箱中预热。

[0048] 2.将塑料培养皿，1.5ml无菌离心管放在冰上预冷。

[0049] 3.将神经核团取出后，用手术刀片切至小于1mm3的碎块，迅速放入提前灭菌的1.5ml无菌离心管。

[0050] 4.1.5ml离心管中加入1ml神经元消化液，封口膜封闭，37℃恒温振荡水浴锅(100转/分钟)消化60分钟。

[0051] 5.用过火抛光的玻璃巴斯德移液管轻轻吹打，形成细胞悬液。

[0052] 6.将细胞悬液通过20μm筛网过滤至新的无菌1.5ml离心管。

[0053] (二)裂解红细胞

[0054] 将过滤后的细胞悬液与细胞裂解液按体积比为1:3混合，上下颠倒混匀，冰上静置10分钟，中间再次轻轻混匀一次，以使红细胞充分裂解。

[0055] (三)梯度离心，去除细胞碎片

[0056] 先将梯度离心溶液置于15ml离心管，然后将红细胞裂解后的细胞悬液加入梯度离心液上方。加入量为裂解后细胞后总体积：梯度离心溶液体积＝1:5，300×g离心5分钟。

[0057] (三)神经元重悬，细胞活性检测

[0058] 1.小心去上清，仅留下离心后细胞团。

[0059] 2.用细胞维持液重悬神经元，Cell counter进行细胞计数。结果见图1。

[0060] 从图1中可以得出，细胞活性为89.8％，细胞平均直径为10.2μm，单细胞含量为94.0％。

[0061] 对比例1

[0062] 红细胞裂解液：0.15M NH4CL，10mM KHCO3，0.1mM Na2EDTA。

[0063] 1X EBSS。

[0064] 其余条件同实施例2，结果见图2。

[0065] 从图2中可以得出，细胞活性为66.1％，细胞平均直径为9.1μm，单细胞含量为90.0％。

[0066] 由以上实施例可以得出，采用本发明提供的方法，获得的神经元活性高、聚团率低，适用于10×单细胞测序。

[0067] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。