一个调控油菜素内酯信号转导的基因BnC04BIN2-like1及其应用转让专利
申请号 : CN201910842931.9
文献号 : CN110452914B
文献日 : 2021-07-02
发明人 : 管荣展 , 杨茂 , 樊浩 , 黄成威 , 万书贝
申请人 : 南京农业大学
摘要 :
本发明为基因工程技术领域，具体涉及一个调控油菜素内酯信号转导的基因BnC04BIN2‑like1及其应用。本发明从甘蓝型油菜矮杆突变材料“MB1501‑1”克隆分离得到负调控植物油菜素内酯信号转导的基因BnC04BIN2‑like1，该基因与参考基因有11个碱基的替换。本发明构建了PBI121‑BnC04BIN2‑like1过表达载体和CRISPR‑BnC04BIN2‑like1载体，获得了PBI121‑BnC04BIN2‑like1过表达转基因植株，出现矮化表型；同时获得了CRISPR‑BnC04BIN2‑like1转基因植株，转基因植株恢复高杆表型。克隆得到的BnC04BIN2‑like1基因能够负调控油菜素内酯的信号转导，从而控制油菜株高性状。
权利要求 :
1.一个调控油菜素内酯信号转导的基因，其特征在于，所述基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：1所示；
序列表中的SEQ ID NO：1由410个氨基酸残基组成，自氨基端（N端）第65‑357位氨基酸残基为保守序列。
2.根据权利要求1所述的基因，其序列如SEQ ID NO：2所示。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于， SEQ ID NO：2由1672个碱基组成，其编码序列为5’端第73‑1305位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第265‑1143位碱基编码保守序列。
4.根据权利要求1所述的基因，其特征在于，所述基因的序列如SEQ ID NO：3所示。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于，序列表中的SEQ ID NO：3由3314个碱基组成，自5’端第73‑178位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5’端第179‑755位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5’端第756‑846位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自
5’端第847‑1035位碱基为该基因组基因的第二个内含子，自5’端第1036‑1097位碱基为该基因组基因的第三个外显子，自5’端第1098‑1187位碱基为该基因组基因的第三个内含子，自5’端第1188‑1459位碱基为该基因组基因的第四个外显子，自5’端第1460‑1547位碱基为该基因组基因的第四个内含子，自5’端第1548‑1624位碱基为该基因组基因的第五个外显子，自5’端第1625‑1701位碱基为该基因组基因的第五个内含子，自5’端第1702‑1758位碱基为该基因组基因的第六个外显子，自5’端第1759‑1855位碱基为该基因组基因的第六个内含子，自5’端第1856‑1994位碱基为该基因组基因的第七个外显子，自5’端第1995‑2083位碱基为该基因组基因的第七个内含子，自5’端第2084‑2136位碱基为该基因组基因的第八个外显子，自5’端第2137‑2245位碱基为该基因组基因的第八个内含子，自5’端第2246‑
2341位碱基为该基因组基因的第九个外显子，自5’端第2342‑2430位碱基为该基因组基因的第九个内含子，自5’端第2431‑2512位碱基为该基因组基因的第十个外显子，自5’端第
2513‑2629位碱基为该基因组基因的第十个内含子，自5’端第2630‑2731位碱基为该基因组基因的第十一个外显子，自5’端第2732‑2851位碱基为该基因组基因的第十一个内含子，自
5’端第2852‑2947位碱基为该基因组基因的第十二个外显子，自5’端1‑72位碱基为该基因组基因的5’端非编码区（UTR），自5’端第2948‑3314位碱基为该基因组基因的3’端非编码区。
6.包含权利要求1‑5任一项所述基因的表达载体、转基因细胞系或宿主菌。
7.权利要求1所述基因编码的蛋白。
8.权利要求1‑5任一项所述基因在抗倒伏和紧凑型油菜育种上的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，操作步骤如下：（1）利用农杆菌介导的转基因方法将所述基因导入甘蓝型油菜受体，获得转化植株；
（2）借助PCR方法分析鉴定阳性转基因植株；
（3）将步骤（2）的转基因植株进行大田种植并观察其性状；
（4）借助RT‑PCR分析转基因植株和野生型植株中参与油菜素内酯信号转导相关基因的表达。
说明书 :
一个调控油菜素内酯信号转导的基因BnC04BIN2‑like1及其
应用
技术领域
[0001] 本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种调控甘蓝型油菜植株油菜素内酯合成的DNA片段(基因)的分离克隆、功能验证及其应用。
背景技术
[0002] 油菜素内酯(BRs)是一类促生长的甾醇植物激素，又称芸苔素内酯、油菜素甾醇。它是一种天然植物激素，广泛存在于植物的花粉、种子、茎和叶等器官中，由于其生理活性
大大超过现有的五种激素，已被国际上誉为第六激素。油菜素内酯的功能包括：调节茎的伸
长生长、花粉管生长、叶的伸展、根的生长、植物育性、衰老及抗性中发挥重要的调节作用。
但已知的BR信号转导组分还不能组成一个完整的信号转导途径，还有一些问题尚待阐明。
大大超过现有的五种激素，已被国际上誉为第六激素。油菜素内酯的功能包括：调节茎的伸
长生长、花粉管生长、叶的伸展、根的生长、植物育性、衰老及抗性中发挥重要的调节作用。
但已知的BR信号转导组分还不能组成一个完整的信号转导途径，还有一些问题尚待阐明。
[0003] 伴随着遗传学、分子生物学以及生物化学等应用学科的发展，BR信号转导相关的研究也受益其中。研究人员于1996年在EMS诱变后代群体中筛选到bril突变体，该突变体表
现为对BR不敏感，并呈现矮化、叶片浓绿、叶片下卷等表型。紧接着，研究人员通过图位克隆
的方法克隆得到BRI1，它编码一个富含亮氨酸重复序列的受体蛋白激酶。研究小组通过酵
母双杂交以及运用激活标签技术，找到了可以与BRI1相互作用的BR共受体BAK1。虽然，
Russinova(2004)课题组通过荧光共振能量转移的方法证明BRI1可以形成同源二聚体，但
Sheet等(2011)新的晶体结构数据显示BRI1在结构上可能更大程度上与BAK1形成异源二聚
体，共同接受BR信号。通过酵母双杂交的方法，研究人员筛选到BIK1，当植物体内BR水平较
低的时候，它与BRI1相互作用会抑制BRI1招募共受体BAK1，进而抑制BR信号向下游输出。当
植物感知BR信号时，BRI1发生自身磷酸化而被激活，被激活的BRI1接着磷酸化激活共受体
BAK1，被激活的BAK1反过来继续磷酸化BRI1之前未被磷酸化的位点，全部被激活的BRI1与
有活性的BAK1共同将BR信号向下游传导。BSU1是通过激活标签法筛选到的，它编码一种核
定位的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。BSU1可以被激活后的BSK1和CDG1磷酸化而激活，磷酸化激
活的BSU1会将BIN2去磷酸化，进而抑制其激酶活性，同时促进BIN2的降解过程。至此，我们
可以简单归纳为：BR与BRI1结合之后，将BRI1在与BIK1的相互作用状态下解脱出来与BAK1
相互结合，二者通过相互磷酸化的方式全面激活彼此的活性，进而通过BSK1和CDG1激活
BSU1，激活的BSU1可以去磷酸化BIN2抑制BIN2的活性。
现为对BR不敏感，并呈现矮化、叶片浓绿、叶片下卷等表型。紧接着，研究人员通过图位克隆
的方法克隆得到BRI1，它编码一个富含亮氨酸重复序列的受体蛋白激酶。研究小组通过酵
母双杂交以及运用激活标签技术，找到了可以与BRI1相互作用的BR共受体BAK1。虽然，
Russinova(2004)课题组通过荧光共振能量转移的方法证明BRI1可以形成同源二聚体，但
Sheet等(2011)新的晶体结构数据显示BRI1在结构上可能更大程度上与BAK1形成异源二聚
体，共同接受BR信号。通过酵母双杂交的方法，研究人员筛选到BIK1，当植物体内BR水平较
低的时候，它与BRI1相互作用会抑制BRI1招募共受体BAK1，进而抑制BR信号向下游输出。当
植物感知BR信号时，BRI1发生自身磷酸化而被激活，被激活的BRI1接着磷酸化激活共受体
BAK1，被激活的BAK1反过来继续磷酸化BRI1之前未被磷酸化的位点，全部被激活的BRI1与
有活性的BAK1共同将BR信号向下游传导。BSU1是通过激活标签法筛选到的，它编码一种核
定位的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。BSU1可以被激活后的BSK1和CDG1磷酸化而激活，磷酸化激
活的BSU1会将BIN2去磷酸化，进而抑制其激酶活性，同时促进BIN2的降解过程。至此，我们
可以简单归纳为：BR与BRI1结合之后，将BRI1在与BIK1的相互作用状态下解脱出来与BAK1
相互结合，二者通过相互磷酸化的方式全面激活彼此的活性，进而通过BSK1和CDG1激活
BSU1，激活的BSU1可以去磷酸化BIN2抑制BIN2的活性。
[0004] 2002年研究人员发现bin2‑1类似于bril呈现BR不敏感的表型。BIN2编码一种GSK3类蛋白激酶，在BR信号转导中起主要作用。当植物体内BR水平较低的时候，BIN2处于活化状
态，有活性的BIN2可磷酸化并且抑制BZR1/BES1的功能。BIN2与BZR1的结合位点是在其C末
端的12个氨基酸，被BIN2磷酸化后的BZR1会被磷酸化结合蛋白14‑3‑3绑定在细胞质中，进
而无法进入核内与DNA结合来阻断BR信号的下游传导。当BR水平较高时，首先BIN2的激酶活
性会降低，同时PP2A可以快速的将BZR1去磷酸化，去磷酸化后的BZR1进入核内调节下游基
因的表达，使BR信号向下传导。
态，有活性的BIN2可磷酸化并且抑制BZR1/BES1的功能。BIN2与BZR1的结合位点是在其C末
端的12个氨基酸，被BIN2磷酸化后的BZR1会被磷酸化结合蛋白14‑3‑3绑定在细胞质中，进
而无法进入核内与DNA结合来阻断BR信号的下游传导。当BR水平较高时，首先BIN2的激酶活
性会降低，同时PP2A可以快速的将BZR1去磷酸化，去磷酸化后的BZR1进入核内调节下游基
因的表达，使BR信号向下传导。
[0005] 20世纪90年代，随着基因组学技术的应用，研究人员证实在大部分BR缺陷及不敏感突变株中细胞的伸长受到严重的影响，黑暗条件下下胚轴长度缩短而光照条件下则会出
现矮化的表型(salchert et al.,1998)。AtCPD基因编码一个细胞色素P450(CYP90)蛋白，
具有甾醇类羟化酶的保守结构域，该酶缺失会导致植株的矮小，外施BR或者过表达CPD的
cDNA，都可以使其恢复野生型的表型(Szekeres et al.,1996)。Dwf4突变株同样属于BR合
成缺陷型矮化突变体，除了油菜素内酯外任何激素都不能恢复其矮小的表型(Azpiroz et
al.,1998)。水稻BR缺陷突变体brd1(BR‑deficient dwarf1)具有节间几乎不能伸长、叶鞘
缩短、叶片短小且卷曲严重、分蘖少且不育的表型，是水稻中第一个被发现的BR缺陷型的突
变体。外源施加BR后该突变体可以恢复表型。BRD1基因编码一个C‑6氧化酶，属于早期的C‑6
氧化途径，基因发生突变后会导致水稻植株矮化(Hong et al.,2002)。类似的BR缺陷型突
变株还有bul1‑1，该突变体细胞的伸长同样受到了抑制，利用显微镜对其细胞进行观察发
现与野生型相比突变体中平行微管组织明显减少。该基因编码一个Δ7‑甾醇‑C‑脱氢酶，该
酶的缺失通过影响植株体内油菜素内酯的含量从而影响了细胞的结构，造成矮小的表型
(Catterou et al.,2001)。
现矮化的表型(salchert et al.,1998)。AtCPD基因编码一个细胞色素P450(CYP90)蛋白，
具有甾醇类羟化酶的保守结构域，该酶缺失会导致植株的矮小，外施BR或者过表达CPD的
cDNA，都可以使其恢复野生型的表型(Szekeres et al.,1996)。Dwf4突变株同样属于BR合
成缺陷型矮化突变体，除了油菜素内酯外任何激素都不能恢复其矮小的表型(Azpiroz et
al.,1998)。水稻BR缺陷突变体brd1(BR‑deficient dwarf1)具有节间几乎不能伸长、叶鞘
缩短、叶片短小且卷曲严重、分蘖少且不育的表型，是水稻中第一个被发现的BR缺陷型的突
变体。外源施加BR后该突变体可以恢复表型。BRD1基因编码一个C‑6氧化酶，属于早期的C‑6
氧化途径，基因发生突变后会导致水稻植株矮化(Hong et al.,2002)。类似的BR缺陷型突
变株还有bul1‑1，该突变体细胞的伸长同样受到了抑制，利用显微镜对其细胞进行观察发
现与野生型相比突变体中平行微管组织明显减少。该基因编码一个Δ7‑甾醇‑C‑脱氢酶，该
酶的缺失通过影响植株体内油菜素内酯的含量从而影响了细胞的结构，造成矮小的表型
(Catterou et al.,2001)。
[0006] 本发明找到了一个来源于油菜并能调控油菜素内酯信号转导的基因，这个基因在过表达以后能够降低其调控的油菜素内酯信号转导，从而降低植株体内生长素的合成，并
最终引起植株矮化，当这个基因在表达受到干扰，植株能够恢复其调控的油菜素内酯信号
转导，从而恢复植株体内生长素的合成，并使矮化材料长高。
最终引起植株矮化，当这个基因在表达受到干扰，植株能够恢复其调控的油菜素内酯信号
转导，从而恢复植株体内生长素的合成，并使矮化材料长高。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一个调控油菜素内酯信号转导的基因。
[0008] 本发明所提供的调控油菜素内酯信号转导的基因，名称为BR‑INSENSITIVE‑2‑like1(简称BIN2‑like1或BnC04BIN2‑like1)，来源于甘蓝型油菜(Brassica napus)，从一
个甘蓝型油菜矮杆突变体材料“MB1501‑1”中克隆得到的基因片段，与2014年公布(2017年
更新)的法国油菜数据库有11个碱基的替换。
个甘蓝型油菜矮杆突变体材料“MB1501‑1”中克隆得到的基因片段，与2014年公布(2017年
更新)的法国油菜数据库有11个碱基的替换。
[0009] 一个调控油菜油菜素内酯信号转导的基因BnC04BIN2‑like1，是下述氨基酸残基序列之一，与2014年公布(2017年更新)的法国油菜数据库有2个氨基酸残基的替换，位于
aa‑187和aa‑309：
aa‑187和aa‑309：
[0010] (1)序列表中的SEQ ID NO：1；
[0011] (2)将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过一个至十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有调控植株油菜素内酯信号转导功能的蛋白质。
[0012] 序列表中的SEQ ID NO：1由410个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第65‑357位氨基酸残基为保守序列。
[0013] 所述取代和/或缺失和/或添加的一至十个氨基酸残基为非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。
[0014] 编码本发明调控植物油菜素内酯信号转导的基因(BR‑INSENSITIVE‑2‑like1，简称BIN2‑like1或BnC04BIN2‑like1)，其cDNA是下述核苷酸序列之一，与2014年公布(2017年
更新)的法国油菜数据库有11个碱基的替换，位于自5’端第21,135,147,312,399,454,466,
559,615,618和1197位碱基：
更新)的法国油菜数据库有11个碱基的替换，位于自5’端第21,135,147,312,399,454,466,
559,615,618和1197位碱基：
[0015] (1)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；
[0016] (2)编码序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；
[0017] (3)与序列表中SEQ ID NO：2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有调控植物油菜素内酯信号转导的核苷酸序列；
[0018] (4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
[0019] 所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
[0020] 序列表中的SEQ ID NO：2由1672个碱基组成，其编码序列为5’端第73‑1305位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第265‑1143位碱基
编码保守序列。
编码保守序列。
[0021] 其基因组基因，是下述核苷酸序列之一：
[0022] (1)序列表中SEQ ID NO：3的DNA序列；
[0023] (2)与序列表中SEQ ID NO：3限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有调控植物油菜素内酯信号转导的核苷酸序列；
[0024] (3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID NO：3限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
[0025] 所述高严谨条件为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
[0026] 序列表中的SEQ ID NO：3由3314个碱基组成，自5’端第73‑178位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5’端第179‑755位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5’端第
756‑846位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5’端第847‑1035位碱基为该基因组基
因的第二个内含子，自5’端第1036‑1097位碱基为该基因组基因的第三个外显子，自5’端第
1098‑1187位碱基为该基因组基因的第三个内含子，自5’端第1188‑1459位碱基为该基因组
基因的第四个外显子，自5’端第1460‑1547位碱基为该基因组基因的第四个内含子，自5’端
第1548‑1624位碱基为该基因组基因的第五个外显子，自5’端第1625‑1701位碱基为该基因
组基因的第五个内含子，自5’端第1702‑1758位碱基为该基因组基因的第六个外显子，自5’
端第1759‑1855位碱基为该基因组基因的第六个内含子，自5’端第1856‑1994位碱基为该基
因组基因的第七个外显子，自5’端第1995‑2083位碱基为该基因组基因的第七个内含子，自
5’端第2084‑2136位碱基为该基因组基因的第八个外显子，自5’端第2137‑2245位碱基为该
基因组基因的第八个内含子，自5’端第2246‑2341位碱基为该基因组基因的第九个外显子，
自5’端第2342‑2430位碱基为该基因组基因的第九个内含子，自5’端第2431‑2512位碱基为
该基因组基因的第十个外显子，自5’端第2513‑2629位碱基为该基因组基因的第十个内含
子，自5’端第2630‑2731位碱基为该基因组基因的第十一个外显子，自5’端第2732‑2851位
碱基为该基因组基因的第十一个内含子，自5’端第2852‑2947位碱基为该基因组基因的第
十二个外显子，自5’端1‑72位碱基为该基因组基因的5’端非编码区(UTR)，自5’端第2948‑
3314位碱基为该基因组基因的3’端非编码区。
756‑846位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5’端第847‑1035位碱基为该基因组基
因的第二个内含子，自5’端第1036‑1097位碱基为该基因组基因的第三个外显子，自5’端第
1098‑1187位碱基为该基因组基因的第三个内含子，自5’端第1188‑1459位碱基为该基因组
基因的第四个外显子，自5’端第1460‑1547位碱基为该基因组基因的第四个内含子，自5’端
第1548‑1624位碱基为该基因组基因的第五个外显子，自5’端第1625‑1701位碱基为该基因
组基因的第五个内含子，自5’端第1702‑1758位碱基为该基因组基因的第六个外显子，自5’
端第1759‑1855位碱基为该基因组基因的第六个内含子，自5’端第1856‑1994位碱基为该基
因组基因的第七个外显子，自5’端第1995‑2083位碱基为该基因组基因的第七个内含子，自
5’端第2084‑2136位碱基为该基因组基因的第八个外显子，自5’端第2137‑2245位碱基为该
基因组基因的第八个内含子，自5’端第2246‑2341位碱基为该基因组基因的第九个外显子，
自5’端第2342‑2430位碱基为该基因组基因的第九个内含子，自5’端第2431‑2512位碱基为
该基因组基因的第十个外显子，自5’端第2513‑2629位碱基为该基因组基因的第十个内含
子，自5’端第2630‑2731位碱基为该基因组基因的第十一个外显子，自5’端第2732‑2851位
碱基为该基因组基因的第十一个内含子，自5’端第2852‑2947位碱基为该基因组基因的第
十二个外显子，自5’端1‑72位碱基为该基因组基因的5’端非编码区(UTR)，自5’端第2948‑
3314位碱基为该基因组基因的3’端非编码区。
[0027] 所述的基因BnC04BIN2‑like1与油菜素内酯信号转导相关。将该基因的完整编码序列(Coding sequence)与过表达载体PBI121结合后直接转入到甘蓝型油菜常规优良品种
中双11(ZS11)中，转基因植株株高明显比对照植株的株高矮；将构建好的该基因CRISPR/
Cas9载体直接转入到甘蓝型油菜矮杆油菜品种‘MB1501‑1’中，转基因植株的株高可恢复正
常。表明本发明BnC04BIN2‑like1基因能够负调控油菜素内酯的信号转导，从而控制油菜株
高性状。
中双11(ZS11)中，转基因植株株高明显比对照植株的株高矮；将构建好的该基因CRISPR/
Cas9载体直接转入到甘蓝型油菜矮杆油菜品种‘MB1501‑1’中，转基因植株的株高可恢复正
常。表明本发明BnC04BIN2‑like1基因能够负调控油菜素内酯的信号转导，从而控制油菜株
高性状。
[0028] 含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系、宿主菌及其编码的蛋白均属于本发明的保护范围。
[0029] 扩增BnC04BIN2‑like1基因中任一片段的引物及引物对也在本发明的保护范围之内。
[0030] 本发明所克隆的基因BnC04BIN2‑like1可用于抗倒伏和紧凑型油菜育种上。
[0031] 具体操作步骤如下：
[0032] (1)利用农杆菌介导的转基因方法将所述的基因BnC04BIN2‑like1导入甘蓝型油菜受体，获得转化植株；
[0033] (2)借助PCR方法分析鉴定阳性转基因植株；
[0034] (3)将步骤(2)的转基因植株进行大田种植并观察其性状；
[0035] (4)借助RT‑PCR分析转基因植株和野生型植株中参与油菜素内酯信号转导相关基因BnC04BIN2‑like1的表达。
[0036] BnC04BIN2‑like1有益效果：
[0037] 所述的基因BnC04BIN2‑like1与油菜素内酯信号转导相关。将该基因的完整编码序列(Coding sequence)与过表达载体PBI121结合后直接转入到甘蓝型油菜常规优良品种
中双11(ZS11)中，转基因植株株高明显较矮与中双植株的株高；将构建好的该基因CRISPR/
Cas9载体直接转入到甘蓝型油菜矮杆油菜品种‘MB1501‑1’中，转基因植株的株高可恢复高
杆表型。表明本发明BnC04BIN2‑like1基因能够负调控油菜素内酯的信号转导，从而控制油
菜株高性状。
中双11(ZS11)中，转基因植株株高明显较矮与中双植株的株高；将构建好的该基因CRISPR/
Cas9载体直接转入到甘蓝型油菜矮杆油菜品种‘MB1501‑1’中，转基因植株的株高可恢复高
杆表型。表明本发明BnC04BIN2‑like1基因能够负调控油菜素内酯的信号转导，从而控制油
菜株高性状。
附图说明
[0038] 图1为BnC04BIN2‑like1基因组基因的框架结构；
[0039] 图2为BnC04BIN2‑like1的蛋白质序列分析图；
[0040] 图3为植物过表达载体PBI121构建示意图；
[0041] 图4为植物CRISPR/Cas9载体构建示意图；
[0042] 图5为BnC04BIN2‑like1基因过表达转基因植株表型；其中左边为野生型ZS11单株，右边为PBI121‑BnC04BIN2‑like1转基因植株表型。
[0043] 图6为BnC04BIN2‑like1基因CRISPR/Cas9载体转基因植株表型；其中左边为CRISPR‑BnC04BIN2‑like1转基因植株表型，中间为杂合矮杆植株，右边为高杆植株。
具体实施方式
[0044] 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0045] 实施例1
[0046] 调控植物油菜素内酯信号转导基因BnC04BIN2‑like1的克隆
[0047] 用TRIZAL试剂并参照试剂盒说明书提取甘蓝型油菜(Brassica napus)新鲜叶片的总RNA，然后用Takara公司的Reverse Transcription试剂盒并按照试剂盒说明书反转合
成cDNA,以所合成的cDNA为模板，再以已公开的法国甘蓝型油菜基因组为参考设计引物，在
引物P1(上游引物)：5’‑ATAGCACATGACATCACTATC‑3’和P2(下游引物)：5’‑
TCTCCTCTTTTCCACAAG‑3’的引物下PCR扩增油菜中的调控植物油菜素内酯信号转导的基因，
反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用AXYGEN离心柱型胶回收试
剂盒，按照说明进行目的条带回收并对其进行纯化，将回收产物连入载体Easy Blunt
Simple中，经热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞。蓝白斑筛选阳性克隆，将其接
种于含卡那霉素LB液体培养基中，37℃、200rpm下培养，提取质粒，对其进行测序，测序结果
表明扩增片段具有序列表中的SEQ ID NO：2的核苷酸序列，由1233个碱基组成，其编码序列
位点位为自5’端第1‑1233位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋
白质，其中，自5’端第193‑1071位碱基编码保守序列。其基因组基因具有序列表中SEQ ID
NO：3的核苷酸序列，由3314个碱基组成，自5’端第73‑178位碱基为该基因组基因的第一个
外显子，自5’端第179‑755位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5’端第756‑846位碱
基为该基因组基因的第二个外显子，自5’端第847‑1035位碱基为该基因组基因的第二个内
含子，自5’端第1036‑1097位碱基为该基因组基因的第三个外显子，自5’端第1098‑1187位
碱基为该基因组基因的第三个内含子，自5’端第1188‑1459位碱基为该基因组基因的第四
个外显子，自5’端第1460‑1547位碱基为该基因组基因的第四个内含子，自5’端第1548‑
1624位碱基为该基因组基因的第五个外显子，自5’端第1625‑1701位碱基为该基因组基因
的第五个内含子，自5’端第1702‑1758位碱基为该基因组基因的第六个外显子，自5’端第
1759‑1855位碱基为该基因组基因的第六个内含子，自5’端第1856‑1994位碱基为该基因组
基因的第七个外显子，自5’端第1995‑2083位碱基为该基因组基因的第七个内含子，自5’端
第2084‑2136位碱基为该基因组基因的第八个外显子，自5’端第2137‑2245位碱基为该基因
组基因的第八个内含子，自5’端第2246‑2341位碱基为该基因组基因的第九个外显子，自5’
端第2342‑2430位碱基为该基因组基因的第九个内含子，自5’端第2431‑2512位碱基为该基
因组基因的第十个外显子，自5’端第2513‑2629位碱基为该基因组基因的第十个内含子，自
5’端第2630‑2731位碱基为该基因组基因的第十一个外显子，自5’端第2732‑2851位碱基为
该基因组基因的第十一个内含子，自5’端第2852‑2947位碱基为该基因组基因的第十二个
外显子，自5’端1‑72位碱基为该基因组基因的5’端非编码区(UTR)，自5’端第2948‑3314位
碱基为该基因组基因的3’端非编码区。该基因的框架结构件图1。
成cDNA,以所合成的cDNA为模板，再以已公开的法国甘蓝型油菜基因组为参考设计引物，在
引物P1(上游引物)：5’‑ATAGCACATGACATCACTATC‑3’和P2(下游引物)：5’‑
TCTCCTCTTTTCCACAAG‑3’的引物下PCR扩增油菜中的调控植物油菜素内酯信号转导的基因，
反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用AXYGEN离心柱型胶回收试
剂盒，按照说明进行目的条带回收并对其进行纯化，将回收产物连入载体Easy Blunt
Simple中，经热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞。蓝白斑筛选阳性克隆，将其接
种于含卡那霉素LB液体培养基中，37℃、200rpm下培养，提取质粒，对其进行测序，测序结果
表明扩增片段具有序列表中的SEQ ID NO：2的核苷酸序列，由1233个碱基组成，其编码序列
位点位为自5’端第1‑1233位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋
白质，其中，自5’端第193‑1071位碱基编码保守序列。其基因组基因具有序列表中SEQ ID
NO：3的核苷酸序列，由3314个碱基组成，自5’端第73‑178位碱基为该基因组基因的第一个
外显子，自5’端第179‑755位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5’端第756‑846位碱
基为该基因组基因的第二个外显子，自5’端第847‑1035位碱基为该基因组基因的第二个内
含子，自5’端第1036‑1097位碱基为该基因组基因的第三个外显子，自5’端第1098‑1187位
碱基为该基因组基因的第三个内含子，自5’端第1188‑1459位碱基为该基因组基因的第四
个外显子，自5’端第1460‑1547位碱基为该基因组基因的第四个内含子，自5’端第1548‑
1624位碱基为该基因组基因的第五个外显子，自5’端第1625‑1701位碱基为该基因组基因
的第五个内含子，自5’端第1702‑1758位碱基为该基因组基因的第六个外显子，自5’端第
1759‑1855位碱基为该基因组基因的第六个内含子，自5’端第1856‑1994位碱基为该基因组
基因的第七个外显子，自5’端第1995‑2083位碱基为该基因组基因的第七个内含子，自5’端
第2084‑2136位碱基为该基因组基因的第八个外显子，自5’端第2137‑2245位碱基为该基因
组基因的第八个内含子，自5’端第2246‑2341位碱基为该基因组基因的第九个外显子，自5’
端第2342‑2430位碱基为该基因组基因的第九个内含子，自5’端第2431‑2512位碱基为该基
因组基因的第十个外显子，自5’端第2513‑2629位碱基为该基因组基因的第十个内含子，自
5’端第2630‑2731位碱基为该基因组基因的第十一个外显子，自5’端第2732‑2851位碱基为
该基因组基因的第十一个内含子，自5’端第2852‑2947位碱基为该基因组基因的第十二个
外显子，自5’端1‑72位碱基为该基因组基因的5’端非编码区(UTR)，自5’端第2948‑3314位
碱基为该基因组基因的3’端非编码区。该基因的框架结构件图1。
[0048] 实施例2
[0049] BnC04BIN2‑like1过表达转基因植株的获得
[0050] 一、含BnC04BIN2‑like1基因的植物过表达载体的构建
[0051] 在BnC04BIN2‑like1基因的CDS序列上游加上Xba I限制性内切酶位点，上游引物P3：5’‑GCTCTAGAATGACATCACTATC‑3’，在BnC04BIN2‑like1基因的CDS序列下游加上Sma I限
制性内切酶位点下游引物P4：5’‑TCCCCCGGGCTAATGACCAGGCT‑3’。用引物P3和P4对实施例1
克隆得到的序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列进行PCR扩增，反应结束后，对PCR扩增产物
进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用AXYGEN离心柱型胶回收试剂盒，按照说明进行目的条带
回收并对其进行纯化，将回收产物连入载体Easy BluntSimple中，经热激法转化大肠杆菌
(E.coli)DH5α感受态细胞。蓝白斑筛选阳性克隆，将其接种于含卡那霉素LB液体培养基中，
37℃、200rpm下培养，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明扩增片段具有序列表中的SEQ
ID NO：2加限制性内切酶Xba I和Sma I位点的核苷酸序列，并用限制性内切酶Xba I和Sma
I对构建好的含有BnC04BIN2‑like1基因的质粒进行酶切，对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶
电泳检测，回收长度约1233的BnC04BIN2‑like1基因片段并对其进行纯化，将回收片段用
T4DNA连接酶(Takara)与经相同酶切的载体PBI121链接，再将连接产物用热激法转化大肠
杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，将其接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，
在37℃、200rpm下培养，提取质粒，对重组质粒用限制性内切酶Xba I和Sma I进行酶切鉴
定，与预期结果相符，再用引物P3和P4做进一步的PCR鉴定，结果经PCR扩增得到了1233bp的
DNA片段，与预期结果一致，表明得到了插入序列及位置正确的含有BnC04BIN2‑like1的植
物表达载体，命名为PBI121‑BnC04BIN2‑like1。
制性内切酶位点下游引物P4：5’‑TCCCCCGGGCTAATGACCAGGCT‑3’。用引物P3和P4对实施例1
克隆得到的序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列进行PCR扩增，反应结束后，对PCR扩增产物
进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，采用AXYGEN离心柱型胶回收试剂盒，按照说明进行目的条带
回收并对其进行纯化，将回收产物连入载体Easy BluntSimple中，经热激法转化大肠杆菌
(E.coli)DH5α感受态细胞。蓝白斑筛选阳性克隆，将其接种于含卡那霉素LB液体培养基中，
37℃、200rpm下培养，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明扩增片段具有序列表中的SEQ
ID NO：2加限制性内切酶Xba I和Sma I位点的核苷酸序列，并用限制性内切酶Xba I和Sma
I对构建好的含有BnC04BIN2‑like1基因的质粒进行酶切，对酶切产物进行1％琼脂糖凝胶
电泳检测，回收长度约1233的BnC04BIN2‑like1基因片段并对其进行纯化，将回收片段用
T4DNA连接酶(Takara)与经相同酶切的载体PBI121链接，再将连接产物用热激法转化大肠
杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，将其接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，
在37℃、200rpm下培养，提取质粒，对重组质粒用限制性内切酶Xba I和Sma I进行酶切鉴
定，与预期结果相符，再用引物P3和P4做进一步的PCR鉴定，结果经PCR扩增得到了1233bp的
DNA片段，与预期结果一致，表明得到了插入序列及位置正确的含有BnC04BIN2‑like1的植
物表达载体，命名为PBI121‑BnC04BIN2‑like1。
[0052] 二、PBI121‑BnC04BIN2‑like1转基因油菜的获得
[0053] 将步骤一构建的植物表达载体PBI121‑BnC04BIN2‑like1用热激法转化农杆菌EHA105感受态细胞，将其涂布于含卡那霉素和利福平的LB抗性平板上，在28℃、150rpm下培
养，挑取长出的农杆菌单菌落再接种于含卡那霉素和利福平的20ml LB液体培养基中，在28
℃、150rpm下培养2天，然后，再按2％的接种量菌将菌液接种于含卡那霉素和利福平的
300ml LB液体培养基中，在28℃、150rpm下培养16‑18小时。培养结束后，5000rpm离心20分
钟后收集菌体，再将菌体悬浮于250ml含有5％蔗糖，0.1％Silwetl‑77的溶液中。最后，将菌
液转于250ml烧杯中，将已授粉结束的甘蓝型油菜花去掉，再将植株倒置于烧杯中，使其花
序完全侵入菌液中，为提高转化效率，一周后再重复一次。将转化植株进行常规培养，收获
种子，所得种子经卡那霉素和PCR鉴定筛选后得到BnC04BIN2‑like1转基因植株。
养，挑取长出的农杆菌单菌落再接种于含卡那霉素和利福平的20ml LB液体培养基中，在28
℃、150rpm下培养2天，然后，再按2％的接种量菌将菌液接种于含卡那霉素和利福平的
300ml LB液体培养基中，在28℃、150rpm下培养16‑18小时。培养结束后，5000rpm离心20分
钟后收集菌体，再将菌体悬浮于250ml含有5％蔗糖，0.1％Silwetl‑77的溶液中。最后，将菌
液转于250ml烧杯中，将已授粉结束的甘蓝型油菜花去掉，再将植株倒置于烧杯中，使其花
序完全侵入菌液中，为提高转化效率，一周后再重复一次。将转化植株进行常规培养，收获
种子，所得种子经卡那霉素和PCR鉴定筛选后得到BnC04BIN2‑like1转基因植株。
[0054] 三、PBI121‑BnC04BIN2‑like1转基因植株表型观察
[0055] 将步骤三获得的过表达BnC04BIN2‑like1的阳性转基因植株的种子种植与大田条件下，以甘蓝型油菜野生型作为对照。观察BnC04BIN2‑like1过表达植株和野生型植株的生
长情况，BnC04BIN2‑like1过表达植株在自然条件下生长的表型如图5所示，BnC04BIN2‑
like1过表达植株矮化、不结实。
长情况，BnC04BIN2‑like1过表达植株在自然条件下生长的表型如图5所示，BnC04BIN2‑
like1过表达植株矮化、不结实。
[0056] 实施例3
[0057] CRISPR‑BnC04BIN2‑like1转基因植株的获得
[0058] 一、含BNC04BIN2‑LIKE1基因的植物CRISPR/Cas9载体的构建
[0059] 对BnC04BIN2‑like1基因设计2个靶点，一个在ORF‑5’区，引物设计为P5(5'gRT1+)：5’‑CTCCGTCGCGAAGCTGCGGGTTTTAGAGCTAGAAAT‑3’，P6(5'U3dT1‑)：5’‑CAAAGCACCATTGG
TCACTCCGTCGCGAAGCTGCGG‑3’；一个在保守序列区域，引物设计为P7(保守gRT2+)：5’‑ACCG
AGCCTGCGTTACACTGGTTTTAGAGCTAGAAAT‑3’，P8(保守U3dT2‑)：5’‑CAAAGCACCATTGGTCAACCG
AGCCTGCGTTACACTG‑3’。sgRNA表达盒接头引物反向引物P9:5’‑CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG‑
3’和接头正向引物5’‑CGGAGGAAAATTCCATCCAC‑3’。在每个sgRNA表达盒构建反应中使用4种
引物：P9和P10各0.2μM，(P5或P7)和(P6或P8)各0.1μM。25‑28循环：94℃10s，58℃15s，68℃
20s。在扩增过程中，开头的若干循环时P9/(P6或P8)扩出P9‑(P6或P8)序列，P10/(P5或P7)
扩出(P5或P7)‑sgRNA序列。后期的循环中通过overlapping PCR产生2个片段合并的sgRNA
表达盒片段。取PCR产物1μl用H2O稀释10倍，取1μl为模板，各表达盒20‑50μl PCR(1个靶点
50μl；2个靶点各30μl)。加入1/10量每种引物组合工作液(最终浓度0.15μM)。使用适量KOD‑
Plus高保真PCR酶。扩增20循环：95℃10s，58℃15s，68℃20s。取2‑3μl电泳检查产物长度是
否符合，并估计样品的大致浓度。双元载体与sgRNA表达盒的酶切‑连接反应:10×CutSmart
Buffer(1.5μl)，10mM ATP(1.5μl)，pYLCRISPR/Cas9质粒(80ng),sgRNA表达盒混合物
(15ng)，Bsa I‑HF(10U)，T4DNA ligase(35U)，H2O补到15μl。用变温循环进行酶切连接约
10‑15循环:37℃5min；10℃5min，20℃5min；最后37℃5min。取1‑1.5μl连接产物热激转化
E.coli DH10B感受态细胞，热激后加入1ml SOC，37℃培养1.5h。涂板培养基为LB+25μg/ml
Kan,挑取阳性单克隆，用液体LB+25μg/ml Kan培养基37℃培养，并利用各靶点引物的特异
性，对特定靶点进行测序。测序正确的菌液，表明得到了插入序列正确的含有BnC04BIN2‑
like1的CRISPR/Cas9载体，命名为CRISPR‑BnC04BIN2‑like1。
TCACTCCGTCGCGAAGCTGCGG‑3’；一个在保守序列区域，引物设计为P7(保守gRT2+)：5’‑ACCG
AGCCTGCGTTACACTGGTTTTAGAGCTAGAAAT‑3’，P8(保守U3dT2‑)：5’‑CAAAGCACCATTGGTCAACCG
AGCCTGCGTTACACTG‑3’。sgRNA表达盒接头引物反向引物P9:5’‑CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG‑
3’和接头正向引物5’‑CGGAGGAAAATTCCATCCAC‑3’。在每个sgRNA表达盒构建反应中使用4种
引物：P9和P10各0.2μM，(P5或P7)和(P6或P8)各0.1μM。25‑28循环：94℃10s，58℃15s，68℃
20s。在扩增过程中，开头的若干循环时P9/(P6或P8)扩出P9‑(P6或P8)序列，P10/(P5或P7)
扩出(P5或P7)‑sgRNA序列。后期的循环中通过overlapping PCR产生2个片段合并的sgRNA
表达盒片段。取PCR产物1μl用H2O稀释10倍，取1μl为模板，各表达盒20‑50μl PCR(1个靶点
50μl；2个靶点各30μl)。加入1/10量每种引物组合工作液(最终浓度0.15μM)。使用适量KOD‑
Plus高保真PCR酶。扩增20循环：95℃10s，58℃15s，68℃20s。取2‑3μl电泳检查产物长度是
否符合，并估计样品的大致浓度。双元载体与sgRNA表达盒的酶切‑连接反应:10×CutSmart
Buffer(1.5μl)，10mM ATP(1.5μl)，pYLCRISPR/Cas9质粒(80ng),sgRNA表达盒混合物
(15ng)，Bsa I‑HF(10U)，T4DNA ligase(35U)，H2O补到15μl。用变温循环进行酶切连接约
10‑15循环:37℃5min；10℃5min，20℃5min；最后37℃5min。取1‑1.5μl连接产物热激转化
E.coli DH10B感受态细胞，热激后加入1ml SOC，37℃培养1.5h。涂板培养基为LB+25μg/ml
Kan,挑取阳性单克隆，用液体LB+25μg/ml Kan培养基37℃培养，并利用各靶点引物的特异
性，对特定靶点进行测序。测序正确的菌液，表明得到了插入序列正确的含有BnC04BIN2‑
like1的CRISPR/Cas9载体，命名为CRISPR‑BnC04BIN2‑like1。
[0060] 二、CRISPR‑BnC04BIN2‑like1转基因油菜的获得
[0061] 将步骤一构建的植物CRISPR‑BnC04BIN2‑like1载体用热激法转化农杆菌EHA105感受态细胞，将其涂布于含卡那霉素和利福平的LB抗性平板上，在28℃、150rpm下培养，挑
取长出的农杆菌单菌落再接种于含卡那霉素和利福平的20ml LB液体培养基中，在28℃、
150rpm下培养2天，然后，再按2％的接种量菌将菌液接种于含卡那霉素和利福平的300ml
LB液体培养基中，在28℃、150rpm下培养16‑18小时。培养结束后，5000rpm离心20分钟后收
集菌体，再将菌体悬浮于250ml含有5％蔗糖，0.1％Silwetl‑77的溶液中。最后，将菌液转于
250ml烧杯中，将已授粉结束的甘蓝型油菜花去掉，再将植株倒置于烧杯中，使其花序完全
侵入菌液中，为提高转化效率，一周后再重复一次。将转化植株进行常规培养，收获种子，所
得种子经卡那霉素和PCR鉴定筛选后得到BnC04BIN2‑like1转基因植株。
取长出的农杆菌单菌落再接种于含卡那霉素和利福平的20ml LB液体培养基中，在28℃、
150rpm下培养2天，然后，再按2％的接种量菌将菌液接种于含卡那霉素和利福平的300ml
LB液体培养基中，在28℃、150rpm下培养16‑18小时。培养结束后，5000rpm离心20分钟后收
集菌体，再将菌体悬浮于250ml含有5％蔗糖，0.1％Silwetl‑77的溶液中。最后，将菌液转于
250ml烧杯中，将已授粉结束的甘蓝型油菜花去掉，再将植株倒置于烧杯中，使其花序完全
侵入菌液中，为提高转化效率，一周后再重复一次。将转化植株进行常规培养，收获种子，所
得种子经卡那霉素和PCR鉴定筛选后得到BnC04BIN2‑like1转基因植株。
[0062] 三、CRISPR‑BnC04BIN2‑like1转基因植株表型观察
[0063] 将步骤二获得的CRISPR‑BnC04BIN2‑like1载体阳性转基因植株的种子种植与大田条件下，以甘蓝型油菜野生型作为对照。观察CRISPR‑BnC04BIN2‑like1载体和野生型植
株的生长情况，CRISPR‑BnC04BIN2‑like1转基因植株在自然条件下生长的表型如图6所示，
矮杆植株恢复高杆的表型。
株的生长情况，CRISPR‑BnC04BIN2‑like1转基因植株在自然条件下生长的表型如图6所示，
矮杆植株恢复高杆的表型。