裂叶独活醇提取液中香豆素类成分的分析和鉴定方法

摘要

本发明提供裂叶独活醇提取液中香豆素类成分的分析和鉴定方法，属于化学成分分析技术领域。步骤为S1：采用乙醇加热超声提取的方法提取裂叶独活药材中的有效成分，制得裂叶独活供试品溶液；称取香豆素类标准品，配制成标准品溶液；S2：将供试品溶液和标准品溶液采用超高效液相色谱‑四极杆‑飞行时间质谱方法进行检测；S3：采用PeakView1.2软件对质谱的数据进行分析，通过数据库快速筛查和二级质谱分析，从裂叶独活醇提取液快速鉴定多种香豆素类成分。本发明从裂叶独活中共分离和鉴定出32个香豆素类化合物，实现了裂叶独活香豆素较为全面和系统的分析，为香豆素类成分定性分析和裂叶独活药理研究提供基础。

权利要求

1.裂叶独活醇提取液中香豆素类成分的分析和鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：采用乙醇加热超声提取的方法提取裂叶独活药材中的有效成分，制得裂叶独活供试品溶液；称取香豆素类标准品，配制成标准品溶液；

S2：将供试品溶液和标准品溶液采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱方法进行检测；测定条件如下：色谱条件：色谱柱规格为2.1×100mm，1.7μm；柱温40℃，进样量4μL，流速0.25mL/min；

以0.1%甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B进行梯度洗脱，洗脱的程序为：0～10min，

5%～15%B；10～20min，15%～25%B；20～30min，25%～45%B；30～32min，45%～47%B；32～

35min，47%B；35～40min，47%～50%B；40～45min，50%～55%B；45～50min，55%～95%B ；50～

52min，95%B；52～52.1min，95%～5%B； 52.1～55min，5%B；

质谱条件：采用ESI电喷雾离子源，正离子模式检测；质量扫描范围m/z100～1000，喷雾电压5.5kV，离子源温度500℃，去簇电压100 V，碰撞能量45eV，碰撞能量叠加15eV，气帘气压力40psi，雾化气和辅助气压力均为50psi，数据采集时间55min，采用 TOF-MS-IDA-MS/MS 方式采集数据，IDA设置响应值超过100cps的6个最高峰进行二级质谱扫描，子离子扫描范围m/z：50～1000，满足该条件的优先进行二级扫描，开启动态背景扣除；

获得化合物的总离子流图、一级质谱信息和二级质谱信息；

S3：采用PeakView1.2软件对质谱的数据进行分析，通过数据库快速筛查和二级质谱分析，从裂叶独活醇提取液快速鉴定多种香豆素类成分。

2.根据权利要求1所述的裂叶独活醇提取液中香豆素类成分的分析和鉴定方法，其特征在于，所述步骤S1中的具体做法为：S1.1供试品贮备液的制备：将裂叶独活药材粉碎过80-120目筛，精密称取5g，按照固液比为1:10-12用体积浓度为70%的乙醇溶液浸泡20min-60min，然后加热至45-50℃，利用超声提取1-2h，随后过滤取滤液；将滤渣重复上述操作，合并2次滤液，浓缩至无醇味，得浸膏；

将浸膏用体积浓度为50%甲醇溶液定容至25mL，得供试品贮备液，4℃贮存备用；

S1.2标准品贮备液的制备：精密称取补骨脂素、东莨菪内酯、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、氧化前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯七种标准品各1mg，分别加入5mL体积浓度为

50%的甲醇溶解，制得质量浓度为200μg/mL标准品贮备液，4℃贮存备用；

S1.3供试品溶液和标准品溶液的准备：取上述供试品贮备液和标准品贮备液各1mL，分别转移至2mL离心管内，放入低温高速离心机以13000r·min-1离心8-15min，离心后分别取

0.5mL上清液于1.5mL的进样瓶内，即得裂叶独活供试品溶液和标准品溶液。

3.根据权利要求1所述的裂叶独活醇提取液中香豆素类成分的分析和鉴定方法，其特征在于，所述步骤S3中，通过数据库快速筛查和二级质谱分析，从裂叶独活醇提取液快速鉴定多种香豆素类成分的具体方法为：采用PeakView1.2软件对质谱的数据进行分析；根据国内外专业数据库Pubmed，ChemSpider，Metlin，中科院化学专业数据库及国内外裂叶独活及香豆素相关研究文献，收集香豆素类化合物名称、分子式及二级碎片信息，初步建立裂叶独活香豆素类化学成分数据库，结合软件XIC Manager功能，初步筛选出质量偏差小于5×10-6的香豆素成分，然后将筛选出的成分进一步与对照品和文献中二级碎片比较，从裂叶独活醇提物中共鉴定和推测出多种香豆素类化合物。

说明书

裂叶独活醇提取液中香豆素类成分的分析和鉴定方法

技术领域

[0001] 本发明涉及化学成分分析技术领域，具体涉及裂叶独活醇提取液中香豆素类成分的分析和鉴定方法。

背景技术

[0002] 香豆素是广泛分布于植物界中的次生代谢物质,常与生源密切的桂皮酸、黄酮类、木脂素等伴生,广泛分布于高等植物中,尤其是伞形科、芸香科、菊科、豆科、兰科、茄科、瑞香科、虎耳草科和木樨科等植物及微生物代谢产物中。香豆素具有调节植物生长、抗菌抗病毒、抗凝血、松弛平滑肌、吸收紫外线和抗辐射等多种生物活性。至今已从芸香科柑桔属植物中分离出多种香豆素类化合物。伞形科独活属植物裂叶独活Heracleum millefolium Diels，藏药名为巴木保，又有别名千叶独活、藏当归，主要分布于我国西藏、青海、甘肃、四川、云南，是一种常用藏药。裂叶独活性味辛、苦，微温，用于治疗风寒湿痹、腰膝疼痛、少阴伏风头痛、腰膝疼痛，头痛齿痛等症。其中，裂叶独活中主要的活性成分为香豆素，因此，建立一种高效快速的提取、分离纯化和鉴定裂叶独活中香豆素的方法对于深化裂叶独活的药理作用研究及完善质量控制体系均具有重要的意义。

[0003] 目前国内外对独活的研究比较多，对裂叶独活的研究相对较少。饶高雄等通过柱层析和红外分光光度法从裂叶独活乙醇提取物中分离鉴定出11个化合物，仅鉴定出6种香豆素类化学成分，目前尚缺乏对裂叶独活中香豆素类化学成分的系统研究和药理作用研究。超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用( UHPLC-Q-TOF/MS) 技术具有高分辨、高灵敏的定性分析能力和强大的结构表征能力，已广泛运用到中药化学成分分析快速分离和鉴定中。但目前对裂叶独活醇提液中香豆素类成分的分析和鉴定方法里，还没有应用该技术的相关报道，如何设定色谱和质谱的条件，同时高效分离多种香豆素类成分，并对其进行鉴定，是目前亟待解决的问题。

发明内容

[0004] 本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种裂叶独活醇提取液中香豆素类成分的分析和鉴定方法，从裂叶独活中共分离和鉴定出32个香豆素类化合物，实现了裂叶独活香豆素较为全面和系统的分析，为香豆素类成分定性分析和裂叶独活药理研究提供基础。

[0005] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

[0006] 裂叶独活醇提取液中香豆素类成分的分析和鉴定方法，包括以下步骤：

[0007] S1：采用乙醇加热超声提取的方法提取裂叶独活药材中的有效成分，制得裂叶独活供试品溶液；称取香豆素类标准品，配制成标准品溶液；

[0008] S2：将供试品溶液和标准品溶液采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱方法进行检测；

[0009] S3：采用PeakView1.2软件对质谱的数据进行分析，通过数据库快速筛查和二级质谱分析，从裂叶独活醇提取液快速鉴定多种香豆素类成分。

[0010] 本发明中，优选地，所述步骤S1中的具体做法为：

[0011] S1.1供试品贮备液的制备：将裂叶独活药材粉碎过80-120目筛，精密称取5g，按照固液比为1:10-12用体积浓度为70%的乙醇溶液浸泡20min-60min，然后加热至45-50℃，利用超声提取1-2h，随后过滤取滤液；将滤渣重复上述操作，合并2次滤液，浓缩至无醇味，得浸膏；将浸膏用体积浓度为50%甲醇溶液定容至25mL，得供试品贮备液，4℃贮存备用；

[0012] S1.2标准品贮备液的制备：精密称取补骨脂素、东莨菪内酯、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、氧化前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯七种标准品各1mg，分别加入5mL体积浓度为50%的甲醇溶解，制得质量浓度为200μg/mL标准品贮备液，4℃贮存备用；

[0013] S1.3供试品溶液和标准品溶液的准备：取上述供试品贮备液和标准品贮备液各1mL，分别转移至2mL离心管内，放入低温高速离心机以13000r·min-1离心8-15min，离心后分别取0.5mL上清液于1.5mL的进样瓶内，即得裂叶独活供试品溶液和标准品溶液。

[0014] 本发明中，优选地，所述步骤S2中，采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱方法分别对裂叶独活供试品溶液和标准品溶液进行检测，测定条件如下：

[0015] 色谱条件：色谱柱规格为2.1×100mm，1.7μm；柱温40℃，进样量4μL，流速0.25mL/min；以0.1%甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B进行梯度洗脱，洗脱的程序为：0～10min，5%～15%B；10～20min，15%～25%B；20～30min，25%～45%B；30～32min，45%～47%B；32～35min，47%B；35～40min，47%～50%B；40～45min，50%～55%B；45～50min，55%～95%B ；50～52min，95%B；52～52.1min，95%～5%B； 52.1～55min，5%B；

[0016] 质谱条件：采用ESI电喷雾离子源，正离子模式检测；质量扫描范围m/z100～1000，喷雾电压5.5kV，离子源温度500℃，去簇电压100 eV，碰撞能量45eV，碰撞能量叠加15eV，气帘气压力40psi，雾化气和辅助气压力均为50psi，数据采集时间55min，采用 TOF-MS-IDA-MS/MS 方式采集数据，IDA设置响应值超过100cps的6个最高峰进行二级质谱扫描，子离子扫描范围m/z：50～1000，满足该条件的优先进行二级扫描，开启动态背景扣除；

[0017] 获得化合物的总离子流图、一级质谱信息和二级质谱信息。

[0018] 本发明中，优选地，所述步骤S3中，通过数据库快速筛查和二级质谱分析，从裂叶独活醇提取液快速鉴定多种香豆素类成分的具体方法为：采用PeakView1.2软件对质谱的数据进行分析；根据国内外专业数据库Pubmed、ChemSpider、Metlin、中科院化学专业数据库及国内外裂叶独活及香豆素相关研究文献，收集香豆素类化合物名称、分子式及二级碎片信息，初步建立裂叶独活香豆素类化学成分数据库，结合软件XIC Manager功能，初步筛选出质量偏差小于5×10-6的香豆素成分，然后将筛选出的成分进一步与对照品和文献中二级碎片比较，从裂叶独活醇提物中共鉴定和推测出多种香豆素类化合物。

[0019] 综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：本发明采用UHPLC-Q-TOF/MS，通过对色谱条件和质谱条件的优化，在正离子模式下建立了一种可同时高效分离多种香豆素类成分的方法，通过数据库快速筛查和二级质谱分析，从裂叶独活醇提取液快速鉴定出32种香豆素类成分，该方法具有快速、灵敏及高分辨率等优点，可作为裂叶独活质量控制的方法之一，同时也为裂叶独活药效物质基础研究及临床药学研究提供重要参考。

附图说明

[0020] 图1正离子模式下对照品总离子流图。

[0021] 图2 裂叶独活醇提取物正离子模式下总离子流图。

[0022] 图3 补骨脂素可能裂解途径及MS/MS。

[0023] 图4 佛手柑内酯可能裂解途径及MS/MS。

[0024] 图5 氧化前胡素可能裂解途径及MS/MS。

具体实施方式

[0025] 为了更清楚地表达本发明，以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。

[0026] 一、仪器与材料。

[0027] 1.1 仪器： TripleTOF 5600 型高分辨质谱仪 (美国 AB SCIEX 公司) ；LC-30AD 型超高效液相色谱仪(日本岛津公司)；TGL-16B型低温高速离心机（上海安亭科学仪器公司）；BT-125D型电子天平（德国Sartorius公司）；SZ-93型自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)；Milli-Q Synthesis超纯水纯化系统（美国Millipore公司产品）；KQ-3200DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；DZTW调温电热套（北京市永光明医疗仪器有限公司）；水为超纯水，甲醇、乙腈为质谱纯（美国 ACS 公司）；甲酸为质谱纯（美国Thermo Fisher公司）；其他试剂均为分析纯（西陇化工股份有限公司）。

[0028] 1.2 材料：补骨脂素（批号：FY1031B1332）、东莨菪内酯（批号：FY1155B4449）、佛手柑内酯（批号：FY1232B1304）、欧前胡素（批号：FY1495B1859）、蛇床子素（批号：110822-201308）、氧化前胡素（FY2856B1050）、二氢欧山芹醇当归酸酯（批号：FY1223B2424）对照品购自中国食品药品鉴定研究院和南通飞宇生物科技有限公司。裂叶独活药材采购于西藏山南地区贡嘎县岗堆镇，由江西中医药大学药学院龚千锋教授鉴定。

[0029] 二、裂叶独活醇提取液中香豆素类化学成分的分析和鉴定方法。

[0030] 实施例1

[0031] 本实施方式中，裂叶独活醇提取液中香豆素类成分的分析和鉴定方法，包括以下步骤：

[0032] S1：采用乙醇加热超声提取的方法提取裂叶独活药材中的有效成分，制得裂叶独活供试品溶液；称取香豆素类标准品，配制成标准品溶液；具体步骤为：

[0033] S1.1供试品贮备液的制备：将裂叶独活药材粉碎过120目筛，精密称取5g，按照固液比为1:10用体积浓度为70%的乙醇溶液浸泡20min，然后加热至45℃，利用超声提取1h，随后过滤取滤液；将滤渣重复上述操作，合并2次滤液，浓缩至无醇味，得浸膏；将浸膏用体积浓度为50%甲醇溶液定容至25mL，得供试品贮备液，4℃贮存备用；

[0034] S1.2标准品贮备液的制备：精密称取补骨脂素、东莨菪内酯、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、氧化前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯七种标准品各1mg，分别加入5mL体积浓度为50%的甲醇溶解，制得质量浓度为200μg/mL标准品贮备液，4℃贮存备用；

[0035] S1.3供试品溶液和标准品溶液的准备：取上述供试品贮备液和标准品贮备液各-11mL，分别转移至2mL离心管内，放入低温高速离心机以13000r·min 离心8min，离心后分别取0.5mL上清液于1.5mL的进样瓶内，即得裂叶独活供试品溶液和标准品溶液；

[0036] S2：将供试品溶液和标准品溶液采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱方法进行检测；

[0037] 色谱条件：色谱柱规格为2.1×100mm，1.7μm；柱温40℃，进样量4μL，流速0.25mL/min；以0.1%甲酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B进行梯度洗脱，洗脱的程序为：0～10min，5%～15%B；10～20min，15%～25%B；20～30min，25%～45%B；30～32min，45%～47%B；32～35min，47%B；35～40min，47%～50%B；40～45min，50%～55%B；45～50min，55%～95%B ；50～52min，95%B；52～52.1min，95%～5%B； 52.1～55min，5%B；

[0038] 质谱条件：采用ESI电喷雾离子源，正离子模式检测；质量扫描范围m/z100～1000，喷雾电压5.5kV，离子源温度500℃，去簇电压100 eV，碰撞能量45eV，碰撞能量叠加15eV，气帘气压力40psi，雾化气和辅助气压力均为50psi，数据采集时间55min，采用 TOF-MS-IDA-MS/MS 方式采集数据，IDA设置响应值超过100cps的6个最高峰进行二级质谱扫描，子离子扫描范围m/z：50～1000，满足该条件的优先进行二级扫描，开启动态背景扣除；

[0039] 质谱分析完毕后，获得化合物的总离子流图、一级质谱信息和二级质谱信息；

[0040] S3：采用PeakView1.2软件对质谱的数据进行分析，通过数据库快速筛查和二级质谱分析，从裂叶独活醇提取液快速鉴定多种香豆素类成分。具体是：采用PeakView1.2软件对质谱的数据进行分析；根据国内外专业数据库Pubmed、ChemSpider、Metlin、中科院化学专业数据库及国内外裂叶独活及香豆素相关研究文献，收集香豆素类化合物名称、分子式及二级碎片信息，初步建立裂叶独活香豆素类化学成分数据库，结合软件XIC Manager功能，初步筛选出质量偏差小于5×10-6的香豆素成分，然后将筛选出的成分进一步与对照品和文献中二级碎片比较，从裂叶独活醇提物中共鉴定和推测出多种香豆素类化合物。

[0041] 实施例2

[0042] 本实施方式中，裂叶独活醇提取液中香豆素类成分的分析和鉴定方法，包括以下步骤：

[0043] S1：采用乙醇加热超声提取的方法提取裂叶独活药材中的有效成分，制得裂叶独活供试品溶液；称取香豆素类标准品，配制成标准品溶液；具体步骤为：

[0044] S1.1供试品贮备液的制备：将裂叶独活药材粉碎过80目筛，精密称取5g，按照固液比为1:12用体积浓度为70%的乙醇溶液浸60min，然后加热至50℃，利用超声提取2h，随后过滤取滤液；将滤渣重复上述操作，合并2次滤液，浓缩至无醇味，得浸膏；将浸膏用体积浓度为50%甲醇溶液定容至25mL，得供试品贮备液，4℃贮存备用；

[0045] S1.2标准品贮备液的制备：精密称取补骨脂素、东莨菪内酯、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、氧化前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯七种标准品各1mg，分别加入5mL体积浓度为50%的甲醇溶解，制得质量浓度为200μg/mL标准品贮备液，4℃贮存备用；

[0046] S1.3供试品溶液和标准品溶液的准备：取上述供试品贮备液和标准品贮备液各-11mL，分别转移至2mL离心管内，放入低温高速离心机以13000r·min 离心15min，离心后分别取0.5mL上清液于1.5mL的进样瓶内，即得裂叶独活供试品溶液和标准品溶液；

[0047] S2：将供试品溶液和标准品溶液采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱方法进行检测；

[0048] 色谱条件和质谱条件与实施例1相同。质谱分析完毕后，获得化合物的总离子流图、一级质谱信息和二级质谱信息；

[0049] S3：采用PeakView1.2软件对质谱的数据进行分析，通过数据库快速筛查和二级质谱分析，从裂叶独活醇提取液快速鉴定多种香豆素类成分。具体是：采用PeakView1.2软件对质谱的数据进行分析；根据国内外专业数据库Pubmed、ChemSpider、Metlin、中科院化学专业数据库及国内外裂叶独活及香豆素相关研究文献，收集香豆素类化合物名称、分子式及二级碎片信息，初步建立裂叶独活香豆素类化学成分数据库，结合软件XIC Manager功能，初步筛选出质量偏差小于5×10-6的香豆素成分，然后将筛选出的成分进一步与对照品和文献中二级碎片比较，从裂叶独活醇提物中共鉴定和推测出多种香豆素类化合物。

[0050] 三．化合物质谱分析和鉴定。

[0051] （一）香豆素类化合物裂解规律分析

[0052] 补骨脂素、东莨菪内酯、佛手柑内酯、欧前胡素、蛇床子素、氧化前胡素、二氢欧山芹醇当归酸酯七种标准品总离子流图见图1，裂叶独活提取物总离子流图见图2。本发明以多种香豆素标准品为参照，并以补骨脂素为例解析香豆素类化合物的裂解规律，见图3，补+骨脂素正离子模式下得到准分子离子187[M+H] ，一方面，通过脱去吡喃环上的CO形成159[M+H-CO]+碎片离子，然后连续脱去CO，先后形成131[M+H-2CO]+和103[M+H-3CO]+；另一方面，也可通过脱去吡喃环上的CO2，形成143[M+H-CO2]+，此离子继续脱掉呋喃环上的CO产生
115[M+H-CO2-CO]+。同理可推测，佛手柑内酯通过先脱去侧链上的甲基，后连续脱去CO，形成
202、174、146等碎片离子，也可直接脱去CO，形成189、161等碎片离子，参见图4；氧化前胡素先脱去侧链基团（C5H8O），形成碎片离子203[M+H-C5H8O]+，此离子继续脱去吡喃环上的CO2或呋喃环上的CO形成159、131、175、147等碎片离子，参见图5。根据香豆素类化合物的上述裂解规律，结合质荷比、保留时间、特征碎片离子以及相关文献报道，从裂叶独活提取物中共鉴定出32种香豆素类成分（详细信息见表1）。

[0053]

[0054]

[0055]

[0056]

[0057]

[0058]

[0059] （二）各化合物的具体的鉴定方法如下：

[0060] 对照品香豆素成分鉴定 化合物3、12、16、21、25、27、30分别与东莨菪内酯，补骨脂素，佛手柑内酯，氧化前胡素，欧前胡素，蛇床子素，二氢欧山芹醇当归酸酯七种香豆素对照品保留时间和碎片离子一致，故分别被鉴定为这七种香豆素，见图2。

[0061] 同分异构体香豆素成分鉴定 化合物13与补骨脂素具有相同的分子量和碎片离子，保留时间相近，且极性较补骨脂素小，故被鉴定为异补骨脂素。化合物14、20与佛手柑内酯分子量及碎片离子相同，故被鉴定为同分异构体，根据文献报道，佛手柑内酯有花椒毒素和异佛手柑内酯两种同分异构体，且花椒毒素极性最大，异佛手柑内酯极性最小，故根据保留时间，化合物14、20分别被鉴定为花椒毒素和异佛手柑内酯。化合物8、19与氧化前胡素具有相同的分子量和相似的离子碎片，根据文献报道，栓翅芹烯醇和异氧化前胡素为氧化前胡素的两种同分异构体，且栓翅芹烯醇极性较异氧化前胡素极性大，因此化合物8、19分别被鉴定为栓翅芹烯醇和异氧化前胡素。化合物23、29与欧前胡素具有相同的分子量和碎片离子，故被鉴定为同分异构体，根据文献报道，欧前胡素有异欧前胡素和别异欧前胡素两种同分异构体，且别异欧前胡素极性最大，异欧前胡素极性最小，故根据保留时间，化合物23、29分别被鉴定为别异欧前胡素和异欧前胡素。

[0062] 侧链基团异构香豆素类成分鉴定  化合物1相对分子质量为162.0317，较东莨菪内酯少30 Da，其主要碎片离子145 [M+H-H2O]+、135 [M+H-CO]+、117 [M+H-CO-H2O]+裂解方式与东莨菪内酯相似，少丢失一个甲基或甲氧基而产生，故推测化合物1是在东莨菪内酯基础上减少一个甲氧基构成，伞形花内酯符合上述推测。化合物7相对分子质量为202.0266Da，较佛手柑内酯少14Da，其碎片离子及裂解方式与佛手柑内酯相似，都少丢失一个甲基，且极性较佛手柑内酯大，故推测其结构较佛手柑内酯少一个甲基，花椒毒醇符合上述推测。化合物18相对分子质量为246.0528，较佛手柑内酯多30Da，其碎片离子232 [M+H-CH3]+、189 [M+H-2CH3-CO]+、171 [M+H-CH3-CH3O-CO]+与佛手柑内酯裂解方式相似，推测其可能通过多丢失侧链上的甲基或甲氧基而产生，故推测化合物18是在佛手柑内酯基础上增加甲氧基构成，异茴芹内酯符合上述推测。化合物26相对分子质量为300.0998 Da，较欧前胡素多30Da，其主要碎片离子233[M+H-C5H8]+、218[M+H-C5H8-CH3]+ 、202[M+H-C5H8-CH3O]+，推测其可能分别通过丢失欧前胡素相同侧链基团（C5H8）和甲氧基而产生，因此推测化合物
26是在欧前胡素结构基础上增加甲氧基构成，珊瑚菜素符合上述推测。

[0063] 其他香豆素类成分鉴定  化合物5、10、15、17、31相对分子质量、碎片离子和保留时间顺序与文献一致，故被鉴定为对应的香豆素类化合物。化合物32主要碎片离子203 [M+H-C10H16]+、185 [M+H-C10H16-H2O]+、175 [M+H- C10H16-CO]+、159 [M+H-C10H16-CO2]+、147[M+H-C10H16-2CO]+先通过断裂侧链（C10H16）形成碎片离子m/z 203.0332，后脱水形成碎片离子m/z 185.0229，也极易脱去吡喃环上的一分子CO产生m/z 175.0386，呋喃环上的一分子CO2产生159.0439，故鉴定化合物32为佛手柑素。

[0064] 化合物2准分子离子峰m/z 355.1033，在二级质谱图中呈现193[M+H-C6H10O5]+、178[M+H-C6H10O5-CH3]+、165[M+H-C6H10O5-CO]+、150[M+H-C6H10O5-CH3-CO]+等碎片离子。其中，碎片离子m/z 193.0493为准分子离子中性丢失一分子葡萄糖产生，其他碎片离子m/z 178.0261、m/z 165.0545、m/z 150.0312与东莨菪内酯碎片离子相同，结合相关文献，鉴定化合物2为东莨菪苷。

[0065] 化合物4和化合物6相对分子质量相同，互为同分异构体，准分子离子峰为m/z 247.0962，主要碎片离子m/z 229、187、159、131与二氢欧山芹醇当归酸酯相同，相对分子质量少82 Da，推测可能是侧链连接的C5H8O2脂肪酸酯键断裂，中性丢失C5H6O得到，二氢欧山芹醇和异紫花前胡内酯符合上述推测。结合相关文献，二氢欧山芹醇极性更大，化合物4和化合物6分别鉴定为二氢欧山芹醇和异紫花前胡内酯。

[0066] 化合物9准分子离子峰为m/z 305.1022，较氧化前胡素多18Da，其碎片离子203[M+H-C5H10O2]+、175[M+H-C5H10O2-CO]+ 、159[M+H-C5H10O2-CO2]+ 、147[M+H-C5H10O2-2CO] +与氧化前胡素裂解方式相似，推测化合物9是在氧化前胡素基础上增加一个羟基构成，水合氧化前胡素符合上述推测。

[0067] 化合物11准分子离子峰为m/z 317.1028，C-8位取代基发生氢重排，失去中性分子C5H8O形成m/z 233碎片离子，m/z 233离子进一步丢失甲基产生m/z 218离子，其碎片方式与花椒毒素和佛手柑内酯一致，m/z 218离子连续丢失羰基形成m/z 190、162、134等碎片离子，结合文献，鉴定化合物11为白当归脑。

[0068] 化合物22准分子离子峰为m/z 231.1013，主要碎片离子187[M+H-C2H4O] +、175[M+H-2CO] +、147[M+H-C5H8O] +、119[M+H-C5H8O-CO] +、91[M+H-C5H8O-2CO] +与文献欧前胡素酚碎片离子一致，故鉴定化合物22为欧前胡素酚。

[0069] 化合物24准分子离子峰为m/z 203.0337，与花椒毒醇具有相同的分子量和碎片离子，且极性比花椒毒醇小，准分子离子通过连续脱去CO产生175[M+H-CO] +、147[M+H-2CO] +、 119[M+H-3CO] +等碎片离子，脱去1分子CO2 产生159[M+H-CO2] +碎片离子，结合相关文献，鉴定化合物24为佛手酚。

[0070] 化合物28准分子离子峰为m/z 329.1388，相对分子质量与二氢欧山芹醇当归酸酯相同，主要碎片离子247[M+H-C5H6O] +、229[M+H-C5H6O-H2O] +、213[M+H-C5H6O-H2O-CH4] +、185[M+H-C5H6O-H2O-CO2] +都是先中性丢失C5H6O，再丢失CO2和H2O得到，结合相关文献，鉴定化合物28为紫花前胡素。

[0071] 本发明在正离子模式下，采用UHPLC-Q-TOF/MS对裂叶独活中的香豆素类化合物进行分离鉴定，一共鉴定出32种化合物，其中24个未在以往文献中报道，为裂叶独活进一步的化学成分、药理研究及定量研究提供了一定的参考，有利于裂叶独活的开发与利用。

[0072] 上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。