PD-1封闭剂及其应用

摘要

本发明提供了PD‑1封闭剂及其应用，属于医学及生物化学技术领域，所述PD‑1封闭剂具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。本发明提供的PD‑1封闭剂可有效结合PBMC细胞上的PD‑1，阻断PD‑1与PDL1的结合，实现对PBMC细胞的封闭，抑制免疫检测点的活性，释放肿瘤微环境中的免疫刹车，提高免疫细胞对肿瘤的杀伤作用，从而达到抗肿瘤的作用。

权利要求

1.PD-1封闭剂，其特征在于，所述PD-1封闭剂的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的PD-1封闭剂在制备封闭PBMC的药物中的应用。

3.权利要求1所述的PD-1封闭剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肺癌、乳腺癌、结直肠癌或脑胶质瘤。

5.权利要求1所述的PD-1封闭剂在制备提高T细胞对肿瘤细胞杀伤作用的药物中的应用。

说明书

PD-1封闭剂及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于医学及生物化学技术领域，尤其涉及PD-1封闭剂及其应用。

背景技术

[0002] PD-1(programmed cell deathprotein-1，程序性死亡受体)是重要的抑制性信号分子，通过与其两个配体PD-L1(B7-H1/CD274)和PD-L2(B7-DC/CD273)的作用而抑制T细胞的活化及细胞因子的产生，在维持机体的外周耐受上发挥至关重要的作用。

[0003] 免疫检查点本是人体免疫系统中起保护作用的分子，起类似刹车的作用，防止T细胞过度激活导致的炎症损伤等。而肿瘤细胞利用人体免疫系统这一特性，通过过度表达免疫检查点分子(如PD-L1)，通过与淋巴细胞上的PD-1结合，抑制包括T细胞在内的淋巴细胞发挥抗肿瘤能力，从而抑制人体免疫系统反应，逃脱人体免疫监视与杀伤，最终导致肿瘤细胞的生长和转移不受免疫系统的监控。

[0004] 在细胞水平研究包括T细胞在内的淋巴细胞的免疫功能时，其抗肿瘤能力也受免疫检查点的抑制，至使无法评价其对肿瘤细胞的真实杀伤效果，因此，快速高效的解决抑制性信号分子的问题，是影响所有淋巴细胞免疫功能的评价的环节。但是现有技术中还未有公开蛋白来阻断PD-1和PDL1的结合。

发明内容

[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供PD-1封闭剂及其应用，本发明提供的PD-1封闭剂可有效结合PBMC细胞上的PD-1，阻断PD-1与PDL1的结合，实现对PBMC细胞的封闭，抑制免疫检测点的活性，释放肿瘤微环境中的免疫刹车，提高免疫细胞对肿瘤的杀伤作用，从而达到抗肿瘤的作用。

[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

[0007] 本发明提供了PD-1封闭剂，所述PD-1封闭剂具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。

[0008] 本发明还提供了上述技术方案所述的PD-1封闭剂在制备对PBMC细胞封闭的药物中的应用。

[0009] 优选的，所述封闭的pH值为5.8～8.0。

[0010] 优选的，所述封闭的温度为25～37℃。

[0011] 优选的，所述封闭的时间为1～2h。

[0012] 优选的，所述PD-1封闭剂在32～500μg/mL的浓度下进行封闭。

[0013] 本发明还提供了上述技术方案所述的PD-1封闭剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

[0014] 优选的，所述肿瘤包括肺癌、乳腺癌、结直肠癌或脑胶质瘤。

[0015] 本发明还提供了上述技术方案所述的PD-1封闭剂在制备提高免疫细胞对肿瘤细胞杀伤作用的药物中的应用。

[0016] 优选的，所述免疫细胞包括T细胞。

[0017] 本发明提供了PD-1封闭剂及其应用，所述PD-1封闭剂具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。本发明提供的PD-1封闭剂可有效结合PBMC细胞上的PD-1，阻断PD-1与PDL1的结合，实现对PBMC细胞的封闭，抑制免疫检测点的活性，释放肿瘤微环境中的免疫刹车，提高免疫细胞对肿瘤的杀伤作用，从而达到抗肿瘤的作用。

附图说明

[0018] 图1为PD-1和PDL1的三位互作图；

[0019] 图2为PD-1封闭剂的标记效果检测图；

[0020] 图3-1为流式检测CD8+、CD4+细胞上PD-1+的细胞比例(Day 0)；

[0021] 图3-2为流式检测CD8+、CD4+细胞上PD-1+的细胞比例(Day 3)；

[0022] 图3-3为流式检测CD8+、CD4+细胞上PD-1+的细胞比例(Day 7)；

[0023] 图3-4为流式检测CD8+、CD4+细胞上PD-1+的细胞比例(Day 10)；

[0024] 图3-5为流式检测CD8+、CD4+细胞上PD-1+的细胞比例(Day 14)；

[0025] 图4-1为流式检测PBMC与肿瘤细胞共培养时CD8+细胞上PD-1+的比例(Day 3)[0026] 图4-2为流式检测PBMC与肿瘤细胞共培养时CD8+细胞上PD-1+的比例(Day 10)[0027] 图4-3为流式检测PBMC与肿瘤细胞共培养时CD8+细胞上PD-1+的比例(Day 14)；

[0028] 图4-4为流式检测PBMC与肿瘤细胞共培养时CD4+细胞上PD-1+的比例(Day 3)；

[0029] 图4-5为流式检测PBMC与肿瘤细胞共培养时CD4+细胞上PD-1+的比例(Day 10)；

[0030] 图4-6为流式检测PBMC与肿瘤细胞共培养时CD4+细胞上PD-1+的比例(Day 14)；

[0031] 图5-1为PD-1封闭剂在pH 5.8缓冲体系中与PBMC结合的情况(0、32、64μg/mL)；

[0032] 图5-2为PD-1封闭剂在pH 5.8缓冲体系中与PBMC结合的情况(125、250、500μg/mL)；

[0033] 图6-1为PD-1封闭剂在pH 6.6缓冲体系中与PBMC结合的情况(0、32、64μg/mL)；

[0034] 图6-2为PD-1封闭剂在pH 6.6缓冲体系中与PBMC结合的情况(125、250、500μg/mL)；

[0035] 图7-1为PD-1封闭剂在pH 6.8缓冲体系中与PBMC结合的情况(0、32、64μg/mL)；

[0036] 图7-2为PD-1封闭剂在pH 6.8缓冲体系中与PBMC结合的情况(125、250、500μg/mL)；

[0037] 图8-1为PD-1封闭剂在pH 7.2缓冲体系中与PBMC结合的情况(0、32、64μg/mL)；

[0038] 图8-2为PD-1封闭剂在pH 7.2缓冲体系中与PBMC结合的情况(125、250、500μg/mL)；

[0039] 图9-1为PD-1封闭剂在pH 7.4缓冲体系中与PBMC结合的情况(0、32、64μg/mL)；

[0040] 图9-2为PD-1封闭剂在pH 7.4缓冲体系中与PBMC结合的情况(125、250、500μg/mL)；

[0041] 图10-1为PD-1封闭剂在pH 8.0缓冲体系中与PBMC结合的情况(0、32、64μg/mL)；

[0042] 图10-2为PD-1封闭剂在pH 8.0缓冲体系中与PBMC结合的情况(125、250、500μg/mL)；

[0043] 图11为pH值降低对已结合的PD-1抗体模拟物的影响；

[0044] 图12-1为pH 6.6结合稳定性分析-室温1h(0、32、64μg/mL)；

[0045] 图12-2为H 6.6结合稳定性分析-室温1h(125、250、500μg/mL)；

[0046] 图13-1为pH 6.8结合稳定性分析-室温1h(0、32、64μg/mL)；

[0047] 图13-2为H 6.8结合稳定性分析-室温1h(125、250、500μg/mL)；

[0048] 图14为pH 7.2结合稳定性分析(500μg/mL)；

[0049] 图15为pH 8.0结合稳定性分析(500μg/mL)；

[0050] 图16为细胞因子刺激对肿瘤细胞PD-L1的表达水平的影响；

[0051] 图17为台风扫描仪检测的荧光信号；

[0052] 图18为台风扫描仪检测的荧光信号；

[0053] 图19为台风扫描仪检测的荧光信号；

[0054] 图20-1为25℃封闭1h的情况(20.8、41.7μg/mL)；

[0055] 图20-2为25℃封闭1h的情况(83.3、166.7μg/mL)；

[0056] 图20-3为25℃封闭1h的情况(333.3μg/mL)；

[0057] 图21-1为25℃封闭2h的情况(20.8、41.7μg/mL)；

[0058] 图21-2为25℃封闭2h的情况(83.3、166.7μg/mL)；

[0059] 图21-3为25℃封闭2h的情况(333.3μg/mL)；

[0060] 图22-1为37℃封闭1h的情况(20.8、41.7μg/mL)；

[0061] 图22-2为37℃封闭1h的情况(83.3、166.7μg/mL)；

[0062] 图22-3为37℃封闭1h的情况(333.3μg/mL)；

[0063] 图23为杀伤效率检测-流式检测细胞凋亡(肺癌细胞H358)；

[0064] 图24为杀伤效率检测-LDH(脑胶质瘤细胞-U87)；

[0065] 图25为杀伤效率检测-LDH(结肠癌细胞-SW480)；

[0066] 图26为杀伤效率检测-LDH(结直肠癌细胞-DLD-1)；

[0067] 图27为杀伤效率检测-LDH(乳腺癌癌细胞-SK-BR3)。

具体实施方式

[0068] 本发明提供了PD-1封闭剂，所述PD-1封闭剂具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，具体如下所示：

[0069] ALIVYWEMEDKNIIQFVKFPVEKQLDLAKLQDAGVYRCMISYGGADAAAITVKVNA。

[0070] 在本发明中 ，所述KFPVEKQLDLA将ALIVYWEMEDKNIIQFV和KLQDAGVYRCMISYGGADAAAITVKVNA连接。在本发明中，所述PD-1封闭剂由金斯瑞生物技术有限公司多肽合成部进行合成，纯度为98％。

[0071] 本发明PD-1封闭剂的设计思路为：根据PD-1和PD-L1互作的三位结构，图1，可以确定PD-1和PD-L1的结合区域，SEQ ID No.2～3，SEQ ID No.2：ALIVYWEMEDKNIIQFV，SEQ ID No.3：KLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNA，将这两个序列，以loop序列相连，SEQ ID No.4：KFPVEKQLDLA，并将SEQ ID No.3中的YKR改成AAA，以避免功能性结合，获得阻断蛋白发生免疫检查点抑制作用，即为PD-1封闭剂。

[0072] 本发明还提供了上述技术方案所述的PD-1封闭剂在制备对PBMC细胞封闭的药物中的应用。本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，采用PD-1封闭剂在医学上可接受的剂型即可。本发明对所述药物中使用的辅料的种类和用量没有特殊限定，采用PD-1封闭剂在医学上可接受的种类即可，采用常规辅料的用量即可。本发明对药物中PD-1封闭剂的含量没有特殊限定，采用常规药物中活性物质的含量即可。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限定，采用常规制备方法即可。

[0073] 在本发明中，所述封闭的pH值优选为5.8～8.0，具体包括5.8、6.6、6.8、7.2、7.4和8.0。

[0074] 在本发明中，所述封闭的时间优选为1～2h，所述封闭的温度优选为25～37℃，当所述封闭的温度为25℃时，封闭的时间为2h；当所述封闭的温度为37℃时，封闭的时间为1h。

[0075] 在本发明中，所述PD-1封闭剂优选在32～500μg/mL的浓度下进行封闭，所述浓度具体包括32μg/mL、64μg/mL、125μg/mL、250μg/mL和500μg/mL。

[0076] 本发明还提供了上述技术方案所述的PD-1封闭剂在制备抗肿瘤药物中的应用。在本发明中，所述肿瘤优选包括肺癌。本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，采用PD-1封闭剂在医学上可接受的剂型即可。本发明对所述药物中使用的辅料的种类和用量没有特殊限定，采用PD-1封闭剂在医学上可接受的种类即可，采用常规辅料的用量即可。本发明对药物中PD-1封闭剂的含量没有特殊限定，采用常规药物中活性物质的含量即可。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限定，采用常规制备方法即可。

[0077] 本发明还提供了上述技术方案所述的PD-1封闭剂在制备提高免疫细胞对肿瘤细胞杀伤作用的药物中的应用。在本发明中，所述免疫细胞优选包括T细胞。本发明对所述药物的剂型没有特殊限定，采用PD-1封闭剂在医学上可接受的剂型即可。本发明对所述药物中使用的辅料的种类和用量没有特殊限定，采用PD-1封闭剂在医学上可接受的种类即可，采用常规辅料的用量即可。本发明对药物中PD-1封闭剂的含量没有特殊限定，采用常规药物中活性物质的含量即可。本发明对所述药物的制备方法没有特殊限定，采用常规制备方法即可。

[0078] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0079] 实施例1

[0080] 1.PD-1封闭剂

[0081] 根据PD-1和PD-L1互作的三位结构，图1，可以确定PD-1和PD-L1的结合区域，SEQ ID  No .2～3，SEQ  ID  No.2：ALIVYWEMEDKNIIQFV，SEQ  ID  No.3：KLQDAGVYRCMISYGGADYKRITVKVNA，将这两个序列，以loop序列相连，SEQ ID No.4：
KFPVEKQLDLA，并将SEQ ID No.3中的YKR改成AAA，以避免功能性结合，获得阻断蛋白发生免疫检查点抑制作用，即为PD-1封闭剂，SEQ ID No.1：

[0082] ALIVYWEMEDKNIIQFVKFPVEKQLDLAKLQDAGVYRCMISYGGADAAAITVKVNA；PD-1封闭剂由金斯瑞生物技术有限公司多肽合成部进行合成，纯度98％。

[0083] 2.PD-1封闭剂的荧光标记

[0084] 1)荧光标记试剂盒：Alexa 647Protein Labeling Kit(A20173)

[0085] 2)准备1M NaHCO3：1mL的H2O加入Component B，充分溶解混匀，4℃保存两周内使用；

[0086] 3)用0.1MNaHCO3将PD-1封闭剂稀释成2mg/mL；

[0087] 4)室温预热一瓶活性染料，将0.5mL 2mg/mL蛋白溶液加入至活性染料瓶中，瓶中有磁力搅拌子。盖上盖子后，颠倒混匀至完全溶解，不要起泡沫，室温搅拌1h。

[0088] 5)按说明书安装柱子，垂直放置，柱子顶端安装漏斗，将柱子慢慢穿过X固定夹，再安装到泡沫固定架上，小心移除底部盖子；

[0089] 6)10*洗脱液储存液(component)室温预热，至完全溶解，稀释10倍备用；

[0090] 7)用提供的移液器彻底搅拌纯化树脂(component C)，确保均匀悬浮；将树脂移至柱子，使多余的buffer流尽。树脂高度，距顶部3cm。

[0091] 8)以1×PBS检测溶液流动情况，流干多余液体，确保buffer连贯流出，如果不连贯，或者过慢，重新装柱子。上样前，将漏斗移除，小心将标记的蛋白转移至柱子。使得混合物进入树脂。用约100μL洗脱液漂洗反应瓶，加入柱子上。

[0092] 9)装回漏斗，缓慢加入洗脱液，不要破坏柱子表面，持续加入洗脱液至蛋白洗出。

[0093] 10)大约30min，收集所有洗脱液。

[0094] 11)纯化过程中，会看到两条彩色的线，以区分标记的蛋白和多余的染料，用收集管收集第一条颜色的带，含有标记蛋白。

[0095] 12)标记的蛋白样品，取20μL加入20μLPBS稀释2倍，分别加入10μL含β-巯基乙醇的Loading buffer和不含β-巯基乙醇的Loading buffer，煮沸5min，12000rpm离心5min，取5μL上样；两块平行胶，一块用于考染，一块用于荧光信号的检测；荧光信号以台风荧光扫描仪进行分析。

[0096] 3.PBMC上PD-1位点的检测

[0097] 1)取5×106个PBMC细胞，2000rpm离心5min，细胞用0.5mL PBS洗一次，再以500μLPBS重悬，分100μL/管，分别标记为CK-(阴性对照)、CD8(CD8单染管)、CD4(CD4单染)、PD-1抗体(单染)、test(CD8抗体、CD4抗体和PD-1抗体)；

[0098] 2)在CD8管和test管中加入10μL PE-CD8抗体，在CD4管和test管和10μLPerCP-CD4抗体，避光孵育30min；

[0099] 3)再加入800μL PBS，2000rpm离心10min，再以800μL PBS洗一次，最后重悬于500μLPBS中备用。

[0100] 4)以流式细胞仪检测PBMC中CD8+、CD4+和PD-1+细胞的比例。

[0101] 4.PBMC上PD-1的体外封闭

[0102] 1)1000rpm离心5min，收集PBMC

[0103] 2)以PBS洗一次，1000rpm离心5min，以OKM-200+5％FBS重悬PBMC，并调整至1×107/mL；

[0104] 3)加入PD-1封闭剂，终浓度为150μg/mL，37℃5％CO2封闭1h(可达到80％以上的封闭效率)；也可以在0.9％的NaCl(生理盐水)中，进行封闭。

[0105] 5.PD-1封闭剂体外封闭稳定性分析

[0106] 1)取2×106个细胞，2000rpm离心5min，细胞用1mL PBS洗一次，再以150μLPBS重选，加入50μL 1mg/mL的荧光标记的PD-1封闭剂(封闭体系：25μg/106个细胞，100μL体系)，室温避光孵育2h，再加入800μL PBS，2000rpm离心10min，再以1mL PBS洗一次，最后以265μL PBS重悬计数备用；

[0107] 2)H358细胞提前48h复苏，复苏24h后，取10mL H358加入终浓度为10ng/mL的INF-γ和25ng/mL的TNF-α，刺激24h后，离心收集细胞，PBS洗一次后，少量PBS重悬计数备用；

[0108] 3)封闭的淋巴细胞和肿瘤细胞以1:1的比例，进行混合，室温避光2h，再加入800μLPBS，2000rpm离心10min，再以1mL PBS洗一次，最后以20μL 1×Loading buffer重悬，将全部样品进行SDS-PAGE分析，以台风荧光扫描仪检测荧光信号。

[0109] 6.PD-1封闭剂体外封闭对PBMC的杀伤功能的影响-细胞凋亡法

[0110] 1)靶细胞处理：提前一天进行靶细胞处理，H358以胰酶消化，加入1640+10％FBS终止反应，1000rpm离心5min；以1640重悬细胞，细胞数<107个/mL，加入5μL 2mM CFSE，避光静止20min；加入1640+10％FBS终止反应，1000rpm离心5min，再加入少量1640+10％FBS静止10min，1000rpm离心5min，以PBS洗一次，1000rpm离心5min；最后以1640+10％FBS(H358)重悬细胞，计数，调整至2×105个/mL，每孔500μL(24空板)，37℃培养，使其贴壁；

[0111] 2)效应细胞处理：T细胞300g离心5min收集细胞，再以PBS洗一次，以OKM200+5％FBS重悬，<1×107/mL；

[0112] 3)加入PD-1封闭剂，终浓度为200μg/mL，37℃封闭1h；

[0113] 4)加入PBS，300g离心5min去除多余抗体，以1640+2％FBS重悬细胞，最后将细胞调整至4×107个/mL，每孔加入100μL(24空板)，最终体积为300μL，37℃5％CO2培养箱继续培养至3.5h；

[0114] 5)以1.5mL EP管收集细胞，并以胰酶消化贴壁的细胞，2000rpm离心10min，以PBS洗一次；

[0115] 6)弃上清，以100μLPBS重悬细胞，分别加入5μLAnnexinV或7AAD进行单染，或同时加入5μLAnnexinV和5μL 7AAD，避光30min；

[0116] 7)以1mLPBS洗2次，最后以500μL PBS重悬细胞，进行流式检测。

[0117] 7.PD-1封闭剂体外封闭对PBMC的杀伤功能的影响-LDH法

[0118] 1)取靶细胞，用细胞刮刀轻轻将细胞刮下，10mL PBS洗涤，收集到离心管中，1000rpm，5min离心后弃上清，10mL RPMI-1640+2％FBS重悬，取样计数后按照细胞数量将细胞密度调整到8×104cells/mL。

[0119] 2)接种靶细胞：将调整密度后的靶细胞分别用排枪接种到96孔细胞培养板中，每孔50μL，同时设不加靶细胞的对照组，每孔加50μL RPMI-1640+2％FBS。

[0120] 3)取PBMC离心，30mL PBS重悬，取样计数后离心洗涤，弃上清，根据计数结果用RPMI-1640+2％FBS重悬，将细胞密度调整到3.2×106cells/mL，然后依次倍比稀释成1.6×106cells/mL、0.8×106cells/mL、0.4×106cells/mL、0.2×106cells/mL 4个密度。

[0121] 4)接种PBMC：将稀释好的不同密度的PBMC按照顺序加入含有靶细胞的对应的96孔板中，50μL/孔，使效靶比分别为20:1、10:1、5:1、2.5:1，同时设T高和T低组，各加50μL RPMI-1640+2％FBS。

[0122] 5)细胞接种完毕后置37℃，CO2培养箱共培养4h。

[0123] 6)细胞共培养4h后将T高组每孔加10μL细胞裂解液，置37℃，CO2培养箱充分裂解1h。

[0124] 7)细胞裂解后，取出细胞，每孔加入100μLWorking Solution，室温避光30min。

[0125] 8)每孔加入50μL Stop Solution后，立刻用酶标仪测定490nm的吸光度，根据公式计算细胞杀伤效率。

[0126] 结果为：

[0127] 1.PD-1封闭剂的荧光标记效率检测

[0128] 取标记前和第一次标记后的样品进行SDS-PAGE分析，荧光扫描结果如图2所示，可以检测到荧光信号，说明阻断蛋白标记成功。

[0129] 2.PBMC培养过程中PD-1表达的变化

[0130] 多肽冲击PBMC，提呈抗原，再与PBMC共培养，以获得具有特异性杀伤功能的淋巴细胞，在共培养过程中，CD8+细胞、CD4+细胞的PD-1的分布情况如图3-1～图3-5所示：其中Day 0的细胞是没有经过任何处理的PBMC，CD8+和CD4+细胞比例在第7天时，发生明显改变，CD8+细胞增多，CD4+细胞比例减少；PD-1+细胞的比例在共培养第3天时，逐渐升高，第10天时，PD-1+的细胞为80％左右；说明，细胞在培养过程中抑制性信号分子PD-1的表达是逐渐升高的，而抑制性信号将影响淋巴细胞抗肿瘤的能。

[0131] 3.PBMC与肿瘤细胞共培养过程中PD-1+细胞比例的变化

[0132] PBMC在第三天时与H358共培养，记为共培养第0天，在共培养第3天，检测CD8+、CD4+及PD1+的细胞比例，结果如图4-1～图4-6所示，在没有H358时，PBMC对照组的PD-1+细胞比例与出发时的多肽培养的PBMC的PD-1+细胞比例相似，仅为59.68％，而加入H358共培养时，PD-1+细胞比例上升至79.67％；在共培养第10天，PD-1+细胞比例为85.67％，高于没有H358的对照组的68.14％；第14天时，PD-1+细胞比例仍然高于没有H358的对照组；说明，PBMC与肿瘤细胞H358长期共存时，肿瘤细胞刺激了PBMC上PD-1的表达，抑制了PBMC的抗肿瘤能力，从而达到免疫逃逸目的。

[0133] 4.PD-1封闭剂在pH 5.8～pH8.0缓冲体系中对PBMC的封闭情况

[0134] 由于恶性肿瘤微环境是弱酸性环境，pH值为6.5～6.9，低于正常组织周围的pH值，因此，以不同pH值的Na2HPO4/NaH2PO4缓冲系统，测试PD-1封闭剂对PBMC的封闭能力，结果如图5-1～图5-2、图6-1～图6-2、图7-1～图7-2、图8-1～图8-2、图9-1～图9-2、图10-1～图10-2所示，pH 5.8～pH8.0缓冲体系中，PD-1封闭剂均可以对PBMC进行封闭，但在pH＝5.8的缓冲体系中封闭效率最高，当PD1封闭剂的终浓度为到32μg/mL时，80.3％的细胞均可以检测到结合信号，而且随着浓度的升高，结合很快达到饱和，维持在97％以。

[0135] 5.pH值降低后，已结合的PD-1封闭剂不会解离

[0136] 由于恶性肿瘤微环境是弱酸性环境，pH值为6.5～6.9，低于正常组织周围的pH值，因此，为模拟体外结合的抗体药物到达肿瘤附近后，是否会由于pH的降低而发生解离，将体外在pH7.2、pH7.4以及pH8.0环境下，结合的PBMC转移pH6.6的缓冲液中，1h后，检测，已结合的封闭剂是否发生解离，结果如图11所示，在pH 6.6的缓冲液中1h，能检测到荧光信号的细胞比例没有发生明显改变，仍稳定在90％以上，结合相对稳定.

[0137] 6.PD-1封闭剂的稳定性分析—不同pH条件下

[0138] 已经封闭的样品，经流式细胞仪检测荧光信号后，将剩余样品置于暗处，室温1h后，再次离心，去除可能已解离的封闭剂，然后再经流式细胞仪检测荧光信号；pH 6.6分析结果分别如图12-1～图12-2所示，能检测到的荧光信号的细胞比例没有发生明显改变，不同浓度下，pH 6.6原由的比例为49.2％、51.0％、61.4％、69.2％和74.9％(已扣除阴性对照的6.2％)；1h后能检测到荧光信号的细胞比例分别为46.5％、49.5％、61.1％、71.4％和72.4％(已扣除阴性对照的1.0％)；说明封闭效果稳定持久。

[0139] pH 6.8结合稳定性(室温1h)的分析结果分别如图13-1～图13-2所示，能检测到的荧光信号的细胞比例也没有发生明显改变，原有细胞比例分别为38.5％、42.1％、52.2％、62.9％和78.1％(已扣除阴性对照的1.0％)；室温1h后，能检测到荧光信号的比例为
35.5％、38.9％、53.1％、61.8％和74.8％(已扣除阴性对照的1.0％)；说明封闭效果稳定持久。

[0140] pH 7.2结合稳定性的分析结果分别如图14所示，封闭剂浓度为500μg/mL时，原有的比例为98.0％，4℃过夜后能检测到的荧光信号的细胞比例为97.0％，再室温1h后比列为92.5％；说明封闭效果稳定持久。

[0141] pH 8.0结合稳定性的分析结果分别如图15所示，封闭剂浓度为500μg/mL时，原有的比例为99.6％，4℃过夜后能检测到的荧光信号的细胞比例为98.2％，再室温1h后比列为97.7％；说明封闭效果稳定持久。

[0142] 7.细胞因子刺激对H358细胞PD-L1表达水平的影响

[0143] 结果如图16所示，H358细胞在没有细胞因子刺激时，PD-L1的表达水平较高，单独加入IFN-γ刺激和同时加入IFN-γ、TNF-α刺激后，PD-L1表达均明显提高，说明IFN-γ和TNF-α细胞因子可以刺激H358细胞提高PD-L1的表达水平；H358可作为PD-1/PD-L1作用模型中的靶细胞，而且，加入细胞因子刺激时，免疫检查点的抑制作用可能更明显。

[0144] 8.荧光扫描仪检测PD-1封闭剂的封闭情况

[0145] 将体外封闭的样品，进行SDS-PAGE分析，并以台风扫描仪检测荧光信号，通过荧光信号强弱以分析封闭的情况，结果如图17所示，随着荧光标记的PD-1抗体药物的浓度增加，检测到的荧光信号增强，说明，PBMC上被封闭的位点越多，而且，浓度为250μg/mL和500μg/mL时的荧光信号强度接近，说明250μg/mL接近封闭的饱和点，可以选此比例进行后续PD-L1竞争封闭的实验。

[0146] 9.PD-L1低表达肿瘤细胞对PD-1封闭剂效果的影响

[0147] 取复苏24h后的H358细胞(没有经过细胞因子的刺激)106个，加入已进行体外封闭的PBMC中，分析肿瘤细胞上低表达的PD-L1对体外封闭效果是否有影响。利用台风荧光扫描仪检测到的荧光信号如图18所示，加入H358后的荧光信号与没有加入H358的信号相似，说明，PD-L1低表达的H358对已经封闭的效果没有影响。

[0148] 10.PD-L1高表达肿瘤细胞对PD-1封闭剂效果的影响

[0149] H358经终浓度为10ng/mL的INF-γ和25ng/mL的TNF-α刺激24h后(H358+)，PD-L1的表达水平明显升高，同时以没有刺激的H358为对照分析其是否影响封闭，结果如图19所示，无论H358是否经过细胞因子的刺激，以及PD-L1的表达水平的高低，对PD-1封闭剂的效果没有影响，且以100倍的非标记的PD-1抗体为竞争物，也没有明显降低已有的封闭效果，说明，PD-1封闭剂的结合是不可逆的，一旦结合，十分牢固。

[0150] 11.温度和时间对PD-1封闭剂的效果影响

[0151] 25℃封闭1h的结果如图20-1～图20-3所示，浓度为20.8μg/mL、41.7μg/mL和83.3μg/mL时，封闭均达50％以上；根据拟合的结合曲线计算结合常数Kd＝19.7965±8.6037μg/m。

[0152] 25℃封闭2h的结果如图21-1～图21-3所示，浓度为20.8μg/mL，封闭为50％左右，浓度为333.3μg/mL时，封闭到达90％左右；根据拟合的结合曲线计算结合常数Kd＝15.3360±3.1718μg/mL。

[0153] 37℃封闭1h的结果如图22-1～图22-3所示，浓度为20.8μg/mL时，封闭达到68.1％，浓度为41.7μg/mL时，封闭已超过80％；根据拟合的结合曲线计算结合常数，Kd＝
10.0496±1.9138μg/mL。

[0154] 如表1所示，在PBS缓冲体系中，25℃时，封闭2h比1h时，结合常数更小，说明2h更适合PD-1封闭剂结合；而同样结合1h，37℃封闭时，结合常数小于25℃的结合常数，说明37℃封闭1h是最优的条件。

[0155] 表1不同条件下的结合常数

[0156]

[0157] 12.PD-1封闭剂对PBMC杀伤肿瘤细胞的效果影响

[0158] 以无封闭的PBMC和加入PD-1封闭剂的PBMC为效应细胞，检测其对H358(肺癌细胞)、U87(脑胶质瘤细胞)、SW480(结直肠癌细胞)、DLD-1(结直肠癌细胞)、SK-BR3(乳腺癌细胞)的杀伤效果，结果如图23-27所示：对H358的杀伤效率，在40：1的比例时，扣除自发死亡率后，没有加入PD-1封闭剂的PBMC对H358的杀伤效率为3％，而加入PD-1封闭剂后，杀伤效率升高至21.4％，差异显著(P<0.05)；对U87的杀伤效率，由22.9％提高至40.9％；对SW480的杀伤效率，由32.7％提高至52.1％；对DLD-1的杀伤效率，由16.1％提高至27.9％；对SK-BR3的杀伤效率，由26.3％提高至47.8％；说明，PD-1封闭剂可以提高PBMC对多种肿瘤的杀伤能力。

[0159] 由此可以得出，本发明提供的PD-1封闭剂可有效结合PBMC细胞上的PD-1，阻断PD-1与PDL1的结合，实现对PBMC细胞的封闭，抑制免疫检测点的活性，释放肿瘤微环境中的免疫刹车，提高免疫细胞对肿瘤的杀伤作用，从而达到抗肿瘤的作用。

[0160] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。