ASB3在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用转让专利
申请号 : CN201910743248.X
文献号 : CN110478485B
文献日 : 2022-01-18
发明人 : 杨冬琴 , 刘杰 , 张文丽 , 吴梦梦 , 何安芳
申请人 : 复旦大学附属华山医院
摘要 :
本发明涉及基因功能领域，具体是ASB3基因在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用。本发明优点在于：通过构建ASB3基因全敲小鼠模型，可以抑制体内E3泛素连接酶ASB3的含量，增强长链脂肪酸的β‑氧化和氧耗量，以减少肝细胞内脂质堆积；本发明探索了ASB3基因的新功能并为非酒精性脂肪肝性肝病的治疗提供新靶点和思路。
权利要求 :
1.抑制或下调ASB3基因表达的试剂在制备非酒精性脂肪性肝病治疗药物中的应用，所述的非酒精性脂肪性肝病为单纯性脂肪肝；所述的抑制或下调ASB3基因表达的试剂包括：特异性结合ASB3的蛋白；特异性干扰ASB3基因表达、加工的siRNA分子、miRNA分子、反义核苷酸。
2.根据权利要求1所述的抑制或下调ASB3基因表达的试剂在制备非酒精性脂肪性肝病治疗药物中的应用，其特征在于，所述的抑制或下调ASB3基因表达的试剂增强长链脂肪酸的β‑氧化和氧耗量，以减少肝细胞内脂质堆积。
3.一种重组载体在制备非酒精性脂肪性肝病治疗药物中的应用，其特征在于，所述的非酒精性脂肪性肝病为单纯性脂肪肝；所述的重组载体中包含特异性干扰ASB3基因表达、加工的siRNA分子、miRNA分子、反义核苷酸。
4.根据权利要求3所述的重组载体在制备非酒精性脂肪性肝病治疗药物中的应用，其特征在于，所述的重组载体为重组菌。
说明书 :
ASB3在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因功能领域，具体地说，是ASB3基因的新功能发现，即ASB3基因在制备治疗代谢性疾病药物中的应用。
背景技术
[0002] 非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)这一肝脏疾病，与内脏脂质堆积、代谢紊乱等表现相关，在最终能形成肝脏纤维化及肝肿瘤的结局的疾
病中越发占据重要位置。NAFLD的发病率尚无准确数据，但据推测其全球范围内发病率，在
28.01/1000人年至52.34/1000人年范围内；而患病率约为25％(Younossi ZM,Koenig AB,
Abdelatif D,et al.Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease‑
meta‑analytic assessment of prevalence,incidence,and outcomes[J].Hepatology,
2016,64(1):73‑84.)。其中，北美患病率为24.13％、南美达30.45％、欧洲为23.71％而亚洲
为27.37％。值得注意的是，在上海成年人中NAFLD患病率从1995年的3.87％增长到2002年
的14.04％，再到2005年的17.3％，至2015年地方患病率已达43.65％；而据估计，在这其中
有近1.9％‑2.2％的人口患有NASH(Younossi Z,Tacke F,Arrese M,et al.Global
perspectives on non‑alcoholic fatty liver disease and non‑alcoholic
steatohepatitis[J].Hepatology,2018.)。因此，NAFLD已不再是发达国家的特点，而逐渐
渗入全球各处，渐为人类健康威胁的另一慢性肝病。
病中越发占据重要位置。NAFLD的发病率尚无准确数据，但据推测其全球范围内发病率，在
28.01/1000人年至52.34/1000人年范围内；而患病率约为25％(Younossi ZM,Koenig AB,
Abdelatif D,et al.Global epidemiology of nonalcoholic fatty liver disease‑
meta‑analytic assessment of prevalence,incidence,and outcomes[J].Hepatology,
2016,64(1):73‑84.)。其中，北美患病率为24.13％、南美达30.45％、欧洲为23.71％而亚洲
为27.37％。值得注意的是，在上海成年人中NAFLD患病率从1995年的3.87％增长到2002年
的14.04％，再到2005年的17.3％，至2015年地方患病率已达43.65％；而据估计，在这其中
有近1.9％‑2.2％的人口患有NASH(Younossi Z,Tacke F,Arrese M,et al.Global
perspectives on non‑alcoholic fatty liver disease and non‑alcoholic
steatohepatitis[J].Hepatology,2018.)。因此，NAFLD已不再是发达国家的特点，而逐渐
渗入全球各处，渐为人类健康威胁的另一慢性肝病。
[0003] 非酒精性脂肪性肝病，是发展不同阶段的疾病状态统称。包括单纯性的脂肪肝、脂肪肝炎以及纤维化。最差的结局则为肝硬化及发生肝癌，并发症中心血管疾病和癌症则成
为晚期主要死因(Lindenmeyer CC,McCullough AJ.The natural history of
nonalcoholic fatty liver disease‑an evolving view[J].Clin Liver Dis,2018,22
(1):11‑21 Rinella ME,Sanyal AJ.Management of nafld:A stage‑based approach[J]
.Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2016,13(4):196‑205.)。机体因自身的调节使得大部
分患者停留在脂肪变阶段(75％)，少数检测到无其他肝损伤的情况下转氨酶升高并组织病
理提示炎细胞浸润从而发展为脂肪肝炎(NASH)。脂肪肝炎常伴纤维化，多数诊断了NASH的
病人(75％)常停留在轻微纤维化(F1)，而一旦查得F2期则极容易进展，通常十年进展为下
个阶段(因个体而异)，并且该动态疾病在此阶段以后不易扭转，全因及因肝死亡率急剧增
加。该疾病的致病原因来自于环境(共生菌(Marra F,Svegliati‑Baroni G.Lipotoxicity
and the gut‑liver axis in nash pathogenesis[J].J Hepatol,2018,68(2):280‑
295.Brandl K,Schnabl B.Intestinal microbiota and nonalcoholic steatohepatitis
[J].Curr Opin Gastroenterol,2017,33(3):128‑133.)、摄食和睡眠频率周期变化等)及
个体本身(基因突变及表观修饰)。
为晚期主要死因(Lindenmeyer CC,McCullough AJ.The natural history of
nonalcoholic fatty liver disease‑an evolving view[J].Clin Liver Dis,2018,22
(1):11‑21 Rinella ME,Sanyal AJ.Management of nafld:A stage‑based approach[J]
.Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2016,13(4):196‑205.)。机体因自身的调节使得大部
分患者停留在脂肪变阶段(75％)，少数检测到无其他肝损伤的情况下转氨酶升高并组织病
理提示炎细胞浸润从而发展为脂肪肝炎(NASH)。脂肪肝炎常伴纤维化，多数诊断了NASH的
病人(75％)常停留在轻微纤维化(F1)，而一旦查得F2期则极容易进展，通常十年进展为下
个阶段(因个体而异)，并且该动态疾病在此阶段以后不易扭转，全因及因肝死亡率急剧增
加。该疾病的致病原因来自于环境(共生菌(Marra F,Svegliati‑Baroni G.Lipotoxicity
and the gut‑liver axis in nash pathogenesis[J].J Hepatol,2018,68(2):280‑
295.Brandl K,Schnabl B.Intestinal microbiota and nonalcoholic steatohepatitis
[J].Curr Opin Gastroenterol,2017,33(3):128‑133.)、摄食和睡眠频率周期变化等)及
个体本身(基因突变及表观修饰)。
[0004] 目前，虽对NAFL和NASH可以通过影像、临床及实验室指标进行筛检，尚无针对NAFLD非侵入性的确诊检查。肝脏活检通过组织病理判断NASH及纤维化程度而成为最常用
的检测的手段(Siddiqui MS,Harrison SA,Abdelmalek MF,et al.Case definitions for
inclusion and analysis of endpoints in clinical trials for nonalcoholic
steatohepatitis through the lens of regulatory science[J].Hepatology,2018,67
(5):2001‑2012.)。治疗方面，早期以修正不良生活方式并增强锻炼为主，晚期则以减缓代
谢应激、炎症和纤维化三大驱动疾病进展的因素为主。但尚无FDA通过的治疗NASH的药物。
基于非酒精脂肪肝病与代谢的密切相关性以及最重结局的严重性，以及目前局限的检测和
针对性的治疗手段，开展对非酒精性脂肪肝的致病机制探究及相应药物开发有着重要的意
义。
的检测的手段(Siddiqui MS,Harrison SA,Abdelmalek MF,et al.Case definitions for
inclusion and analysis of endpoints in clinical trials for nonalcoholic
steatohepatitis through the lens of regulatory science[J].Hepatology,2018,67
(5):2001‑2012.)。治疗方面，早期以修正不良生活方式并增强锻炼为主，晚期则以减缓代
谢应激、炎症和纤维化三大驱动疾病进展的因素为主。但尚无FDA通过的治疗NASH的药物。
基于非酒精脂肪肝病与代谢的密切相关性以及最重结局的严重性，以及目前局限的检测和
针对性的治疗手段，开展对非酒精性脂肪肝的致病机制探究及相应药物开发有着重要的意
义。
[0005] E3泛素连接酶(ASB3)，是自噬(Broemer M,Meier P.Ubiquitin‑mediated regulation of apoptosis[J].Trends Cell Biol,2009,19(3):130‑140.)和凋亡
(Varshavsky A.The ubiquitin system,autophagy,and regulated protein
degradation[J].Annu Rev Biochem,2017,86(123‑128.)的重要调节因子之一，在正常发
育、肿瘤进展以及组织稳态中发挥重要的作用。E3泛素连接酶通过UPS系统促进蛋白质降
解。其中一类E3泛素连接酶因含有SOCS盒子结构，被称为SOCS家族蛋白。其中最大的一个亚
群是含SOCS结构的锚蛋白重复蛋白。这个亚家族作为CRL结构的衔接蛋白，通常以锚蛋白重
复序列来募集底物。ASB家族蛋白参与到了很多肿瘤的发生发展中(Chung AS,Guan YJ,
Yuan ZL,et al.Ankyrin repeat and socs box 3(asb3)mediates ubiquitination and
degradation of tumor necrosis factor receptor ii[J].Mol Cell Biol,2005,25
(11):4716‑4726.Kamura T,Sato S,Haque D,et al.The elongin bc complex interacts
with the conserved socs‑box motif present in members of the socs,ras,wd‑40
repeat,and ankyrin repeat families[J].Genes Dev,1998,12(24):3872‑3881.)，而
ASB3正是ASB家族的一员在人的肝中表达丰富(Chung AS,Guan YJ,Yuan ZL,et
al.Ankyrin repeat and socs box 3(asb3)mediates ubiquitination and degradation
of tumor necrosis factor receptor ii[J].Mol Cell Biol,2005,25(11):4716‑
4726.)。
(Varshavsky A.The ubiquitin system,autophagy,and regulated protein
degradation[J].Annu Rev Biochem,2017,86(123‑128.)的重要调节因子之一，在正常发
育、肿瘤进展以及组织稳态中发挥重要的作用。E3泛素连接酶通过UPS系统促进蛋白质降
解。其中一类E3泛素连接酶因含有SOCS盒子结构，被称为SOCS家族蛋白。其中最大的一个亚
群是含SOCS结构的锚蛋白重复蛋白。这个亚家族作为CRL结构的衔接蛋白，通常以锚蛋白重
复序列来募集底物。ASB家族蛋白参与到了很多肿瘤的发生发展中(Chung AS,Guan YJ,
Yuan ZL,et al.Ankyrin repeat and socs box 3(asb3)mediates ubiquitination and
degradation of tumor necrosis factor receptor ii[J].Mol Cell Biol,2005,25
(11):4716‑4726.Kamura T,Sato S,Haque D,et al.The elongin bc complex interacts
with the conserved socs‑box motif present in members of the socs,ras,wd‑40
repeat,and ankyrin repeat families[J].Genes Dev,1998,12(24):3872‑3881.)，而
ASB3正是ASB家族的一员在人的肝中表达丰富(Chung AS,Guan YJ,Yuan ZL,et
al.Ankyrin repeat and socs box 3(asb3)mediates ubiquitination and degradation
of tumor necrosis factor receptor ii[J].Mol Cell Biol,2005,25(11):4716‑
4726.)。
[0006] 目前对ASB3基因功能的相关研究较少，主要集中于GWAS分析基因SNP与疾病的关系，例如ASB3可能与哮喘疾病的支气管舒张剂反应性(Israel E,Lasky‑Su J,Markezich
A,et al.Genome‑wide association study of short‑acting beta2‑agonists.A novel
genome‑wide significant locus on chromosome 2 near asb3[J].Am J Respir Crit
Care Med,2015,191(5):530‑537.Ortega VE.Predictive genetic profiles for beta‑
agonist therapy in asthma.A future under construction[J].Am J Respir Crit
Care Med,2015,191(5):494‑496.Sordillo JE,McGeachie M,Lutz SM,et
al.Longitudinal analysis of bronchodilator response in asthmatics and effect
modification of age‑related trends by genotype[J].Pediatr Pulmonol,2019,54
(2):158‑164.)。日本人群中二型糖尿病的发生有关联(Imamura M,Takahashi A,Yamauchi
T,et al.Genome‑wide association studies in the japanese population identify
seven novel loci for type 2 diabetes[J].Nat Commun,2016,7(1):531.)。而在肿瘤方
面已经证明其下调与结直肠癌的生长和转移相关(Du WY,Lu ZH,Ye W,et al.The loss‑
of‑function mutations and down‑regulated expression of asb3gene promote the
growth and metastasis of colorectal cancer cells[J].Chin J Cancer,2017,36(1):
11.)。免疫方面则涉及IL‑6、IL1R和IL‑10的水平(Tekola Ayele F,Doumatey A,Huang H,
et al.Genome‑wide associated loci influencing interleukin(il)‑10,il‑1ra,and
il‑6 levels in african americans[J].Immunogenetics,2012,64(5):351‑359.)以及唯
一一个已证实底物TNFR2(Chung AS,Guan YJ,Yuan ZL,et al.Ankyrin repeat and socs
box 3(asb3)mediates ubiquitination and degradation of tumor necrosis factor
receptor ii[J].Mol Cell Biol,2005,25(11):4716‑4726.)。
A,et al.Genome‑wide association study of short‑acting beta2‑agonists.A novel
genome‑wide significant locus on chromosome 2 near asb3[J].Am J Respir Crit
Care Med,2015,191(5):530‑537.Ortega VE.Predictive genetic profiles for beta‑
agonist therapy in asthma.A future under construction[J].Am J Respir Crit
Care Med,2015,191(5):494‑496.Sordillo JE,McGeachie M,Lutz SM,et
al.Longitudinal analysis of bronchodilator response in asthmatics and effect
modification of age‑related trends by genotype[J].Pediatr Pulmonol,2019,54
(2):158‑164.)。日本人群中二型糖尿病的发生有关联(Imamura M,Takahashi A,Yamauchi
T,et al.Genome‑wide association studies in the japanese population identify
seven novel loci for type 2 diabetes[J].Nat Commun,2016,7(1):531.)。而在肿瘤方
面已经证明其下调与结直肠癌的生长和转移相关(Du WY,Lu ZH,Ye W,et al.The loss‑
of‑function mutations and down‑regulated expression of asb3gene promote the
growth and metastasis of colorectal cancer cells[J].Chin J Cancer,2017,36(1):
11.)。免疫方面则涉及IL‑6、IL1R和IL‑10的水平(Tekola Ayele F,Doumatey A,Huang H,
et al.Genome‑wide associated loci influencing interleukin(il)‑10,il‑1ra,and
il‑6 levels in african americans[J].Immunogenetics,2012,64(5):351‑359.)以及唯
一一个已证实底物TNFR2(Chung AS,Guan YJ,Yuan ZL,et al.Ankyrin repeat and socs
box 3(asb3)mediates ubiquitination and degradation of tumor necrosis factor
receptor ii[J].Mol Cell Biol,2005,25(11):4716‑4726.)。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于针对现有治疗非酒精性脂肪性肝病手段的局限，提供ASB3在制备治疗脂代谢紊乱相关疾病药物中的应用。
[0008] 本发明的第一方面，提供一种治疗非酒精性脂肪性肝病的靶点，即E3泛素连接酶ASB3。
[0009] 本发明提供E3泛素连接酶ASB3基因在制备治疗脂代谢紊乱相关疾病药物中的应用。所述的脂代谢紊乱相关疾病为非酒精性脂肪性肝病。所述的非酒精性脂肪性肝病为单
纯性脂肪肝(SFL)，非酒精性脂肪肝(non‑alcoholic fatty liver，NAFLD)，非酒精性脂肪
性肝炎，肝纤维化，非酒精性脂肪性肝炎相关肝硬化。
纯性脂肪肝(SFL)，非酒精性脂肪肝(non‑alcoholic fatty liver，NAFLD)，非酒精性脂肪
性肝炎，肝纤维化，非酒精性脂肪性肝炎相关肝硬化。
[0010] 进一步的，本发明所述的非酒精性脂肪性肝病为非酒精性脂肪肝(non‑alcoholic fatty liver，NAFLD)。
[0011] 本发明发现ASB3基因敲除小鼠呈现低体重多肌少脂的“瘦”表型。ASB3基因敲除小鼠肝脏脂肪含量明显减少，组织器官重量较轻。ASB3基因敲除小鼠葡萄糖耐量和胰岛素耐
量在高脂喂养后优于野生型。ASB3基因敲除小鼠的氧耗量和热量产生明显高于野生型。显
示ASB3可以通过泛素化降解过程影响线粒体β氧化过程，从而影响胞内脂类物质的堆积，长
期以致影响体重和体成份的明显变化。
量在高脂喂养后优于野生型。ASB3基因敲除小鼠的氧耗量和热量产生明显高于野生型。显
示ASB3可以通过泛素化降解过程影响线粒体β氧化过程，从而影响胞内脂类物质的堆积，长
期以致影响体重和体成份的明显变化。
[0012] 本发明的第二方面，提供ASB3基因在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用。
[0013] 进一步的，所述的应用是指将ASB3基因作为非酒精性脂肪性肝病治疗的干预靶点。
[0014] 进一步的，所述的治疗非酒精性脂肪性肝病药物是抑制或下调ASB3基因表达的试剂。
[0015] 进一步的，所述的抑制或下调ASB3基因表达的试剂可明显减少肝脏和脂肪组织内的脂肪累积，减少血液中甘油三酯的含量，使整体形态和体重以及对葡萄糖和胰岛素的敏
感度在高脂刺激后都偏离正常指标更少。
感度在高脂刺激后都偏离正常指标更少。
[0016] 进一步的，所述的抑制或下调ASB3基因表达的试剂增强长链脂肪酸的β‑氧化和氧耗量，以减少肝细胞内脂质堆积。
[0017] 进一步的，所述的抑制或下调ASB3基因表达的试剂激活机体氧耗量和热量产生。
[0018] 进一步的，所述的抑制或下调ASB3基因表达的试剂减少机体长链脂肪酸含量。
[0019] 本发明的第三方面，提供抑制或下调ASB3基因表达的试剂在制备非酒精性脂肪性肝病治疗药物中的应用。
[0020] 进一步的，所述的抑制或下调ASB3基因表达的试剂包括但不限于：
[0021] 特异性结合ASB3的蛋白；
[0022] 特异性干扰ASB3基因表达、加工的小干扰分子，如siRNA分子、miRNA分子、反义核苷酸等；
[0023] ASB3抑制剂、拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。
[0024] 本发明的第四方面，提供一种重组载体、重组菌在制备非酒精性脂肪性肝病治疗药物中的应用，所述的重组载体中包含上述的特异性干扰ASB3基因表达、加工的小干扰分
子。
子。
[0025] 本发明的第五方面，提供一种非酒精性脂肪性肝病治疗药物，所述的肝癌治疗药物中包含上述的抑制或下调ASB3基因表达的试剂。
[0026] 优选的，所述的预防或治疗多囊肾病的药物的活性成分为抑制或下调ASB3基因表达的试剂。
[0027] 进一步的，所述的预防或治疗多囊肾病药物中包括有效量的抑制或下调ASB3基因表达的试剂和药学上可接受的辅料或载体。
[0028] 本发明的第四方面，提供ASB3基因在制备激活机体氧耗量和热量产生的药物中的应用。
[0029] 进一步的，所述的激活机体氧耗量和热量产生的药物为抑制或下调ASB3基因表达的试剂。
[0030] 本发明的第五方面，提供ASB3基因在制备减少机体长链脂肪酸含量的药物中的应用。
[0031] 进一步的，所述的减少机体长链脂肪酸含量的药物为抑制或下调ASB3基因表达的试剂。
[0032] 本发明优点在于：
[0033] 1、通过使用本发明的干预方式，靶向性针对性对肝脏脂代谢的紊乱的途径进行纠正；
[0034] 2、通过构建ASB3基因全敲小鼠模型，可以抑制体内E3泛素连接酶ASB3的含量，增强长链脂肪酸的β‑氧化和氧耗量，以减少肝细胞内脂质堆积；
[0035] 3、本发明开拓了ASB3基因功能的新发现，通过小干扰RNA的干预基因功能对代谢的影响方面较小，副作用较少，且针对性和特异性高，应用前景较广。本发明探索了ASB3基
因的新功能并为非酒精性脂肪肝性肝病的治疗提供新靶点和思路；
因的新功能并为非酒精性脂肪肝性肝病的治疗提供新靶点和思路；
附图说明
[0036] 图1：正常及高脂喂养后小鼠体重变化和体成份分析。(A)两种喂养方式体重变化趋势(B)两种喂养方式体成份分析。WT：野生型；HO：基因敲除鼠；HFD：高脂喂养；NCD：正常喂
养；*，p<0.05；**，p<0.01。
养；*，p<0.05；**，p<0.01。
[0037] 图2：正常及高脂喂养后小鼠糖耐量和胰岛素耐量检测。(A)正常喂养4个月组(B)高脂喂养4个月组。WT：野生型；HO：基因敲除鼠；HFD：高脂喂养；NCD：正常喂养；M：月。
[0038] 图3：高脂喂养16周小鼠肝脏的解剖及HE和ORO染色。(A)肝脏器官解剖；(B)肝脏ORO染色；(C)肝脏HE染色。
[0039] 图4：高脂喂养小鼠肝脏和血指标测量。(A)肝脏甘油三酯测量；(B)高脂喂养8周血指标；(C)高脂喂养16周血指标。
[0040] 图5：代谢笼相关指标检测。(A)VO2VCO2RER HEAT时间曲线及综合分析；(B)摄食量代谢笼测量；(C)活动量检测。
具体实施方式
[0041] 下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
[0042] 实施例1
[0043] 一、实验方法
[0044] 1.组织蛋白提取：
[0045] 将新鲜组织取材后冻于‑80摄氏度。提取组织蛋白前融化强效裂解液并加入PMSF。称量组织块，按照每50毫克组织加入500ul强效裂解液，脂肪组织每300毫克加入1ml强效裂
解液。加入2‑3颗小钢珠，于组织研磨仪上以60赫兹的频率震荡120秒。震荡完毕以14000g的
速度4℃离心5分钟。取上清即为组织蛋白提取液。按照BCA定量过程进行组织蛋白定量。
解液。加入2‑3颗小钢珠，于组织研磨仪上以60赫兹的频率震荡120秒。震荡完毕以14000g的
速度4℃离心5分钟。取上清即为组织蛋白提取液。按照BCA定量过程进行组织蛋白定量。
[0046] 2.油红O染色：组织&细胞：
[0047] 组织油红O染色:新鲜组织取材后包埋于oct中，立即于液氮中冷冻。取冷冻好的组织在已预冷的冰冻切片机中切片，切成12um厚立即粘附于防脱玻片上，并于固定液中固定
10分钟。固定好后的组织用水稍冲洗，立即浸没入稀释好的油红O染液中浸染15分钟。染色
完毕于60％乙醇溶液中分色。分色完毕用水稍洗，用苏木精浅染核30秒。用自来水冲洗至返
蓝。擦干后用温育好的甘油明胶封片，显微镜下观察。细胞油红O染色:处理好后的细胞用
PBS清洗两遍，用预冷的4％甲醛固定30分钟。固定完毕用去离子水稍洗，用油红O染液染色
20分钟。染色完毕用75％乙醇溶液分色2分钟。用去离子水清洗3遍，于镜下拍摄。
10分钟。固定好后的组织用水稍冲洗，立即浸没入稀释好的油红O染液中浸染15分钟。染色
完毕于60％乙醇溶液中分色。分色完毕用水稍洗，用苏木精浅染核30秒。用自来水冲洗至返
蓝。擦干后用温育好的甘油明胶封片，显微镜下观察。细胞油红O染色:处理好后的细胞用
PBS清洗两遍，用预冷的4％甲醛固定30分钟。固定完毕用去离子水稍洗，用油红O染液染色
20分钟。染色完毕用75％乙醇溶液分色2分钟。用去离子水清洗3遍，于镜下拍摄。
[0048] 3.葡萄糖耐量(GTT)/胰岛素耐量(ITT)检测
[0049] GTT：测量前一天下午17:00开始禁食，测量当天早上9:00开始测量，共禁食16小时。配制20％葡萄糖水溶液，按照每克体重注射2mg葡萄糖计算所需注射糖水容量。首先检
测空腹血糖，腹腔注射后开始计时，测量注射后30min、60min、90min、120min血糖。
测空腹血糖，腹腔注射后开始计时，测量注射后30min、60min、90min、120min血糖。
[0050] ITT：测量当天上午9:00禁食，下午13:00开始测量，共禁食4小时。使用诺和灵R人短效胰岛素，用前用灭菌水稀释，按照每克体重注射0.75mU计算注射体积。检测空腹血糖后
腹腔注射胰岛素，测量注射后15min、30min、45min、60min、90min血糖。
腹腔注射胰岛素，测量注射后15min、30min、45min、60min、90min血糖。
[0051] 4.肝脏甘油三酯(TG)检测
[0052] 取裂解液加入盛放肝脏组织的1.5ml离心管中，裂解前称重组织块。用组织研磨仪充分研磨。将裂解后产物在70℃金属浴上加热10分钟。在室温条件下，2000rpm离心5min，上
清继续用于后面步骤。配制工作溶液和标准品。在96孔板中加入倍比稀释的标准品和待测
样品，37℃反应10min后，用酶标仪进行检测。
清继续用于后面步骤。配制工作溶液和标准品。在96孔板中加入倍比稀释的标准品和待测
样品，37℃反应10min后，用酶标仪进行检测。
[0053] 5.血甘油三酯(TG)检测
[0054] 小鼠摘眼球取血后，室温静置15min。于常温3000rpm离心15‑20min，将上清分离出并冻存于‑20℃待检。检测时使用血生化分析仪对所需检测指标进行检测。
[0055] 二、实验结果
[0056] (一)ASB3基因敲除鼠呈现“瘦”的表型
[0057] 前期RNAseq的数据表明，Huh7肝癌细胞敲低ASB3的表达后，影响到细胞的脂质运输过程、脂蛋白代谢、胆固醇稳态、脂肪细胞分化等众多与脂代谢相关的过程。故本发明对
野生型小鼠和基因敲除鼠同时进行高脂喂养，在高脂的刺激下观测脂代谢相关的表型差
异。对同一批次的同窝出生仔进行基因型鉴定后于第三周按照不同基因型分笼，每个实验
组≥5只，进行高脂喂养或正常喂养。从第6周(高脂或普通饮食喂养16周)或第8周(高脂喂
养8w)至实验终末每周2天体重称量后统计分析(图1B)，发现高脂喂养小鼠从喂养起始体重
逐日出现差异，其中在第15到第19周体重差异在两组中有稳定的显著性差异，在实验近终
末体重差异逐渐减小。经计算发现，在第7周(即喂养后1周)体重均值出现2.3g差异，在第17
周(喂养后11周)差异达到最大9.3g，而在实验终末点有5.9g差异。并且，比较实验终末体重
最重的野生型小鼠与最轻的敲除鼠可直观得看出体型差异(图1A)，体重差异达26.1g；体重
最重野生型与同窝出生敲除鼠体重差值可达3.3g。而正常喂养组在第19周开始出现差异，
最大体重差异2.4g。高脂喂养8w的小鼠从第8周开始进行高脂喂养，在第10周体重均值开始
出现差异，在实验终末第16周(即喂养后8周)有3.98g差异，同高脂4月的小鼠比较，同样喂
养周期增重及体重差异具有较为一致的结果。此外，在实验终末本发明对两种喂养情况下
两种基因型的小鼠进行小动物核磁体成分分析(图1B)，计算体脂肪和瘦肉克数，然后计算
各成分占比比较差异。发现正常喂养的状况下，ASB3基因敲除鼠的体脂肪含量明显低于野
生型小鼠，而瘦肉含量亦明显高于对照组，并且有统计学差异。而在高脂喂养的条件下，
ASB3敲除鼠的脂肪占比明显高于对照组，而瘦肉占比在高脂喂养16周后无统计学差异。
野生型小鼠和基因敲除鼠同时进行高脂喂养，在高脂的刺激下观测脂代谢相关的表型差
异。对同一批次的同窝出生仔进行基因型鉴定后于第三周按照不同基因型分笼，每个实验
组≥5只，进行高脂喂养或正常喂养。从第6周(高脂或普通饮食喂养16周)或第8周(高脂喂
养8w)至实验终末每周2天体重称量后统计分析(图1B)，发现高脂喂养小鼠从喂养起始体重
逐日出现差异，其中在第15到第19周体重差异在两组中有稳定的显著性差异，在实验近终
末体重差异逐渐减小。经计算发现，在第7周(即喂养后1周)体重均值出现2.3g差异，在第17
周(喂养后11周)差异达到最大9.3g，而在实验终末点有5.9g差异。并且，比较实验终末体重
最重的野生型小鼠与最轻的敲除鼠可直观得看出体型差异(图1A)，体重差异达26.1g；体重
最重野生型与同窝出生敲除鼠体重差值可达3.3g。而正常喂养组在第19周开始出现差异，
最大体重差异2.4g。高脂喂养8w的小鼠从第8周开始进行高脂喂养，在第10周体重均值开始
出现差异，在实验终末第16周(即喂养后8周)有3.98g差异，同高脂4月的小鼠比较，同样喂
养周期增重及体重差异具有较为一致的结果。此外，在实验终末本发明对两种喂养情况下
两种基因型的小鼠进行小动物核磁体成分分析(图1B)，计算体脂肪和瘦肉克数，然后计算
各成分占比比较差异。发现正常喂养的状况下，ASB3基因敲除鼠的体脂肪含量明显低于野
生型小鼠，而瘦肉含量亦明显高于对照组，并且有统计学差异。而在高脂喂养的条件下，
ASB3敲除鼠的脂肪占比明显高于对照组，而瘦肉占比在高脂喂养16周后无统计学差异。
[0058] 胰岛素是调节体内葡萄糖和脂肪代谢重要的激素，能通过直接或间接的途径影响调节。本发明在检测体重的同时对葡萄糖耐量和胰岛素耐量进行测试。发现正常喂养的小
鼠基础血糖有轻微差异(p＝0.038)，基因敲除鼠略高于野生型小鼠(图2A)；腹腔注射葡萄
糖水后30分钟血糖升至最高值，但野生型小鼠血糖明显高于敲除鼠，其中野生型均值在
19.5mmol/L而敲除鼠为15.4mmol/L(p<0.001)；第60分钟下降明显，后1个小时下降较为平
缓，最终二者血糖趋于一致。高脂喂养16周后(图2B)，野生型小鼠的血糖在饥饿16小时后呈
现野生型小鼠血糖高于敲除鼠，均值分别为9.24mmol/L和7.25mmol/L，统计学差异。注射30
分钟达峰，峰值接近分别为23.81mmol/L和22.48mmol/L。注射60分钟野生型几乎不变化(均
值23.79mmol/L)而敲除鼠均值为20.58mmol/L。60分钟后开始下降，在终末点与野生型有明
显差异(18.11mmol/L vs 13.1mmol/L)，其中敲除鼠较最高点血糖下降42％，而野生型只有
24％。
鼠基础血糖有轻微差异(p＝0.038)，基因敲除鼠略高于野生型小鼠(图2A)；腹腔注射葡萄
糖水后30分钟血糖升至最高值，但野生型小鼠血糖明显高于敲除鼠，其中野生型均值在
19.5mmol/L而敲除鼠为15.4mmol/L(p<0.001)；第60分钟下降明显，后1个小时下降较为平
缓，最终二者血糖趋于一致。高脂喂养16周后(图2B)，野生型小鼠的血糖在饥饿16小时后呈
现野生型小鼠血糖高于敲除鼠，均值分别为9.24mmol/L和7.25mmol/L，统计学差异。注射30
分钟达峰，峰值接近分别为23.81mmol/L和22.48mmol/L。注射60分钟野生型几乎不变化(均
值23.79mmol/L)而敲除鼠均值为20.58mmol/L。60分钟后开始下降，在终末点与野生型有明
显差异(18.11mmol/L vs 13.1mmol/L)，其中敲除鼠较最高点血糖下降42％，而野生型只有
24％。
[0059] 进行胰岛素耐量测试，正常喂养情况下，二者无明显差异。而在高脂喂养时，野生型小鼠和敲除鼠有不同的变化趋势：高脂喂养4月组，同样在15分钟血糖不降，HO鼠较WT鼠
30分钟下降更为明显，后1小时内血糖维持在初始血糖的78％，而WT鼠整个检测过程未达到
正常血糖的88％以下。并且将高脂喂养16周者，与正常喂养者进行比较可以发现：正常情况
下，胰岛素注射后能在厨师15分钟便将血糖降至初始的70％左右，终末点血糖降至初始值
的50％左右。而在高脂喂养4月后，15分钟血糖基本与初始值保持不变，在30分钟才开始下
降，终末点为初始的80％。
30分钟下降更为明显，后1小时内血糖维持在初始血糖的78％，而WT鼠整个检测过程未达到
正常血糖的88％以下。并且将高脂喂养16周者，与正常喂养者进行比较可以发现：正常情况
下，胰岛素注射后能在厨师15分钟便将血糖降至初始的70％左右，终末点血糖降至初始值
的50％左右。而在高脂喂养4月后，15分钟血糖基本与初始值保持不变，在30分钟才开始下
降，终末点为初始的80％。
[0060] 综合上述两部分结果，本发明得出如下结论：正常喂养情况下，野生型和ASB3敲除鼠体重差异不明显，但体成份差异较大，敲除鼠的体脂肪含量更少而肌肉组织更多；高脂喂
养后，小鼠的体重明显增加，其中ASB3基因敲除鼠的体重变化较野生型更小，并且脂肪组织
含量更少。高脂喂养后，ASB3敲除鼠较野生型对外源注射的葡萄糖和胰岛素更为敏感。此
外，高脂喂养影响到GTT与ITT，而均表现为敲除鼠的敏感度更好。
养后，小鼠的体重明显增加，其中ASB3基因敲除鼠的体重变化较野生型更小，并且脂肪组织
含量更少。高脂喂养后，ASB3敲除鼠较野生型对外源注射的葡萄糖和胰岛素更为敏感。此
外，高脂喂养影响到GTT与ITT，而均表现为敲除鼠的敏感度更好。
[0061] (二)ASB3对肝脏和脂肪组织脂质代谢的影响
[0062] 因为肝脏组织在正常或高脂喂养期间重量幅度变化明显，并且考虑该些器官为脂肪代谢主要涉及的器官，所以本发明选择对肝脏组织进行进一步观察。
[0063] 肝脏在形态学上有较为明显的变化(图3A)。高脂喂养4个月后，野生型小鼠的肝脏褐色偏白，体积较大；而ASB3基因敲除鼠的肝脏却褐色偏红，体积较小，外表无白色颗粒感。
HE染色可见(图3B)，在低倍镜的视野下，野生型小鼠的肝脏切面中有大面积的白色空泡，而
敲除鼠中空泡面积却明显减少；高倍镜视野下可见围绕门静脉为中心的肝小叶周边有大量
气球样变性的肝细胞，野生型小鼠变性细胞范围约小叶周边至中央静脉距离的2/3，而敲除
鼠的单个空泡面积为小，并且范围不及1/3。并且油红着色的面积与脂滴相对应，进一步证
实在野生型小鼠的肝脏中脂滴的堆积较为严重，而敲除鼠中脂滴的含量相对较少，这也与
大体观察以及体重的变化相一致(图3C)。
HE染色可见(图3B)，在低倍镜的视野下，野生型小鼠的肝脏切面中有大面积的白色空泡，而
敲除鼠中空泡面积却明显减少；高倍镜视野下可见围绕门静脉为中心的肝小叶周边有大量
气球样变性的肝细胞，野生型小鼠变性细胞范围约小叶周边至中央静脉距离的2/3，而敲除
鼠的单个空泡面积为小，并且范围不及1/3。并且油红着色的面积与脂滴相对应，进一步证
实在野生型小鼠的肝脏中脂滴的堆积较为严重，而敲除鼠中脂滴的含量相对较少，这也与
大体观察以及体重的变化相一致(图3C)。
[0064] 此外，本发明进一步通过检测肝脏内的甘油三酯含量(图4A)和外周血中血脂相关各项指标(图4B‑C)。发现在ASB3敲除鼠的肝脏中，每克组织中甘油三酯的含量更少，这与HE
和ORO染色所见符合。血液指标中，高脂喂养2个月后并无明显差异，高脂喂养4个月后甘油
三酯有统计学差异，而胆固醇含量、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白含量无统计学差异。
和ORO染色所见符合。血液指标中，高脂喂养2个月后并无明显差异，高脂喂养4个月后甘油
三酯有统计学差异，而胆固醇含量、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白含量无统计学差异。
[0065] (三)ASB3基因敲除鼠具有高氧耗的代谢特征
[0066] 正常喂养的小鼠体重并无明显差异，而在高脂喂养的情况下出现了不同程度的脂质堆积。上述观察到的肝脏与脂肪组织的变化指向脂质代谢过程，故考虑从影响脂质代谢
的几个部分来考虑。本发明首先用手工测量以及代谢笼测量对小鼠摄食情况做分析(图
5B)，发现高脂喂养情况下小鼠的摄食量并无明显差异，而正常饮食因手工测量和代谢笼的
方式不同而呈现不同结果。在代谢笼中，正常饮食量无明显差异，统计的是每组5只每只单
个空间单独计量情况。而手动测量是计算每日每笼群体摄食情况计算均值，连续测量3周取
每日均值。该差异可能由于群体不同及组内差异造成，但均可得出敲除鼠体重下降不是由
于摄食减少而下降的结论。然后，本发明利用代谢笼对小鼠代谢情况作了整体观测。首先，
高脂饮食者呼吸熵(RER)接近0.8，而正常饮食者接近1.0，分别对应其代谢底物主要以脂肪
酸和碳水化合物为主的特性，证实数据前提的有效性(图5A)。其次，本发明发现正常喂养和
高脂喂养的情况下，均存在氧耗量、二氧化碳和热量产生量的差异(图5A)，ASB3基因敲除鼠
的各项指标均较野生型为高。其中，高脂喂养4个月组的夜间氧耗量有统计学差异，P值<
0.05；日间氧耗量和总体氧耗量也有敲除鼠高于野生型的趋势，但无统计学差异。高脂喂养
2月组的日间氧耗量及总体氧耗量均有统计学差异，趋势同4月组。而二氧化碳产生量无明
显统计学差异。热量的产生以高脂喂养4月组的夜间氧耗量差异明显。此外，对于活动量的
分析未发现有差异(图5C)。
的几个部分来考虑。本发明首先用手工测量以及代谢笼测量对小鼠摄食情况做分析(图
5B)，发现高脂喂养情况下小鼠的摄食量并无明显差异，而正常饮食因手工测量和代谢笼的
方式不同而呈现不同结果。在代谢笼中，正常饮食量无明显差异，统计的是每组5只每只单
个空间单独计量情况。而手动测量是计算每日每笼群体摄食情况计算均值，连续测量3周取
每日均值。该差异可能由于群体不同及组内差异造成，但均可得出敲除鼠体重下降不是由
于摄食减少而下降的结论。然后，本发明利用代谢笼对小鼠代谢情况作了整体观测。首先，
高脂饮食者呼吸熵(RER)接近0.8，而正常饮食者接近1.0，分别对应其代谢底物主要以脂肪
酸和碳水化合物为主的特性，证实数据前提的有效性(图5A)。其次，本发明发现正常喂养和
高脂喂养的情况下，均存在氧耗量、二氧化碳和热量产生量的差异(图5A)，ASB3基因敲除鼠
的各项指标均较野生型为高。其中，高脂喂养4个月组的夜间氧耗量有统计学差异，P值<
0.05；日间氧耗量和总体氧耗量也有敲除鼠高于野生型的趋势，但无统计学差异。高脂喂养
2月组的日间氧耗量及总体氧耗量均有统计学差异，趋势同4月组。而二氧化碳产生量无明
显统计学差异。热量的产生以高脂喂养4月组的夜间氧耗量差异明显。此外，对于活动量的
分析未发现有差异(图5C)。
[0067] 综合该部分结果，本发明得出两种喂养方式下，小鼠的摄食量和活动量无明显差异，非造成瘦表型的根本原因。高脂喂养4月小鼠，存在夜间氧耗量和热量增加的表现。
[0068] 三、讨论
[0069] 非酒精性脂肪肝病在近些年的研究当中有越来越多的相关发病机制被报道，但仍不够全面。泛素化降解途径作为胞内蛋白降解的主要途径之一，其对细胞内大多数生理过
程都有着重要影响，甚至可作为治疗靶点。为进一步补充泛素蛋白酶体系统在非酒精脂肪
肝致病过程中的重要作用，本发明开展了针对于E3泛素连接酶受体蛋白ASB3的功能研究。
研究结果提示，E3连接酶受体蛋白ASB3的敲除可明显减少小鼠肝脏和脂肪组织内的脂肪累
积，减少血液中甘油三酯的含量，使整体形态和体重以及对葡萄糖和胰岛素的敏感度在高
脂刺激后都偏离正常指标更少。具体机制上，本发明发现高脂刺激后敲除鼠的夜间氧气消
耗和热量产生明显高于对照组。本发明进一步补充了蛋白酶体系统对NAFLD和代谢性疾病
的影响，提供了治疗的潜在靶点。
程都有着重要影响，甚至可作为治疗靶点。为进一步补充泛素蛋白酶体系统在非酒精脂肪
肝致病过程中的重要作用，本发明开展了针对于E3泛素连接酶受体蛋白ASB3的功能研究。
研究结果提示，E3连接酶受体蛋白ASB3的敲除可明显减少小鼠肝脏和脂肪组织内的脂肪累
积，减少血液中甘油三酯的含量，使整体形态和体重以及对葡萄糖和胰岛素的敏感度在高
脂刺激后都偏离正常指标更少。具体机制上，本发明发现高脂刺激后敲除鼠的夜间氧气消
耗和热量产生明显高于对照组。本发明进一步补充了蛋白酶体系统对NAFLD和代谢性疾病
的影响，提供了治疗的潜在靶点。
[0070] 目前对ASB3基因功能的相关研究较少，本发明首次证明ASB3对小鼠的脂代谢存在影响。ASB3在肝脏中可通过其泛素化修饰潜在底物影响线粒体脂肪酸β‑氧化，并且在动物
水平氧耗量的增多可以从侧面印证脂肪酸氧化过程的耗氧，以及脂肪酸的氧化而产生更多
的热量。该过程在夜间，即小鼠主要活动时间，更为明显。
水平氧耗量的增多可以从侧面印证脂肪酸氧化过程的耗氧，以及脂肪酸的氧化而产生更多
的热量。该过程在夜间，即小鼠主要活动时间，更为明显。
[0071] 本发明从线粒体的角度及脂肪酸氧化的直接角度阐释了对脂代谢的影响。本发明的实验结果发现在正常喂养情况下饥饿16h后小鼠血糖并无明显差异，而高脂喂养下饥饿
16h后，敲除鼠的基础血糖较野生型小鼠低，提示脂类物质的代谢可能占据了主导作用。并
且血液中的甘油三酯以及肝脏中的甘油三酯的含量变化尤为明显，此外，前期的RNAseq数
据也指向了脂代谢相关过程。
16h后，敲除鼠的基础血糖较野生型小鼠低，提示脂类物质的代谢可能占据了主导作用。并
且血液中的甘油三酯以及肝脏中的甘油三酯的含量变化尤为明显，此外，前期的RNAseq数
据也指向了脂代谢相关过程。
[0072] 综上，本发明的研究结果提示了ASB3影响脂肪酸代谢的可能，推测ASB3可以通过泛素化降解过程影响线粒体β氧化过程，从而影响胞内脂类物质的的堆积，长期以致影响体
重和体成份的明显变化。
重和体成份的明显变化。
[0073] 以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的
变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。