一种双垂鹤鸵性别分子鉴定方法及引物

摘要

本发明公开了一种双垂鹤鸵性别分子鉴定方法及引物。一种双垂鹤鸵性别分子鉴定引物，由SEQ ID NO.1所示的CAW1和SEQ ID NO.2所示的CAW2组成。本发明所述的双垂鹤鸵性别分子鉴定引物在双垂鹤鸵性别鉴定中的应用。一种双垂鹤鸵性别分子鉴定试剂盒，包含本发明所述的引物。本发明即可采用血液样本也可采用羽毛样本，均能得到准确的鉴定结果。该方法能方便有效的对双垂鹤鸵进行性别鉴定，重复性较好，为该物种在分子水平性别鉴定奠定了基础。

权利要求

1.一种双垂鹤鸵性别分子鉴定引物，其特征在于由SEQ ID NO.1所示的CAW1和SEQ ID NO.2所示的CAW2组成。

2.权利要求1所述的双垂鹤鸵性别分子鉴定引物在双垂鹤鸵性别鉴定中的应用。

3.一种双垂鹤鸵性别分子鉴定试剂盒，其特征在于包含权利要求1所述的引物。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于还包含除引物外的PCR常规试剂。

5.一种双垂鹤鸵性别分子鉴定方法，其特征在于包括如下步骤：(1)提取双垂鹤鸵基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR扩增；

(3)PCR扩增产物在2％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳结果中无条带表示此个体性别为雄性， 在500-750bp呈现目的条带表示此个体性别为雌性。

6.根据权利要求5所述的双垂鹤鸵性别分子鉴定方法，其特征在于PCR反应条件为：94℃1.5min；94℃20s，55℃20s，72℃20s，10个循环；94℃20s，50℃20s，72℃20s，10个循环；94℃20s，47℃20s，72℃20s，20个循环；72℃2min。

说明书

一种双垂鹤鸵性别分子鉴定方法及引物

技术领域

[0001] 本发明属于生物检测领域，涉及一种双垂鹤鸵性别分子鉴定引物及试剂盒。

背景技术

[0002] 双垂鹤鸵(Casuarius casuarius)被IUCN列为濒危物种，2011年估计其成年个体总数在2500只左右，其中野外个体少于1000只。双垂鹤鸵其主要分布于新几内亚南部和澳大利亚北部的低地森林中，但是随着人类活动范围的增加、公路铁路建设、捕猎等情况的增加，双垂鹤鸵的数量急剧下降。作为雨林旗舰物种和平胸目鸟类的特有物种的代表，双垂鹤鸵被全球众多知名动物园选为管理和繁育的优先物种。南京红山森林动物园现拥有23只双垂鹤鸵中，成年个体有6只，已配对2对(2公、2母)，尚有17只个体未完成性别鉴定及配对，是全国动物园中规模最大的双垂鹤鸵种群。

[0003] 双垂鹤鸵属于单态性鸟,它们的性别是很难从外观及其他行为上判断区别,因此鸟类性别鉴定对于珍稀鸟类保护、繁殖具有较大的意义。由于双垂鹤鸵具有一定攻击性，又属于平胸目，虽然雄性有一个阴茎的插入器官，但很难观察到。

[0004] 目前,常规的鉴定鸟类性别的方法有翻肛鉴别、类固醇鉴定、核型分析法、PCR鉴定等。发明人尝试翻肛3个月大的双垂鹤鸵都有一个软弱无力的类似阴茎的器官，无法区别性别。Chizuko Nishida-Umehara等用核型分析鹤鸵性染色体时发现Z和W染色体核型差异不大，很难区分。随着分子技术的发展，聚合酶链式反应(PCR)扩增法的应用使得突胸目性别鉴定取得突破性进展，其中较多被鉴定的序列有CHD1基因、ATP5A1基因、EE0.6序列，该技术已广泛运用到火烈鸟、美洲红鹮、鹤类等性别鉴定。由于平胸目性染色体和性别鉴定的基因序列差异较少，所以常用的突胸目性别鉴定引物无法用于平胸目的性别鉴定。Chean-Ping W等建立了雌性鸵鸟性别鉴定的RAPD方法。付晶等建立了鸸鹋性别鉴定的分子标记方法。Huynen等采用RAPD标记，利用随机引物K1和K7对现存的平胸鸟类(包括鸵鸟和鸸鹋)进行了性别的鉴定，雌性个体得到大约350bp左右的条带，这些方法虽然能够区分平胸鸟类的性别，但该标记重复性不佳。因此，急需一种能够方便有效的对双垂鹤鸵进行性别鉴定，重复性较好的方法和试剂，为双垂鹤鸵物种在行业内的饲养繁殖提供技术依据，保障圈养种群的科学繁殖，从而实现更好地迁地保护。

发明内容

[0005] 本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种双垂鹤鸵性别分子鉴定方法。

[0006] 本发明的另一目的是提供一种双垂鹤鸵性别分子鉴定引物。

[0007] 本发明的又一目的是提供一种双垂鹤鸵性别分子鉴定试剂盒。

[0008] 本发明的目的可通过以下技术方案实现：

[0009] 一种双垂鹤鸵性别分子鉴定引物，由SEQ ID NO.1所示的CAW1和SEQ ID NO.2所示的CAW2组成。

[0010] 本发明所述的双垂鹤鸵性别分子鉴定引物在双垂鹤鸵性别鉴定中的应用。

[0011] 一种双垂鹤鸵性别分子鉴定试剂盒，包含本发明所述的引物。

[0012] 所述的试剂盒优选还包含除引物外的PCR常规试剂。

[0013] 一种双垂鹤鸵性别分子鉴定方法，包括如下步骤：

[0014] (1)提取双垂鹤鸵基因组DNA；

[0015] (2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用本发明所述的引物进行PCR扩增；

[0016] (3)PCR扩增产物在2％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳结果中无条带表示此个体性别为雄性,在500-750bp呈现目的条带表示此个体性别为雌性。

[0017] PCR反应体系优选为：Mix 12.5μL，CAW1 0.5μL，CAW2 0.5μL，双蒸水6.5μL，DNA模板5μL。

[0018] PCR反应条件优选为：94℃1min；94℃15s，55℃20s，72℃20s，10个循环；94℃15s，50℃20s，72℃20s，10个循环；94℃15s，47℃20s，72℃20s，20个循环；72℃2min。

[0019] 有益效果：

[0020] 本文针对双垂鹤鸵的kW1序列，设计了特异性引物(caw1/caw2)进行性别鉴定。

[0021] 本发明利用2只已知性别的个体对该引物的有效性进行了验证,用涉及的特异性引物(caw1/caw2)进行扩增,琼脂糖凝胶电泳检测雌性为750bp左右条带，雄性无条带,阴性对照(DNA模板用双蒸水取代)无条带。因此,该方法能方便有效的对鹤鸵进行性别鉴定(如图1)。本发明即可采用血液样本也可采用羽毛样本，均能得到准确的鉴定结果。该方法能方便有效的对双垂鹤鸵进行性别鉴定，重复性较好，为该物种在分子水平性别鉴定奠定了基础。

附图说明

[0022] 图1有效性验证

[0023] 1.2000Maker 2.雌性样本1,3.雄性样本1，4.雌性样本2,5.雄性样本2，6.空白对照图2重复性试验

[0024] 1.2000Maker 2-4.雄性样本1，5-7.雌性样本1,8-10.雄性样本2，11-13.雌性样本2图3双垂鹤鸵血样性别鉴定

[0025] 1.2000Maker 2-18.依次为1-17号幼年双垂鹤鸵，19.雄性双垂鹤鸵，20.雌性双垂鹤鸵图4双垂鹤鸵羽毛性别鉴定

[0026] 1.2000Maker 2-5.4只双垂鹤鸵羽毛样本，6.雌性双垂鹤鸵，7.雄性双垂鹤鸵具体实施方式

[0027] 1.材料与方法

[0028] 1.1材料

[0029] 样本来自于南京红山森林动物园笼养条件下的17只幼年未知性别、4只已知性别的双垂鹤鸵血样和4只未知性别的双垂鹤鸵毛发；其中，4份血样来自两对已经通过成体形态和行为进行过性别鉴定,并且通过繁殖证实性别的成年个体双垂鹤鸵。取样方式为抗凝全血5μl，带有毛囊的腹羽5根。

[0030] 1.2主要试剂与仪器

[0031] 血液基因组提取试剂盒、微量基因组提取试剂盒、Taq Plus MasterMix、D2000 DNA Marker、GeneGreen核酸染料购自天根生化科技(北京)有限公司。引物(caw1/caw2)均有金斯瑞生物有限公司合成。

[0032] 梯度PCR仪购自杭州龙扬仪器公司。凝胶成像系统购自上海欧翔仪器公司。水平电泳仪购自北京君意东方有限公司。高速冷冻仪离心机购自上海沪粤明科学仪器有限公司。

[0033] 表1双垂鹤鸵性别鉴定引物序列

[0034]

[0035] 1.3实验方法

[0036] 1.3.1基因组DNA提取

[0037] 按血液基因组提取试剂盒说明书提取双垂鹤鸵血液中的基因组DNA。提取后的基因组DNA样本于-20℃保存，备用。

[0038] 1.3.2有效性试验

[0039] 利用引物(caw1/caw2)对已知性别的双垂鹤鸵基因组和空白对照进行扩增。在反应体系为：Mix 12.5μL，CAW1 0.5μL，CAW2 0.5μL，双蒸水6.5μL，DNA模板5μL。反应条件为：94℃1.5min；94℃20s，55℃20s，72℃20s，10个循环；94℃20s，50℃20s，72℃20s，10个循环；
94℃20s，47℃20s，72℃20s，20个循环；72℃2min。

[0040] 取10μl PCR扩增产物,在2％的琼脂糖凝胶上电泳30min,通过凝胶成像仪进行拍照记录结果。电泳结果中,无条带表示此个体性别为雄性,条带大小分别约500-750bp表示此个体性别为雌性。

[0041] 1.3.3目的基因序列测定与分析

[0042] 将PCR产物送金斯瑞生物技术有限公司进行克隆，并连接到T载体进行测序。

[0043] 1.3.4重复性试验

[0044] 对4只已知性别(2雌2雄)的样本进行PCR扩增，每个样本重复扩增三次，琼脂糖凝胶电泳检测。

[0045] 1.3.5双垂鹤鸵性别鉴定

[0046] 利用该引物对17只未知性别双垂鹤鸵血液样本和4份羽毛样本进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测。

[0047] 2.结果

[0048] 2.1引物有效性验证

[0049] 利用4只已知性别的个体样本(2雌2雄)对该引物的有效性进行了验证,用引物(caw1/caw2)进行扩增,琼脂糖凝胶电泳检测雌性为1个条带,1条为750bp左右条带，雄性无条带,阴性对照(DNA模板用双蒸水取代)无条带。因此,该方法能方便有效的对鹤鸵进行性别鉴定(如图1)。

[0050] 2.2重复性试验

[0051] 对4只已知性别(2雌2雄)的样本进行重复性试验，每个样本重复扩增三次，琼脂糖凝胶电泳检测所成结果保持一致(如图2).

[0052] 2.3双垂鹤鸵性别血样鉴定结果

[0053] 利用该引物对双垂鹤鸵未知性别的个体进行鉴定,血液鉴定结果如图3,17只未知性别的双垂鹤鸵中有9只为雌性，8只为雄性。

[0054] 2.4核苷酸序列分析

[0055] 将目的条带的PCR产物送金斯瑞生物技术有限公司进行克隆测序测序。测序结果显示序列大小为715bp(SEQ ID NO.3所示)。

[0056] 2.5双垂鹤鸵性别羽毛鉴定结果

[0057] 按微量基因组提取试剂盒说明书提取双垂鹤鸵羽毛的基因组DNA，利用caw1/caw2引物对对17只未知性别的双垂鹤鸵中四只(2.3中的12-15号双垂鹤鸵)进行性别鉴定。鉴定结果见图4，与血样鉴定结果一致。