天花粉或其提取物的新用途

摘要

本发明提供天花粉或其提取物在制备治疗糖尿病视网膜病变的药物中的应用，所述天花粉提取物为天花粉乙酸乙酯提取物。

权利要求

1.天花粉提取物在制备治疗糖尿病视网膜病变的药物中的应用，其特征在于，所述天花粉提取物按如下方法制备：

步骤a，天花粉药材加石油醚提取，弃去石油醚提取液，石油醚提取后的药渣继续用二氯甲烷提取，弃去提取液，药渣备用；

步骤b，将步骤a经二氯甲烷提取后的药渣用乙酸乙酯提取，收集乙酸乙酯提取液，回收乙酸乙酯，得天花粉乙酸乙酯提取物。

2.一种治疗糖尿病视网膜病变的天花粉提取物，其特征在于，所述天花粉提取物按如下方法制备：

步骤a，天花粉药材加石油醚提取，弃去石油醚提取液，石油醚提取后的药渣继续用二氯甲烷提取，弃去提取液，药渣备用；

步骤b，将步骤a经二氯甲烷提取后的药渣用乙酸乙酯提取，收集乙酸乙酯提取液，回收乙酸乙酯，得天花粉乙酸乙酯提取物。

说明书

天花粉或其提取物的新用途

技术领域

[0001] 本发明涉及一种天花粉提取物及其治疗糖尿病视网膜病变的用途，属于中医药领域。

背景技术

[0002] 天花粉为葫芦科植物栝楼Trichosanthes kirilowii Maxim.或双边栝楼Trichosanthes rosthornii Herms的干燥根，又名栝楼根、花粉、栝蒌粉、蒌粉等。其用药最
早见于《神农本草经》，主治热病口渴、消渴(糖尿病)、黄疸、肺燥咳血、痈肿、痔痿。

[0003] 天花粉的主要成分为蛋白质、淀粉、植物凝血素、多糖、皂苷等，目前研究最广泛的是天花粉蛋白，具有终止妊娠、抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、抗炎、影响免疫系统等药理作用。天
花粉多糖有葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、木糖组成，具有明显的免疫增强作用，同时还有
显著的抗肿瘤和细胞毒活性。

[0004] 现代药理研究发现，天花粉具有致流产、抗早孕、抗癌、抗菌、抗病毒等作用。天花粉主要成分为蛋白质、淀粉、植物凝血素、多糖、皂苷等，目前研究最广泛的是天花粉蛋白，
具有终止妊娠、抗肿瘤、抗病毒、抗真菌、抗炎、影响免疫系统等药理作用。

[0005] 现有技术已公开，天花粉具有一定的降糖作用，用胰岛细胞膜色谱法模型筛选的活性部位具有降低正常小鼠、四氧嘧啶高血糖小鼠血糖的作用；腹腔注射天花粉蛋白可明
显减轻NOD鼠胰岛炎的严重程度，并明显降低其糖尿病的发病率。此外，天花粉复方制剂亦
具有良好的降血糖作用，从古至今治疗消渴病的药方中天花粉的使用频率均很高。然而，未
见有关天花粉治疗糖尿病并发症的药理研究的报道。

发明内容

[0006] 针对现有技术存在的不足，本发明提供天花粉或其提取物治疗糖尿病眼底病变的用途。

[0007] 作为本发明的一个方面，本发明提供天花粉在制备治疗糖尿病眼底病变的药物中的应用。

[0008] 作为本发明的一个方面，本发明提供天花粉提取物在制备治疗糖尿病眼底病变的药物中的应用。

[0009] 在具体的实施方式中，所述天花粉或其提取物治疗糖尿病眼底病变包括糖尿病性视网膜病变。

[0010] 在具体的实施方式中，所述糖尿病性视网膜病变包括非增殖性糖尿病性视网膜病变(NPDR)、增殖性糖尿病性视网膜病变(PDR)。

[0011] 在优选的实施方式中，所述糖尿病性视网膜病变为增殖性糖尿病性视网膜病变。

[0012] 在具体的实施方式中，所述天花粉提取物是指天花粉经有机溶剂提取的过程而得到的提取物；所述“经有机溶剂提取的过程”是指提取过程包括但不限于有机溶剂的提取。

[0013] 在一种实施方式中，所述天花粉提取物是指天花粉经极性为3.5～6的有机溶剂提取的过程而得到的提取物。优选的，所述提取药渣的有机溶剂极性为3.6～5.9；进一步优选
的有机溶剂极性为：3.7～5.8；进一步优选的有机溶剂极性为：3.8～5.7；进一步优选的有
机溶剂极性为：3.9～5.6；进一步优选的有机溶剂极性为：3.9～5.5；进一步优选的有机溶
剂极性为：4.0～5.3；进一步优选的有机溶剂极性为：4.0～5.1；进一步优选的有机溶剂极
性为：4.0～4.9；进一步优选的有机溶剂极性为：4.0～4.7。

[0014] 在一种实施方式中，所述天花粉提取物是指天花粉先经过极性小于3.5的有机溶剂提取，弃去提取液，药渣再经过极性为3.5～6的有机溶剂提取的过程得到的提取物。优选
的，所述提取药渣的有机溶剂极性为3.6～5.9；进一步优选的有机溶剂极性为：3.7～5.8；
进一步优选的有机溶剂极性为：3.8～5.7；进一步优选的有机溶剂极性为：3.9～5.6；进一
步优选的有机溶剂极性为：3.9～5.5；进一步优选的有机溶剂极性为：4.0～5.3；进一步优
选的有机溶剂极性为：4.0～5.1；

[0015] 进一步优选的有机溶剂极性为：4.0～4.9；进一步优选的有机溶剂极性为：4.0～4.7。

[0016] 其中，所述极性小于3.5的有机溶剂选自石油醚、正己烷、环己烷、环戊烷、四氯化碳、甲苯、苯、异丁醇、乙醚、二氯甲烷中的任意一种或几种；

[0017] 所述极性为3.5～6的有机溶剂选自正丁醇、乙酸丁酯、丙醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、异丙醇、氯仿、吡啶、丙酮中的任意一种或几种。

[0018] 所述提取物可以直接制备各种临床常规剂型，也可以加入常规辅料制备程临床所需的各种剂型，包括但不限于胶囊、片剂、颗粒剂、口服液、分散片、缓释制剂等。

[0019] 在具体的实施方式中，所述天花粉提取物为天花粉乙酸乙酯提取物；所述天花粉乙酸乙酯提取物具体是指：天花粉的提取过程包括乙酸乙酯提取的过程。

[0020] 在一种实施方式中，所述天花粉乙酸乙酯提取物为天花粉直接加乙酸乙酯提取得到的提取物；

[0021] 在一种实施方式中，所述天花粉乙酸乙酯提取物为天花粉经极性小于乙酸乙酯的有机溶剂提取后，弃去提取液，经提取剩余的药渣用乙酸乙酯提取所得到的提取物。

[0022] 所述极性小于乙酸乙酯的有机溶剂选自石油醚、正己烷、环己烷、环戊烷、四氯化碳、甲苯、苯、异丁醇、乙醚、二氯甲烷中的任意一种或几种；

[0023] 所述提取方法包括常规的各种提取方法，如回流提取、超声提取、渗漉提取、微波提取等。

[0024] 所述提取时间和溶剂用量均为常规水平。

[0025] 作为本发明的另一个方面，本发明提供一种天花粉提取物，所述提取物按如下方法制备：

[0026] 步骤a，天花粉加极性小于3.5的有机溶剂提取，弃去提取液，保留药渣，备用；

[0027] 步骤b，将步骤a保留的药渣继续用极性为3.5～6的有机溶剂提取，收集提取液，回收有机溶剂，得天花粉提取物；优选的，所述提取药渣的有机溶剂极性为3.6～5.9；进一步
优选的有机溶剂极性为：3.7～5.8；进一步优选的有机溶剂极性为：3.8～5.7；进一步优选
的有机溶剂极性为：3.9～5.6；进一步优选的有机溶剂极性为：3.9～5.5；进一步优选的有
机溶剂极性为：4.0～5.3；进一步优选的有机溶剂极性为：4.0～5.1；进一步优选的有机溶
剂极性为：4.0～4.9；进一步优选的有机溶剂极性为：4.0～4.7。

[0028] 其中，所述极性小于3.5的有机溶剂选自石油醚、正己烷、环己烷、环戊烷、四氯化碳、甲苯、苯、异丁醇、乙醚、二氯甲烷中的任意一种或几种；所述极性为3.5～6的有机溶剂
选自正丁醇、乙酸丁酯、丙醇、四氢呋喃、乙酸乙酯、异丙醇、氯仿、吡啶、丙酮中的任意一种
或几种。

[0029] 所述提取方法包括回流提取、超声提取、渗漉提取、微波提取等方法；

[0030] 步骤a可依次用极性逐渐增大的溶剂重复提取1‑3次，弃去提取液，保留药渣。

[0031] 作为优选的实施方式，本发明提供一种天花粉乙酸乙酯提取物，所述提取物按如下方法制备：

[0032] 步骤a，天花粉加极性小于乙酸乙酯的有机溶剂提取，弃去提取液，保留药渣，备用；

[0033] 步骤b，将步骤a保留的药渣继续用乙酸乙酯提取，收集提取液，回收乙酸乙酯，得天花粉提取物；

[0034] 其中，所述极性小于乙酸乙酯的有机溶剂选自石油醚、正己烷、环己烷、环戊烷、四氯化碳、甲苯、苯、异丁醇、乙醚、二氯甲烷中的任意一种或几种。

[0035] 进一步优选的，所述天花粉乙酸乙酯提取物按如下方法制备：

[0036] 步骤a，天花粉药材加石油醚提取，弃去石油醚提取液，石油醚提取后的药渣继续用二氯甲烷提取，弃去提取液，药渣备用；

[0037] 步骤b，将步骤a经二氯甲烷提取后的药渣用乙酸乙酯提取，收集乙酸乙酯提取液，回收乙酸乙酯，得天花粉乙酸乙酯提取物。

[0038] 本发明所述“药渣”是指天花粉经溶剂提取后剩余的药材部分或未被溶剂溶解的部分。

具体实施方式

[0039] 实施例1天花粉乙酸乙酯提取物的制备

[0040] 取天花粉药材，粉碎，过四十目筛，至于索氏提取器中，加12倍量正己烷提取，提取液至无色，提取液弃掉，药渣挥干，加12倍量的乙醚提取，提取液至无色，提取液弃掉，药渣
挥干，加12倍量的乙酸乙酯进行提取，提取至无色，收集乙酸乙酯提取液，回收乙酸乙酯，得
到乙酸乙酯提取物A。

[0041] 实施例2天花粉乙酸乙酯提取物的制备

[0042] 取天花粉药材，粉碎，过四十目筛，至于索氏提取器中，加12倍量石油醚提取，提取液至无色，提取液弃掉，药渣挥干，加12倍量的乙醚提取，提取液至无色，提取液弃掉，药渣
挥干，加12倍量的乙酸乙酯进行提取，提取至无色，收集乙酸乙酯提取液，回收乙酸乙酯，得
到乙酸乙酯提取物B。

[0043] 实施例3天花粉乙酸乙酯提取物的制备

[0044] 取天花粉药材，粉碎，过四十目筛，至于索氏提取器中，加12倍量石油醚提取，提取液至无色，提取液弃掉，药渣挥干，加12倍量的异丁醇提取，提取液至无色，提取液弃掉，药
渣挥干，加12倍量的乙酸乙酯进行提取，提取至无色，收集乙酸乙酯提取液，回收乙酸乙酯，
得到乙酸乙酯提取物C。

[0045] 实施例4天花粉乙酸乙酯提取物的制备

[0046] 取天花粉药材，粉碎，过四十目筛，至于索氏提取器中，加12倍量正己烷提取，提取液至无色，提取液弃掉，药渣挥干，加12倍量的二氯甲烷提取，提取液至无色，提取液弃掉，
药渣挥干，加12倍量的乙酸乙酯进行提取，提取至无色，收集乙酸乙酯提取液，回收乙酸乙
酯，得到乙酸乙酯提取物D。

[0047] 实施例5天花粉乙酸乙酯提取物的制备

[0048] 取天花粉药材，粉碎，过四十目筛，至于索氏提取器中，加12倍量石油醚提取，提取液至无色，提取液弃掉，药渣挥干，加12倍量的二氯甲烷提取，提取液至无色，提取液弃掉，
药渣挥干，加12倍量的乙酸乙酯进行提取，提取至无色，收集乙酸乙酯提取液，回收乙酸乙
酯，得到乙酸乙酯提取物E。

[0049] 实施例6天花粉乙酸乙酯提取物的制备

[0050] 取天花粉药材，粉碎，过四十目筛，加12倍量85％的乙醇溶液超声提取，提取液浓缩，加水分散，先用石油醚萃取3次，弃去石油醚萃取液，剩余的水溶液再用乙酸乙酯萃取3
次，合并萃取物，回收乙酸乙酯，得到乙酸乙酯提取物F。

[0051] 实施例7天花粉水提取物的制备

[0052] 取天花粉药材，粉碎，过四十目筛，加12倍量水回流提取，提取物浓缩，得到天花粉水提取物G。

[0053] 实施例8天花粉甲醇提取物的制备

[0054] 取天花粉药材，粉碎，过四十目筛，加12倍量甲醇回流提取，提取物浓缩，得到天花粉甲醇提取物H。

[0055] 实施例9天花粉提取物对细胞活力的影响

[0056] 1实验方法

[0057] 将RF/6A细胞通过胰酶消化后制备成单细胞悬液，接种到96孔板中，在37℃二氧化碳培养箱中培养24h。为达到细胞同步化，应用无血清的培养基饥饿24h。饥饿后，分别加入
不同组分的培养基，培养箱中培养72h。最后，每孔加入10μl CCK‑8检测液，培养箱培养2h，
应用酶标仪检测450nm处的吸光度值(optical density,OD)。

[0058] 2实验药物

[0059] 实施例5制备的天花粉乙酸乙酯提取物E；实施例6制备的天花粉乙酸乙酯提取物F；实施例7制备的天花粉水提物G；实施例8制备的天花粉甲醇提取物H。

[0060] 3实验结果

[0061] 结果见表1。

[0062] 表1天花粉提取物对高糖浓度培养下RF/6A细胞活力的影响(x±s)

[0063]

[0064] 注：结果以占对照组的百分比显示。与对照组比较，**P<0.01；与高糖组比较，##P<0.01。

[0065] 结果表明，与对照组比较，高糖组细胞活力升高(P<0.01)；与高糖组比较，天花粉提取物E、F和提取物G的细胞活力显著降低(P<0.01)。

[0066] 实施例10天花粉提取物对细胞迁移的影响

[0067] 1实验方法

[0068] 采用Transwell法检测细胞迁移。将5×104个/ml的细胞接种到24孔transwell双层小室的上室中。下室中加入含有10％血清的不同组分培养基。培养箱中培养24h后，用棉
签擦拭上室未迁移的细胞，在4％的多聚甲醛中固定。固定后将PBS加入上下室进行洗涤。最
后应用DAPI染色后，在倒置荧光显微镜检测拍照。

[0069] 2实验药物

[0070] 实施例5制备的天花粉乙酸乙酯提取物E；实施例6制备的天花粉乙酸乙酯提取物F；实施例7制备的天花粉水提物G。

[0071] 3实验结果

[0072] 结果见表2。

[0073] 表2天花粉提取物对高糖浓度培养下RF/6A相对细胞迁移数的影响

[0074]

[0075] 注：结果以占对照组的百分比显示。与对照组比较，**P<0.01；与高糖组比较，#P<##
0.05，P＜0.01。

[0076] 结果表明，与对照组比较，高糖组的相对细胞迁移数增多；与高糖组比较，天花粉提取物E和提取物F的细胞迁移数显著降低(P<0.01或P<0.05)；提取物G有降低趋势，但没有
显著性差异。

[0077] 实施例11天花粉提取物对细胞内皮管道形成能力的影响

[0078] 1实验方法

[0079] 向96孔板中加入40μl/孔的基质胶，培养箱中凝固30min。不同组分稀释的细胞接种到96孔板。培养箱中培养12h后，在倒置荧光显微镜下拍照，应用Image J软件统计管道的
总长度。

[0080] 2实验药物

[0081] 实施例5制备的天花粉乙酸乙酯提取物E；实施例6制备的天花粉乙酸乙酯提取物F；实施例7制备的天花粉水提物G。

[0082] 3实验结果

[0083] 结果见表3。

[0084] 表3天花粉提取物对细胞管道形成总长度的影响(x±s)

[0085]

[0086] 注：结果以占对照组的百分比显示。与对照组比较，**P<0.01；与高糖组比较，##P<0.01。

[0087] 结果表明，与对照组比较，高糖组的管道形成总长度升高(P<0.01)；与高糖组比较，提取物E显著减少了管道形成总长度(P<0.01)，提示该提取物能抑制高糖培养下细胞内
皮管道形成能力。提取物F有降低趋势。提取物G没有效果。

[0088] 实施例12天花粉提取物对细胞增殖的影响

[0089] 1实验方法

[0090] 采用BrdU法检测细胞增殖。将5×104个/ml的细胞接种到24孔板中进行细胞爬片，在37℃二氧化碳培养箱中培养24h。无血清培养基饥饿24h后，分别在不同组分的培养基中
培养72h。细胞在BrdU溶液中孵育2h，PBS洗涤5min×3次，4％多聚甲醛固定30min，PBS洗涤
5min×3次。Triton X‑100溶液孵育10min，PBS洗涤5min×3次。随后加入2N HCl孵育30min
破坏DNA，0.1M Na2B4O7中和20min，PBS洗涤5min×3次。BrdU单抗(1：100)4℃孵育过夜，PBS
洗涤5min×3次。抗大鼠FITC二抗(1：200)孵育2h，PBS洗涤5min×3次。室温下，DAPI对细胞
核进行染色5min，PBS洗涤5min×3次。在激光共聚焦显微镜下检测及拍照。

[0091] 2实验药物

[0092] 实施例5制备的天花粉乙酸乙酯提取物E；实施例6制备的天花粉乙酸乙酯提取物F；实施例7制备的天花粉水提物G。

[0093] 3实验结果

[0094] 结果见表4。

[0095] 表4天花粉提取物对高糖浓度培养下RF/6A BrdU阳性细胞率的影响(x±s)

[0096]

[0097] 注：与对照组比较，**P<0.01；与高糖组比较，##P≤0.01。

[0098] 结果表明，与对照组比较，高糖组BrdU阳性细胞率增加(P<0.01)；与高糖组比较，提取物E能显著抑制了BrdU阳性细胞率(P<0.01)，提示该提取物具有抑制细胞增殖的能力。

[0099] 实施例13天花粉提取物降糖作用机制研究

[0100] 1实验方法

[0101] 1.1 Real‑time PCR法检测Hippo/Notch信号通路中核心因子mRNA在视网膜血管内皮细胞中的表达

[0102] 1.1.1提取RNA的步骤

[0103] (1)将造模后的视网膜细胞用提前预冷的PBS冲洗2次，将4℃中的Trizol加入到六孔板，每孔加入1ml，放置15min，此过程在冰上操作；

[0104] (2)用细胞刮子将溶解细胞从六孔板上刮下来，转至离心管，标清组别。

[0105] (3)向1.5ml离心管中加入0.2ml氯仿，涡旋震荡15s，并且上下颠倒混匀10次，室温孵育15min；

[0106] (4)在12000g 4℃的条件下离心15min，吸取上层水相移至新的1.5ml离心管，在吸取水相时切记不要吸取中间界面，以免影响RNA纯度；

[0107] (5)在水相中加入等体积的异丙醇(约300ul)，涡旋震荡15s，并且上下颠倒混匀10次，室温孵育10min；

[0108] (6)在12000g 4℃的条件下离心10min，可见白色沉淀在管底附近，弃去上清液，注意观察沉淀的位置；

[0109] (7)加入1ml预冷的75％的乙醇，轻轻震荡混匀，悬浮沉淀；

[0110] (8)在7500g 4℃的条件下离心5min，弃掉上清液；

[0111] (9)再次加入1ml预冷的75％的乙醇，轻轻震荡混匀，悬浮沉淀；

[0112] (10)在7500g 4℃的条件下离心5min，弃掉上清液；

[0113] (11)沉淀物在冰上干燥5‑10min，为了加快沉淀物干燥，可以用10μl移液器在其相反的位置将上清液尽量吸干；

[0114] (12)用10μl DEPC水溶解沉淀，将完全溶解的溶液转移至200μl离心管，‑20℃/‑80℃保存；

[0115] (13)应用1％的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，电泳液为1×TAE的缓冲液，制胶上样，电泳时的电压为100V，大概需要20min跑样，通过凝胶成像系统观察RNA电泳条带，
分别为5s、18s及28s三条条带；

[0116] (14)用Nanodrop 2000检测RNA样品的A260/A280及A260/A230判断样品纯度(一般核酸样品的A260/A280在1.8‑2.0之间，A260/A230维持在2左右)。而且还可以获得RNA样品的浓度。

[0117] 1.1.2反转录反应的步骤

[0118] (1)在PCR的薄壁管中加入1μg cDNA、Oligo(dT)18primer 1μl，加入DEPC水至体积为13ul，移液器混匀；

[0119] (2)将薄壁管放入PCR仪中，65℃条件下10min，冰浴10min；

[0120] (3)向薄壁管中加入预混的反转录Mix(5×Reaction Buffer 4μl、10mM dNTP Mix 2μl、RNase Inhibitor 0.5μl、Transcriptor Reverse Transcriptase 0.5μl)，整个反转
录反应体系为20μl；

[0121] (4)混匀后，离心机离心10s，放入PCR仪进行反转录；反转录条件为55℃30min；85℃5min；4℃forever；将反转录后的样品放入‑20℃保存。

[0122] 1.1.3实时荧光定量聚合酶链式反应

[0123] (1)依据GenBank中提供的TEAD1、Notch1、Notch2及HES1 mRNA的基因序列，利用软件Oligo 7进一步分析引物，选取特异性强的引物序列。引物及内参β‑actin购自上海生物
工程股份有限公司北京合成部。

[0124] (2)引物序列

[0125]

[0126] (3)PCR反应体系(10μl反应体系)

[0127] 将上下游引物离心，按照引物说明的10倍体积加DEPC水稀释。反应体系：cDNA 1μl，Fast Start Universal SYBR Green Master(ROX)5μl；DEPC水3.4μl；上下游引物Mix 
0.6μl；震荡混匀后，4000rpm，4℃，离心5min。

[0128] (4)PCR扩增反应条件

[0129] 将样品置于PCR仪，扩增反应条件：50℃防止UNG酶交叉污染2分钟；95℃激活DNA聚合酶10分钟；95℃变性15秒；60℃退火并延伸60秒，共40个循环。

[0130] (5)Ct值计算

[0131] 反应结束后可以获得样品目的基因Ct值，减去内参基因Ct值获得相对Ct值，使用‑ΔΔCT
2 法计算目的基因相对表达水平，并进行统计分析。

[0132] 1.2蛋白质印迹法检测Hippo/Notch信号通路中核心蛋白在视网膜血管内皮细胞中的表达

[0133] 1.2.1细胞蛋白制备

[0134] (1)从培养箱中取出细胞，PBS冲洗2次，胰酶将细胞消化下来，转移至1.5ml离心管，800rpm，离心3min；

[0135] (2)PBS冲洗2次，倒出液体，加入50μl的RIPA裂解液，静置30min(在30min期间，反复用涡旋震荡仪涡旋，使细胞样品充分裂解)；

[0136] (3)12000rpm 4℃，离心10min，将上清液转移至新的离心管中，‑20℃保存备用；

[0137] (4)使用BCA法检测样品蛋白质浓度，并进行计算；

[0138] (5)将蛋白样品、PBS及5×蛋白上样缓冲液配置成蛋白上样量为30μg的样品，并将离心管放入95℃的水中变性10min，‑20℃保存；

[0139] 1.2.2蛋白上样及垂直电泳

[0140] (1)将预制胶放入电泳槽中，加入1×电泳缓冲液到指定位置，水平垂直拔出梳子，用10ml注射器冲洗每一个上样孔，使用10μl移液器依次加入样品，上样时要保持缓慢均匀
垂直加样手法，加样后室温静置10min；

[0141] (2)将装置连接好，先用100V恒压电泳，当Marker分离出红色条带时电压调制120V继续电泳，观测到溴芬蓝达到预制胶底部时停止电泳。

[0142] 1.2.3蛋白质电转移及PVDF膜封闭

[0143] (1)切胶：从电泳槽中取出预制胶，将预制胶的短板一侧去除，用切胶板切除无目的蛋白及内参的胶，并标记好，缓慢轻柔取出凝胶，放入电转移缓冲液的平皿内；

[0144] (2)转膜：裁剪适宜大小的PVDF膜及6张同等尺寸的滤纸。PVDF膜提前放入甲醛溶液内，滤纸及海绵放入另一盛有电转移缓冲液的平皿内，浸泡10min。将电转移槽夹板放好，
依次放置物品(负极—海绵—3张滤纸—预制胶—PVDF膜—3张滤纸—海绵—正极)，在放置
期间切勿产生气泡，放置过程可以在电转移缓冲液内进行。将转移槽夹板置于电转槽内，倒
入电转移缓冲液，并在槽内放置冰袋达到降温的效果。最后将整个电转槽放入装满冰的冰
盒内，使其维持在4℃，300mA恒流电转1.5h；

[0145] (3)封闭：将电转后的PVDF膜放入PBS内浸泡5min，将PVDF膜转移至5％的脱脂奶粉内进行封闭，37℃生化培养箱封闭1h。

[0146] (4)吸出孵育盒内封闭液，加入TBST漂洗3次，每次15min

[0147] 1.2.4抗体孵育

[0148] (1)孵育一抗：封闭液稀释一抗：TEAD1(1:2000)、Notch1(1:1000)、Notch2(1:500)、DLL1(1:300)、HES1(1:2000)；抗体稀释液稀释：MST1(1:500)、P‑MST1(1:500)、YAP(1:
1000)、P‑YAP(1:10000)。将稀释后的抗体加入抗体孵育盒中，在摇床上4℃孵育过夜；

[0149] (2)洗膜：吸出孵育盒内一抗，加入TBST漂洗3次，每次15min；

[0150] (3)孵育二抗：倒出TBST加入用封闭液稀释的二抗(1:5000)，在摇床上室温孵育2h；加入用抗体稀释液稀释的二抗(1:2000)，在摇床上室温孵育1h；

[0151] (4)洗膜：吸出孵育盒内二抗，加入TBST漂洗3次，每次15min；

[0152] 1.2.5曝光、膜再生及图像处理

[0153] (1)曝光：将易杰膜平铺与凝胶成像仪内，将PVDF膜从孵育盒中取出，用滤纸将液体吸干，将膜正面平铺于易杰膜上，均匀的加入ECL发光液，待ECL发光液孵育1min后进行曝
光。

[0154] (2)将曝光后的膜取出放入TBST内，再将其转移至膜再生液，摇床上漂洗30min；将膜放入TBST内漂洗3次，每次5min；将漂洗后的膜重新加入封闭液进行封闭，孵育一抗及二
抗，最后进行曝光。

[0155] (3)图像分析：将凝胶成像仪拍照后的照片进行分析，用目的蛋白与内参蛋白的灰度比值作为相对蛋白定量进行分析。

[0156] 2实验药物

[0157] 实施例5制备的天花粉乙酸乙酯提取物E。

[0158] 3统计学方法

[0159] 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，所有数据皆以均数±标准差 表示，首先检验数据的正态性，当数据为正态时，组间比较采用单因素方差分析(one‑way 
ANOVA)，符合方差齐性时两组间差异比较采用LSD法，不符合方差齐性时两组间差异比较采
用Tamhane法，当P≤0.05为差异有统计学意义。

[0160] 4实验结果

[0161] 4.1天花粉乙酸乙酯提取物对Hippo信号通路核心因子表达水平的影响

[0162] 分子对接结果显示，Hippo信号通路中MST1、YAP及TEAD1是天花粉乙酸乙酯提取物的作用靶点。

[0163] 4.1.1蛋白印迹法检测天花粉乙酸乙酯提取物对P‑MST1/MST2及MST1蛋白表达水平的影响

[0164] 结果见表5。

[0165] 表5天花粉乙酸乙酯提取物对P‑MST1/MST2及MST1蛋白表达水平的影响

[0166]

[0167] 注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与高糖组比较，#P<0.05。

[0168] 由上表可见，与对照组比较，高糖组细胞中P‑MST1/2蛋白表达升高(P<0.05)；与高糖组比较，天花粉乙酸乙酯提取物各组细胞中P‑MST1/2蛋白表达下降，其中高剂量组及中
剂量组具有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，高糖组细胞中MST1蛋白表达升高(P<
0.01)；与高糖组比较，天花粉乙酸乙酯提取物各组细胞中MST1蛋白表达下降，其中低剂量
组具有统计学意义(P<0.05)。

[0169] 结果显示，与对照组比较，MST1及P‑MST1/2蛋白表达升高，原因是高浓度葡萄糖不仅提高P‑MST1/2蛋白活性，同时提高MST1蛋白合成。与高糖组比较，天花粉乙酸乙酯提取物
各组MST1及P‑MST1/2蛋白表达降低，说明它不仅可以抑制MST1及P‑MST1/2蛋白合成，而且
影响其蛋白活性。

[0170] 4.1.2蛋白印迹法检测天花粉乙酸乙酯提取物对P‑YAP1及YAP1蛋白表达水平的影响

[0171] 结果见表6。

[0172] 表6天花粉乙酸乙酯提取物对P‑YAP1及YAP1蛋白表达水平的影响

[0173]

[0174] 注：与对照组比较，**P<0.01；与高糖组比较，#P<0.05，##P<0.01。

[0175] 由上表可见，与对照组比较，高糖组细胞中P‑YAP1蛋白表达升高(P<0.01)；与高糖组比较，天花粉乙酸乙酯提取物各组细胞中P‑YAP1蛋白表达下降，其中高剂量组及低剂量
组具有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，高糖组细胞中YAP1蛋白表达升高(P<0.01)；与
高糖组比较，天花粉乙酸乙酯提取物各组细胞中YAP1蛋白表达下降，其中三个剂量组均具
有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

[0176] 结果可见，与对照组比较，高糖组促进了YAP1及P‑YAP1的表达，提示高浓度葡萄糖不仅可以促进YAP1的翻译过程，而且可以加速其磷酸化，从而提高其活性；与高糖组比较，
天花粉乙酸乙酯提取物抑制了YAP1及P‑YAP1的表达提示天花粉乙酸乙酯提取物不仅可以
抑制YAP1的翻译过程，而且可以阻碍其磷酸化，从而降低其活性。

[0177] 4.1.3天花粉乙酸乙酯提取物对TEAD1 mRNA和蛋白表达水平的影响

[0178] 结果见表7‑8。

[0179] 表7天花粉乙酸乙酯提取物对TEAD1 mRNA表达水平的影响

[0180]

[0181] 注：与高糖组比较，#P<0.05，##P<0.01。

[0182] 实时荧光定量PCR法检测TEAD1基因水平发现，与对照组比较，高糖组细胞中TEAD1 mRNA的表达有升高的趋势(P>0.05)；与高糖组比较，天花粉乙酸乙酯提取物各组细胞中
TEAD1 mRNA的表达下降(P<0.05或P<0.01)。

[0183] 表8天花粉乙酸乙酯提取物对TEAD1蛋白表达水平的影响

[0184]

[0185] 注：与对照组比较，*P<0.05；与高糖组比较，#P<0.05，##P<0.01。

[0186] 蛋白印迹法检测TEAD1蛋白水平发现，与对照组比较，高糖组细胞中TEAD1蛋白表达升高(P<0.05)；与高糖组比较，天花粉乙酸乙酯提取物各组细胞中TEAD1蛋白表达下降，
其中高剂量组及中剂量组具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

[0187] 以上结果显示，与对照组比较，高糖组升高了TEAD1基因及蛋白的含量，提示高浓度葡萄糖不仅可以促进TEAD1的转录，从而调控其翻译；与高糖组比较，天花粉乙酸乙酯提
取物抑制了TEAD1的基因及蛋白水平，提示天花粉乙酸乙酯提取物可以抑制TEAD1的转录及
翻译过程。

[0188] 4.2天花粉乙酸乙酯提取物对Notch信号通路核心因子表达水平的影响

[0189] 分子对接结果显示，Notch信号通路中Notch1、Notch2、DLL1及HES1是天花粉乙酸乙酯提取物的作用靶点。

[0190] 4.2.1天花粉乙酸乙酯提取物对Notch1mRNA和蛋白表达水平的影响

[0191] 结果见表9‑10。

[0192] 表9天花粉乙酸乙酯提取物对Nocth1 mRNA表达水平的影响

[0193]

[0194] 实时荧光定量PCR法检测Notch1基因水平发现，与对照组比较，高糖组细胞中Notch1 mRNA的表达升高；与高糖组比较，天花粉乙酸乙酯提取物各组细胞中Notch1 mRNA
的表达下降。

[0195] 表10天花粉乙酸乙酯提取物对Nocth1蛋白表达水平的影响

[0196]

[0197]

[0198] 注：与对照组比较，**P<0.01；与高糖组比较，##P<0.01。

[0199] 蛋白印迹法检测Notch1蛋白水平发现，与对照组比较，高糖组细胞中Notch1蛋白表达升高(P<0.01)；与高糖组比较，天花粉乙酸乙酯提取物各组细胞中Notch1蛋白表达下
降，三个剂量组均具有统计学意义(P<0.01)。

[0200] 以上结果显示，与对照组比较，高糖组升高了Notch1基因及蛋白的含量，提示高浓度葡萄糖不仅可以促进Notch1的转录，而且调控其翻译；与高糖组比较，天花粉乙酸乙酯提
取物抑制了Notch1的基因及蛋白水平，提示天花粉乙酸乙酯提取物可以抑制Notch1的转录
及翻译过程。

[0201] 4.2.2天花粉乙酸乙酯提取物对Notch2 mRNA和蛋白表达水平的影响

[0202] 结果见表11‑12。

[0203] 表11天花粉乙酸乙酯提取物对Notch2 mRNA表达水平的影响

[0204]

[0205] 实时荧光定量PCR法检测Notch2基因水平发现，与对照组比较，高糖组细胞中Notch2 mRNA的表达升高；与高糖组比较，天花粉乙酸乙酯提取物各组细胞中Notch2 mRNA
的表达下降。

[0206] 表12天花粉乙酸乙酯提取物对Notch2蛋白表达水平的影响

[0207]

[0208] 注：与对照组比较，*P<0.05；与高糖组比较，#P<0.05。

[0209] 蛋白印迹法检测Notch2蛋白水平发现，与对照组比较，高糖组细胞中Notch2蛋白表达升高(P<0.05)；与高糖组比较，天花粉乙酸乙酯提取物各组细胞中Notch2蛋白表达下
降，中剂量组具有统计学意义(P<0.05)。

[0210] 以上结果显示，与对照组比较，高糖组升高了Notch2基因及蛋白的含量，提示高浓度葡萄糖不仅可以促进Notch2的转录，而且调控其翻译；与高糖组比较，天花粉乙酸乙酯提
取物抑制了Notch2的基因及蛋白水平，提示天花粉乙酸乙酯提取物可以抑制Notch2的转录
及翻译过程。

[0211] 4.2.3天花粉乙酸乙酯提取物对HES1 mRNA和蛋白表达水平的影响

[0212] 结果见表13‑14.

[0213] 表13天花粉乙酸乙酯提取物对HES1 mRNA表达水平的影响

[0214]

[0215]

[0216] 注：与对照组比较，*P<0.05。

[0217] 实时荧光定量PCR法检测HES1基因水平发现，与对照组比较，高糖组细胞中HES1 mRNA的表达下降(P<0.05)；与高糖组比较，天花粉乙酸乙酯提取物各组细胞中HES1 mRNA的
表达升高。

[0218] 表14天花粉乙酸乙酯提取物对HES1蛋白表达水平的影响

[0219]

[0220] 注：与对照组比较，**P<0.01；与高糖组比较，#P<0.05。

[0221] 蛋白印迹法检测HES1蛋白水平发现，与对照组比较，高糖组细胞中HES1蛋白表达降低(P<0.01)；与高糖组比较，天花粉乙酸乙酯提取物各组细胞中HES1蛋白表达升高，其中
高剂量组具有统计学意义(P<0.05)

[0222] 以上结果显示，与对照组比较，高糖组降低了HES1基因及蛋白的含量，提示高浓度葡萄糖不仅可以抑制HES1的转录，而且调控其翻译；与高糖组比较，天花粉乙酸乙酯提取物
促进了HES1的基因及蛋白水平，提示天花粉乙酸乙酯提取物可以促进HES1的转录及翻译过
程。