一类3′-氨烷氧基-木犀草素衍生物及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一类3'‑氨烷氧基‑木犀草素衍生物的制备和应用。在惰性气体保护下，以木犀草素、具有苄基的活性基团物质为原料，在碱性条件下反应，得到二苄基取代物，再与具有氨基的活性基团，在碱性条件下反应，将反应产物在金属催化剂条件下，脱去苄基转化为3'‑氨烷氧基‑木犀草素衍生物。本发明化合物可进一步成盐。本发明所述化合物具有拮抗糖尿病大鼠血管损伤，拮抗大鼠心肌缺血损伤和脑缺血损伤等多靶点作用，通过保护血管发挥有关药理药效作用，可用于制备防治糖尿病血管并发症及心脑血管疾病的药物或保健品等。

权利要求

1.一类3'-氨烷氧基-木犀草素衍生物及其药学上可成的盐，其特征在于具有下式结构：

2.根据如权利要求1所述的3'-氨烷氧基-木犀草素衍生物及其药学上可成的盐，其特征在于所述药学上可成的盐为无机酸盐或有机酸盐。

3.根据如权利要求2所述的3'-氨烷氧基-木犀草素衍生物及其药学上可成的盐，其特征在于所述无机酸盐或有机酸盐选自硫酸盐、磷酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、醋酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、葡萄糖酸盐、酒石酸盐、对甲苯磺酸盐、苯磺酸盐、甲磺酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐或马来酸盐。

4.根据权利要求1-3任一项所述3'-氨烷氧基-木犀草素衍生物及其药学上可成的盐的制备方法，其特征在于以木犀草素、具有苄基的活性物质为原料，在碱性条件下反应，得到木犀草素二苄基取代物，再在木犀草素二苄基化合物的3'位羟基引入具有氨基的活性基团，脱去保护基苄基后制备得到木犀草素衍生物，合成路线如下：所述R代表-(CH2)2N(CH3)2、-(CH2)2NH2、-(CH2)3N(CH3)2、

5.根据权利要求1-3任一项所述木犀草素衍生物及其药学上可成的盐在制备预防和治疗缺血性损伤药物中的应用。

6.根据权利要求1-3任一项所述木犀草素衍生物及其药学上可成的盐在制备预防和治疗糖尿病血管并发症及缺血性心脑血管疾病药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述糖尿病血管并发症包括糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病足，所述缺血性心脑血管疾病包括心肌缺血损伤和脑缺血损伤。

说明书

一类3′-氨烷氧基-木犀草素衍生物及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明属于药物化学领域，具体涉及一类3′-氨烷氧基-木犀草素衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一种以高血糖为特征的代谢疾病,世界上糖尿病患者人数逐年增加，目前已有4.15亿；黄种人易感高发，我国已成为世界上糖尿病患者最多的国家(患病率高达11.6％)，糖尿病患者中90％为2型糖尿病。长期高血糖使大血管、微血管受损，并严重危及到心、脑、肾、周围神经、眼睛、足等，导致糖尿病是并发症最多的疾病(高达100多种)。据美国糖尿病协会统计，糖尿病患者患病3、5、10年以上出现并发症的几率分别为46、61、98％。糖尿病血管并发症(Diabetes mellitus vascular complications,DMVC)是DM最严重的并发症，是糖尿病致死致残的主要原因，80％糖尿病患者死于该并发症。DMVC主要包括大血管并发症(冠心病、脑中风及动脉粥样硬化等)及微血管并发症(糖尿病肾病、视网膜病变、糖尿病足及周围神经病变等)。DMVC确切发病机制不完全清楚，高血糖是引起血管病变的首要动力，主要与糖尿病中糖代谢、脂代谢紊乱及高血压等多种综合因素，诱导血管损伤(VD)相关。VD包括血管内皮、血管平滑肌损伤，分别与血管内皮细胞、平滑肌细胞相关，导致血管舒缩功能、内皮分泌、屏障等功能失调。其病理分子机制主要涉及氧化、炎症应激反应等。

[0003] 目前临床上尚无专门针对DMVC的防治药物，主要采用调节血糖、血脂、血压,以及抗氧化、抗炎及抗血栓等药物进行防治，主要包括：降血糖及增加胰岛素敏感性的罗格列酮、二甲双胍及磺脲类药物；调节血脂的他汀类药物(洛伐他汀等)；降血压的血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)药物(卡托普利等)，以及钙拮抗剂降压药(硝苯地平)；抑制血栓，改善血液流变学的阿司匹林等。另外，正在研发的有抗炎药物如JAK-STAT抑制剂、中药活血化瘀类药物，黄酮类化合物等。国外曾采用单纯的抗氧化剂进行临床试验，但结果并不理想。DMVC属于复杂性疾病，采用单纯的将血脂、血压的方法，单一靶点干预的药物，无法对这类疾病进行有效的控制和治疗，更重要的是这些药物均存在较多的副作用，毒性较大，不利于长期的使用。因此，单靶点药物难以对非单基因或非单靶点导致的糖尿病血管并发症有效治疗和控制，故设计和研发多靶点药物可能是缓解和治疗糖尿病血管并发症的一条新的有效方法。

[0004] 缺血性心脑血管疾病(ICCVD)是心脑血管疾病的主要发病类型，缺血再灌注(IR)损伤是缺血性心脑血管疾病的主要病理过程，IR导致血管损伤、炎症反应、氧化应激、血栓形成等。从发病机理上看，ICCVD属于发病机理较复杂的复杂性疾病，病理机制与其复杂的病理网络有关，因此临床上防治ICCVD要针对其病理网络机制，应用综合的干预治疗方法，包括扩张血管缓解缺血，抗炎治疗，抗氧化应激，抗血栓形成，诱导缺血预适应等措施进行防治，因此多靶点干预可能是临床防治ICCVD的有效方法。

[0005] 木犀草素(Luteolin，LTD)是存在于多种药用植物和蔬菜中的天然黄酮化合物，化学名称为3′,4′,5,7-四羟基黄酮，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、降糖、拮抗血管并发症等药理作用。然而木犀草素的水溶性差，导致其成药性不佳，生物利用度低，药效有限。改善木犀草素化合物的水溶性和药效，研发活性强、毒副作用低、结构新颖的木犀草素衍生物是木犀草素化合物结构改造的研究方向。

发明内容

[0006] 本发明针对上述问题，采用化学合成法，提供了一类3′-氨烷氧基-木犀草素衍生物，通过保护血管，发挥拮抗糖尿病血管损伤，拮抗心肌缺血损伤和脑缺血损伤作用。

[0007] 本发明的技术方案如下:

[0008] 一类3′-氨烷氧基-木犀草素衍生物及其药学上可成的盐，具有下式结构：

[0009]

[0010] 其中，R代表–(CH2)nNR1R2、 其中R1和R2相同或不同，代表H或C1-C6的直链或支链的烷基，n代表1～6的整数，R3或R4代表H或C1-C6的直链或支链的烷基。

[0011] 优选的，所述R1和R2相同或不同，代表H、甲基或乙基，n代表1～4的整数，R3或R4代表H、甲基或乙基。

[0012] 更优选的，所述R代表–(CH2)2N(CH3)2、–(CH2)2NHCH3、–(CH2)2NH2、–(CH2)3N(CH3)2、具体结构如下：

[0013]

[0014] 本发明所述的3′-氨烷氧基-木犀草素衍生物，还包括所述衍生物的无机酸盐或有机酸盐。所述无机酸盐或有机酸盐选自硫酸盐、磷酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、醋酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、葡萄糖酸盐、酒石酸盐、对甲苯磺酸盐、苯磺酸盐、甲磺酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐或马来酸盐。

[0015] 本发明另一目的在于提供一种本发明所述3′-氨烷氧基-木犀草素衍生物及其药学上可成的盐的制备方法，以木犀草素、具有苄基的活性物质为原料，在碱性条件下反应，得到木犀草素二苄基取代物，再在木犀草素二苄基化合物的3′位羟基引入氨基活性基团，脱去保护基苄基后制备得到木犀草素衍生物。

[0016] 合成路线如下：

[0017]

[0018] 本发明的一个优选的制备方案，包括如下步骤：

[0019] (1)在惰性气体保护下，配制木犀草素碱性溶液，加入具有苄基的活性物质反应；

[0020] (2)向步骤(1)的反应产物中加入具有氧基活性基团的物质、三苯基膦和无水非醇类有机溶剂，搅拌，加入偶氮二甲酸二乙酯或偶氮二甲酸二异丙酯反应；

[0021] (3)将步骤(2)反应产物用甲醇溶解，H2置换反应体系，加入金属催化剂，脱去保护基苄基得到本发明所述3′-氨烷氧基-木犀草素衍生物。

[0022] 上述制备方法，步骤(1)所述惰性气体选自氮气或氩气中的一种或几种，所述具有苄基的活性物质选自氯苄，溴苄，碘苄中的一种或几种，所用碱选自二异丙基乙胺、三乙胺，吡啶或DBU，溶剂为常规有机溶剂，一个具体的实施方式使用DMF为溶剂。

[0023] 步骤(2)所述具有氨基活性基团的物质选自HO(CH2)nNR1R2、其中R1和R2相同或不同，代表H或C1-C6的直链或支链的烷基或叔丁氧羰基，n
代表1～6的整数，R3或R4代表H或C1-C6的直链或支链的烷基或叔丁氧羰基。优选的，所述R1和R2相同或不同，代表H、甲基或乙基，n代表1～4的整数，R3或R4代表H、甲基或乙基。更优选的，选自2-二甲氨基乙醇，N-叔丁氧羰基-N-甲基氨基乙醇，N-(叔丁氧羰基)乙醇胺，3-二甲氨基-1-丙醇，N-叔丁氧羰基-4-羟基哌啶或1-叔丁氧羰基-3-羟基吡咯烷。

[0024] 优选步骤(2)反应温度为15℃-20℃，反应时间为24h-48h。

[0025] 步骤(3)所述金属催化剂选自Pd/C、Au-Pd/TiO2或Ag/ZnO。

[0026] 上述制备方法，所述步骤(1)-(3)还包括对反应产物的分离纯化步骤，或者包括步骤(4)将产物进一步与酸成盐。

[0027] 本发明的一个具体的制备方案，包括如下步骤：

[0028] (1)在惰性气体保护下，配制木犀草素碱性溶液，搅拌10min，冰水浴下滴入苄基活性物质，在15-20℃搅拌24小时，TLC检测。

[0029] (2)将步骤(1)中的混合溶液浓缩，加入100mL乙酸乙脂和200mL H2O，搅拌30min，过滤，有机相浓缩得粗品。粗品经过硅胶柱色谱纯化。

[0030] (3)将步骤(2)中所得纯化馏分置于回流冷凝装置内，加入具有氨基活性基团物质、三苯基膦和无水THF，搅拌10min，冰水浴下滴入DEAD，控制反应温度15℃-20℃，LC-MS检测，反应液浓缩，硅胶柱色谱纯化。

[0031] (4)将步骤(3)中浓缩馏分用甲醇溶解，H2置换反应体系，加入金属催化剂，采用洗涤、抽滤、萃取、旋蒸其中的一种或多种方法获得产物，再与1N盐酸成盐。

[0032] 步骤(2)的一个优选的纯化方案为：LTD-Bn2粗品经硅胶柱色谱纯化，洗脱剂：EA/PE＝1/5-1/3。LTD2粗品经硅胶柱色谱纯化，洗脱剂：EA/PE＝1/3-1/1。

[0033] 本发明另一目的在于提供3′-氨烷氧基-木犀草素衍生物及其药学上可成的盐在制备预防和治疗缺血性损伤药物中的应用。优选的，所述药物为预防和治疗糖尿病血管并发症及缺血性心脑血管疾病药物，所述糖尿病并发症包括糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病足、糖尿病并发血管损伤，所述缺血性心脑血管疾病包括心肌缺血损伤和脑缺血损伤，如冠心病、脑中风等。

[0034] 本发明优点：

[0035] (1)本发明采用化学合成法，得到一种多靶点化合物3′-氨烷氧基-木犀草素衍生物及其药学上可成的盐，相较于木犀草素具有很好的溶解性和生物利用度，具有更高的保护血管活性。

[0036] (2)本发明化合物具有拮抗糖尿病血管损伤(但不影响血糖)，拮抗心肌缺血损伤和脑缺血损伤多种药理作用，作用机制具有多靶点的特点，适用于心脑血管疾病和糖尿病导致的并发症的预防和治疗。

[0037] (3)目前临床上主要的ICCVD防治药物多以单一靶点药物为主，例如钙离子拮抗剂等，而本发明从保护血管、抗炎、抗氧化等多靶点，角度研究设计相关新药候选化合物，属于创新的新药研发方向。

[0038] (4)木犀草素水溶性低，造成制备制剂难度大，生物利用度低，本发明研究设计一系列衍生物旨在提高药物水溶性，同时提高或保持其血管活性。在本发明研究的一系列衍生物中，LTD3水溶性最高但几乎没有血管活性(见表1，图13)，LTD10血管活性最好但水溶性不佳(LTD接近)，因此优选LTD2做为主要研究对象。

附图说明

[0039] 图1为本发明所述化合物LTD2的LCMS图。

[0040] 图2为本发明所述化合物LTD2的1H-NMR图。

[0041] 图3为本发明所述化合物LTD7的LCMS图。

[0042] 图4为本发明所述化合物LTD7的1H-NMR图。

[0043] 图5为本发明所述化合物LTD8的LCMS图。

[0044] 图6为本发明所述化合物LTD8的1H-NMR图。

[0045] 图7为本发明所述化合物LTD9的LCMS图。

[0046] 图8为本发明所述化合物LTD9的1H-NMR图。

[0047] 图9为本发明所述化合物LTD10的LCMS图。

[0048] 图10为本发明所述化合物LTD10的1H-NMR图。

[0049] 图11为本发明所述化合物LTD11的LCMS图。

[0050] 图12为本发明所述化合物LTD11的1H-NMR图。

[0051] 图13为本发明所述化合物LTD2及其它衍生物舒张大鼠离体胸主动脉血管的量效曲线图。

[0052] 图14为本发明所述化合物LTD2/LTD增加ZDF大鼠足部皮肤血流的激光散斑仪检测图。

[0053] 图15为本发明所述化合物LTD2/LTD增加ZDF大鼠足部血流量的统计图。(注：与ZDF组比较，*P<0.05,**P<0.01.)。

[0054] 图16为本发明所述化合物LTD2/LTD体外孵育改善ZDF大鼠离体冠状动脉血管舒张反应。(注：与ZDF组比较，**P<0.01,***P<0.001.)。

[0055] 图17为本发明所述化合物LTD2/LTD灌胃给药增强ZDF大鼠离体冠状动脉血管舒张反应。(注：与ZDF组比较，*P<0.05,***P<0.001.)。

[0056] 图18为本发明所述化合物LTD2灌胃给药对ZDF大鼠肾组织病理形态的影响(A1-A3：fa/+大鼠正常肾组织结构，B1-B3：ZDF大鼠肾组织结构，C1-C3：LTD2对ZDF大鼠肾组织结构的影响)。

[0057] 图19为本发明所述化合物LTD2灌胃给药ZDF大鼠对胸主动脉病理组织形态的影响。

[0058] 图20为不同处理组缺血心肌的典型剖面图。

[0059] 图21为本发明所述化合物LTD2对大鼠心肌缺血再灌注的保护作用。(注：与模型组比较,**P<0.01,***P<0.001.)。

[0060] 图22为不同处理组缺血脑组织的典型剖面图。

[0061] 图23校正缺血体积百分比。(注：与模型组(Model)比较,***P<0.001.)。

[0062] 图24缺血面积百分比。(注：与模型组(Model)比较,***P<0.001.)。

[0063] 图25神经行为学评分。(注：与模型组(Model)比较,**P<0.01,***P<0.001.)。

具体实施方式

[0064] 以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

[0065] 在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

[0066] 在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

[0067] 下面结合具体实施例对本发明进一步说明。

[0068] 实施例1：3′-(二甲氨基)乙氧基-木犀草素盐酸盐(1:1)(LTD2)的制备

[0069] 在惰性气体保护下，在50mL三口瓶中加入5.0g木樨草素，6.8g DIPEA和30mL DMF，搅拌10min，冰水浴下滴入4.15mL苄基氯。在15-20℃搅拌24-48小时，TLC检测，原料基本反应完全。反应混合物在真空下浓缩以后，加入100mL乙酸乙脂和200mL H2O，搅拌30min，过滤，滤饼经检测为二苄基取代物。滤液分层，水相废弃，有机相浓缩得粗品。粗品经过硅胶柱色谱纯化(洗脱剂：EA/PE＝1/5-1/3)，收集馏分旋干后得到2.0g土黄色固体LTD-Bn2，收率为24.5％。在惰性气体保护下，在50L三口瓶中加入1.0g LTD-Bn2，0.23g 2－二甲氨基乙醇，1.12g三苯基膦和30mL无水THF。搅拌10min，冰水浴下滴入680μLDEAD。在15-20℃搅拌24-48小时，LC-MS检测，发现目标分子量产物，原料有少量剩余。停止反应。反应液浓缩，剩余物经过硅胶柱色谱纯化(洗脱剂：EA/PE＝1/3-1/1)。收集馏分旋干得到0.8g淡黄色固体LTD2。收率为69.5％。在250mL三口瓶中加入700mg LTD2，120.0mg金属催化剂和100mL甲醇。
H2气置换反应体系三次，常温下过夜。次日，HPLC监测反应完成。反应液过滤除去金属催化剂，滤饼用THF洗涤。合并滤液，浓缩。剩余物中加入2mLTHF和25mL乙醇，常温下打浆2小时，过滤，得340mg固体LTD2。该固体中加入10mL1N稀盐酸，超声波下打浆20min，得乳状混浊液。
该混合物经冷冻干燥得380mg淡黄色固体LTD2盐酸盐。收率为74.1％。

[0070] LCMS[[M+H]+:358.14]，如图1所示。

[0071] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.63(1H,overlapped,H-2′),7.63(1H,overlapped,H-6′),6.99(1H,d,J＝2.63Hz,H-5′),6.93(1H,s,H-3),6.55(1H,d,J＝0.63Hz,H-8),6.23(1H,d,J＝0.63Hz,H-6),4.47(2H,m,H-1″),3.56(2H,m,H-2″)，2.856(N-CH3,s,3H),2.853(N-CH3,s,3H)如图2所示。

[0072] 所得化合物LTD2盐酸盐的化学结构式：

[0073]

[0074] 实施例2：3′-(一甲氨基)乙氧基-木犀草素盐酸盐(1:1)(LTD7)的制备

[0075] 在惰性气体保护下，在250mL三口瓶中加入9.0g LTD-Bn2，2.64g N-叔丁氧羰基-N-甲基氨基乙醇和4.87g PPh3，搅拌10min，冰水浴下滴入2.92mL DEAD。滴加完毕，反应液回至室温，继续搅拌16h。LCMS检测反应完成。反应物在真空下浓缩，得到20.0g棕色粗品。不需要进一步纯化，直接作为下一步反应的原料LTD7a01。在惰性气体保护下，20.0g粗品LTD7a01溶解在50mL二氯甲烷中，在室温下缓慢滴加10mL TFA。滴加完毕后继续搅拌16h，LCMS监测反应完成。反应液浓缩，向其中加入100mL饱和的NaHCO3溶液，用二氯甲烷萃取，滤液旋干，经过柱层析(DCM/MeOH＝50/1-15/1)得到3.0g黄色的目标化合物。在500mL单口瓶加入2.0g LTD7a02，400.0mg金属催化剂，100mL甲醇和100mL THF，H2气置换反应体系三次，常温下过夜。次日，HPLC监测反应完成。反应液过滤除去金属催化剂，滤饼用THF与甲醇混合溶液洗涤。合并滤液，浓缩。经过半制备HPLC纯化得到450.0mg LTD7。向其中加入15mL 0.1N HCl,冻干得到480.0mg LTD7盐酸盐。产率35％。

[0076] LCMS[[M+H]+:343.98]如图3所示。

[0077] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.63(1H,overlapped,H-2′),7.62(1H,overlapped,H-6′),6.99(1H,d,J＝2.75Hz,H-5′),6.94(1H,s,H-3),6.54(1H,d,J＝0.63Hz,H-8),6.22(1H,d,J＝0.63Hz,H-6),4.38(2H,m,H-1″),3.41(2H,m,H-2″)，2.67(N-CH3,s,3H)如图4所示。

[0078] 所得化合物LTD7的化学结构式：

[0079]

[0080] 实施例3：3′-氨乙氧基-木犀草素盐酸盐(1:1)(LTD8)的制备

[0081] 在惰性气体保护下，在250m L三口瓶中加入6.0g LTD-Bn2，1.6mL N-(叔丁氧羰基)乙醇胺和3.38g PPh3，搅拌10min，冰水浴下滴入1.91mL DEAD。滴加完毕，反应液回至室温，继续搅拌16h。LCMS检测反应完成。反应物在真空下浓缩，经过柱层析纯化(DCM/MeOH＝20/1-10/1)得到3.3g浅黄色粗品。在惰性气体保护下，将3.3g LTD8a01粗品溶解在30mL二氯甲烷中，在室温下缓慢滴加6.0mL TFA。滴加完毕后继续搅拌16h。HPLC监测反应完成。反应液浓缩，向其中加入30.0mL饱和的NaHCO3溶液，用二氯甲烷萃取，滤液旋干，经过柱层析(DCM/MeOH＝20/1-10/1)得到1.0g黄色的目标化合物。在500mL单口瓶加入1.0g LTD8a02，
181.0mg金属催化剂，100mL甲醇和100mL THF，H2气置换反应体系三次，常温下过夜。次日，HPLC监测反应完成。反应液过滤除去金属催化剂，加入12.0mL 1N HCl水溶液，滤饼用甲醇与水混合溶液洗涤。合并滤液，浓缩。经过半制备HPLC纯化得到280.0mg LTD8盐酸盐。产率
46.6％。

[0082] LCMS[[M+H]+:330.03]如图5所示。

[0083] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.62(1H,overlapped,H-2′),7.62(1H,overlapped,H-6′),6.99(1H,d,J＝2.75Hz,H-5′),6.94(1H,s,H-3),6.54(1H,d,J＝0.63Hz,H-8),6.22(1H,d,J＝0.63Hz,H-6),4.38(2H,m,H-1″),3.41(2H,m,H-2″)，2.67(N-CH3,s,3H)如图6所示。

[0084] 所得化合物LTD8的化学结构式：

[0085]

[0086] 实施例4：3′-(二甲氨基)丙氧基-木犀草素盐酸盐(1:1)(LTD9)的制备

[0087] 在惰性气体保护下，在250m L三口瓶中加入14.0g LTD-Bn2，1.8mL 3-二甲氨基-1-丙醇和4.84g PPh3，搅拌10min，冰水浴下滴入2.9mL DEAD。滴加完毕，反应液回至室温，继续搅拌16h。LCMS检测反应完成。反应物在真空下浓缩，经过柱层析纯化(DCM/MeOH＝20/
1-15/1)得到的粗品进一步经过半制备HPLC纯化得到了2.0g浅灰色粗品。在500.0mL单口瓶加入1.5g LTD9a01，150mg金属催化剂，100mL甲醇和100mL THF，H2气置换反应体系三次，常温下过夜。次日，HPLC监测反应完成。反应液过滤除去金属催化剂，浓缩，加入100mL EtOAc打浆处理，加入2mL 1N HCl水溶液，冻干得到900.0mg LTD9盐酸盐。收率93.1％。

[0088] LCMS[[M+H]+:372.06]如图7所示。

[0089] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.59(1H,overlapped,H-2′),7.59(1H,overlapped,H-6′),7.01(1H,d,J＝2.75Hz,H-5′),6.89(1H,s,H-3),6.55(1H,d,J＝0.63Hz,H-8),6.23(1H,d,J＝0.63Hz,H-6),4.18(2H,m,H-1″),3.29(2H,m,H-3″)，2.18(2H,m,H-2″)，2.80(N-CH3,s,3H)，2.78(N-CH3,s,3H)如图8所示。

[0090] 所得化合物LTD9的化学结构式：

[0091]

[0092] 实施例5：3′-(4″-哌啶氧基)-木犀草素盐酸盐(1:1)(LTD10)的制备

[0093] 在惰性气体保护下，在250m L三口瓶中加入14.0g LTD-Bn2，1.6mL N-叔丁氧羰基-4-羟基哌啶和4.79g PPh3，搅拌10min，冰水浴下滴入2.87mL DEAD。滴加完毕，反应液回至室温，继续搅拌16h。LCMS检测反应完成。反应物在真空下浓缩，得到30.0g浅黄色粗品。该粗品不经纯化直接用作下一步的原料。在惰性气体保护下，1.6g LTD10a01粗品溶解在100mL二氯甲烷中，在室温下缓慢滴加30mL TFA。滴加完毕后继续搅拌16h。LCMS监测反应完成。反应液浓缩，向其中加入100mL饱和的NaHCO3溶液，用二氯甲烷萃取，滤液旋干，经过柱层析(DCM/MeOH＝50/1-15/1)和半制备HPLC纯化得到1.6g白色的LTD10a02。在500mL单口瓶加入1.6g LTD10a02，160mg金属催化剂，100mL甲醇和100mL THF，H2气置换反应体系三次，常温下过夜。次日，LCMS监测反应完成。反应液过滤除去金属催化剂，滤饼用甲醇与THF混合溶液洗涤。合并滤液，浓缩，加入100mL丙酮，超声波打浆，过滤得到纯品，加入2mL 1N HCl水溶液，冻干得到377.0mg LTD10盐酸盐。收率37％。

[0094] LCMS[[M+H]+:369.99]如图9所示。

[0095] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.68(1H,s,H-2′),7.61(1H,d,J＝2.75Hz,H-6′),7.03(1H,d,J＝2.75Hz,H-5′),6.92(1H,s,H-3),6.54(1H,d,J＝0.63Hz,H-8),6.22(1H,d,J＝0.63Hz,H-6),4.01(1H,m,H-4″),3.34(2H,m,H-2″and H-6″)，3.07(2H,m,H-2″and H-6″)，
2.05(2H,m,H-3″and H-5″),1.76(2H,m,H-3″and H-5″)，如图10所示。

[0096] 所得化合物LTD10的化学结构式：

[0097]

[0098] 实施例6：3′-(3″-吡咯烷氧基)-木犀草素盐酸盐(1:1)(LTD11)的制备[0099] 在惰性气体保护下，在250mL三口瓶中加入14.0g LTD-Bn2，2.78mL 1-叔丁氧羰基-3-羟基吡咯烷和4.79g PPh3，搅拌10min，冰水浴下滴入2.87mL DEAD。滴加完毕，反应液回至室温，继续搅拌16h。LCMS检测反应完成。反应物在真空下浓缩，得到30.0g橙黄色粗品LTD11a01。该粗品不经纯化直接用作下一步的原料。在惰性气体保护下，30.0g LTD11a01粗品溶解在100mL二氯甲烷中，在室温下缓慢滴加30mL TFA。滴加完毕后继续搅拌16h。

[0100] 次日，LCMS监测反应完成。反应液浓缩，向其中加入100mL饱和的NaHCO3溶液，用二氯甲烷萃取，滤液旋干，经过柱层析(DCM/MeOH＝50/1-15/1)和半制备HPLC纯化得到1.2g白色的化合物LTD10a02。在500mL单口瓶加入1.2g LTD10a02(2.24mmol)，120mg 10％金属催化剂，100mL甲醇和100mL THF，H2气置换反应体系三次，常温下过夜。次日，LCMS监测反应完成。反应液过滤除去金属催化剂，滤饼用甲醇与THF混合溶液洗涤。合并滤液，浓缩，加入100mL丙酮，超声波打浆，过滤得到纯品，加入2mL 1N HCl水溶液，冻干得到430.0mg LTD11盐酸盐。收率51.3％。

[0101] LCMS[[M+H]+:355.96]如图11所示。

[0102] 1H NMR(400MHz,DMSO)δ7.69(1H,s,H-2′),7.65(1H,d,J＝2.63Hz,H-6′),7.03(1H,d,J＝2.63Hz,H-5′),6.94(1H,s,H-3),6.54(1H,d,J＝0.63Hz,H-8),6.23(1H,d,J＝0.63Hz,H-6),4.03(1H,m,H-3″),3.34(2H,m,H-2″)，2.89,2.73(2H,m,H-5″)，2.16(2H,m,H-
4″)如图12所示。

[0103] 所得化合物LTD11的化学结构式：

[0104]

[0105] 参考上述方法还制得如下类似物：

[0106] LTD3： LTD4： 以及LTD6a：

[0107] 实施例7：本发明所述3′-氨烷氧基-木犀草素衍生物水溶性检测

[0108] 测定样品在纯水中的溶解度，结果如下：

[0109] 表1.LTD及其衍生物水溶性

[0110]

[0111] 注：LTD及其衍生物水溶性检测主要检测了样品在纯水中完全溶解量。

[0112] 实施例8：本发明所述3′-氨烷氧基-木犀草素衍生物对大鼠离体血管的影响[0113] 1实验材料

[0114] 1.1实验动物：成年健康的雄性SPrague-Da′wley(SD)大鼠(昆明医科大学实验动物中心，许可证号：SYXK(滇)2005-0003)，体重180-220g。

[0115] 1.2实验药品及试剂配置

[0116] 样品：样品LTD购自西安旭煌生物技术公司；实施例1-6制得的3′-氨烷氧基-木犀草素衍生物LTD2、LTD7、LTD8、LTD9、LTD10、LTD11均为黄色粉末。

[0117] 药品：苯肾上腺素(phenylephrine,PE)，美国Sigma公司(批号P1240000)[0118] 试剂：水合氯醛，青岛沙子口化工厂(批号20100401)；

[0119] 2.实验方法

[0120] 2.1 LTD及其衍生物对大鼠离体血管舒张功能的影响

[0121] 2.1.1血管环的制备和平衡

[0122] 大鼠离体冠状动脉(CA)及脑基底动脉(BA)血管环制备：以水合氯醛腹(3.5mg/kg)腔注射麻醉处死大鼠，迅速取出心脏、脑，置于冰的MOPS-PSS液中。在体式解剖显微镜下，用显微手术器械分离出心脏冠状动脉(CA)及脑基底动脉(BA)血管，剪成约1mm动脉环，以机械损伤法制备去内皮及内皮完整离体血管环。用两根40μM的金属丝穿过血管环，分别挂置于DMT浴槽中的方向相反的一对金属固定器上。浴槽中盛有MOPS-PSS工作液5ml，恒温37℃且持续通入O2。待血管环全部置于DMT上后，给离体血管1mN的预负荷。每隔20min换一次MOPS-PSS工作液，平衡90min后更换MOPS-KPSS工作液(含60mM K+),检测血管环活性。活性合格(>0.5mN),且两次收缩幅度<10％用于实验。

[0123] 大鼠离体胸主动脉血管环制备：动物麻醉处死后，取出胸主动脉于4℃MOPS-PSS液中。在解剖显微镜下，剔除血管周围组织，将胸主动脉剪成约3mm-5mm长的血管环8段，将血管分别环悬挂于预置5ml MOPS-PSS缓冲液的浴槽中，一端通过与张力换能器连接Powerlab数据记录系统，另一端连接微调装置，用以调节血管环前负荷。在恒温37℃并且持续通入95％O2和5％CO2的混合气体的状态下调节微调装置，其基础张力值为1.5g。每隔20min换一+
次MOPS-PSS工作液，平衡90min后更换MOPS-KPSS工作液(含60mM K),平衡后用MOPS-PSS液冲洗3次，再用MOPS-KPSS工作液(含60mM K+)预收缩一次，达到平衡后后用MOPS-PSS液冲洗
3次，进行两次以检测血管活性，检测血管环活性。若张力值变化值达基础张力的两倍则活性合格,且两次收缩幅度<10％用于实验。

[0124] 2.1.2离体血管环张力测定

[0125] 在离体CA/BA血管环浴槽中加入U46619(1μM)收缩血管，收缩达到最大值且保持平衡后，分别以累积浓度法加入LTD、LTD2，观察其对血管环张力的影响。

[0126] 在离体胸主动脉血管浴槽中加入PE(1μM)收缩血管，待收缩达到最大值且保持平衡后，分别加入LTD2、LTD3、LTD4、LTD6a、LTD7、LTD8、LTD9、LTD10、LTD11的不同系列浓度样品，记录血管张力，观察剂量反应。

[0127] 2.2数据处理

[0128] 实验结果均以(means±SE)表示，采用SigmaStat 10.0统计分析软件对数据进行分析处理，计算EC50,采用SigmaPlot绘制量效曲线图。

[0129] 3实验结果

[0130] 3.1 LTD/LTD2对离体CA/BA血管的影响

[0131] LTD由于水溶性低，造成制剂制备难度大，生物利用度低，因此研究设计衍生物LTD2,旨在提高其水溶性，同时提高或保持其血管活性。

[0132] 结果如表2、3所示，以累积剂量法加入LTD/LTD2(0.3-100μM)，均可以舒张离体大鼠的内皮完整或去内皮CA/BA血管。在内皮完整的BA血管上，LTD2舒张血管的EC50值明显低于LTD；在去内皮(内皮不完整)CA/BA血管上，LTD2舒张血管的EC50值也明显低于LTD。实验结果提示，LTD2舒张血管活性高于LTD。

[0133] 表2.LTD/LTD2舒张大鼠内皮完整血管BA的EC50及Emax

[0134]

[0135] ANOVA on Ranks,vs LTD2，*P<0.05

[0136] 表3.LTD/LTD2舒张大鼠去内皮血管CA/BA的EC50及Emax

[0137]

[0138] ANOVA on Ranks,vs LTD2，＊P<0.05

[0139] 3.2 LTD2及衍生物对离体大鼠胸主动脉血管的影响

[0140] LTD2、LTD3、LTD4、LTD6a、LTD7、LTD8、LTD9、LTD10、LTD11舒张大鼠离体胸主动脉血管的量效曲线如图13所示，结果显示：在SD大鼠离体胸主动脉上，与LTD2(200μM～1000μM)相比LTD10(200μM～1000μM)的效果最明显；在累计浓度为200μM～400μM时，LTD8、LTD9、LTD11与LTD2相比均有比较好的活性，能舒张胸主动脉血管，对血管的舒张功能产生影响。结果表明化合物LTD2、LTD7、LTD8、LTD9、LTD10、LTD11能对离体大鼠胸主动脉血管的舒张功能起作用，且LTD10的效果更明显。

[0141] 在这些衍生物中，LTD3水溶性最高但几乎没有血管活性(见表1，图13)，LTD10血管活性最好但水溶性不佳(LTD接近)，实验证明LTD2水溶性及血管活性均较高，因此后续选择LTD2做为主要目标化合物进行研究。

[0142] 实施例9：LTD2/LTD拮抗糖尿病大鼠的血管损伤实验

[0143] 1.1实验材料实验动物：雄性糖尿病ZDF大鼠和正常雄性fa/+大鼠(正常对照)，ZDF大鼠体重388±6.95g，fa/+大鼠体重332±8.67g。8周龄时购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2016-0011。ZDF大鼠和正常对照大鼠均用Purina 5008饲料(PMI营养国际有限责任公司)喂养，饲养至32周龄时开始试验。

[0144] 1.2实验方法

[0145] 1.2.1对糖尿病ZDF大鼠微循环血流量的影响.

[0146] 测定33周龄糖尿病ZDF大鼠和fa/+大鼠足部皮肤血流，比较两者血流差异，观察ZDF大鼠足部皮肤VD情况。36周龄时，ZDF大鼠用LTD2灌胃(45mg/kg)3周，测定其足部皮肤血流，与灌胃给药前(33周龄)血流值比较，观察LTD2对ZDF大鼠足部皮肤血流的影响。

[0147] 具体检测方法：ZDF大鼠用异氟烷吸入麻醉后，用脱毛膏除去左后肢毛，后采用激光散斑血流成像仪测定ZDF和fa/+大鼠的左后肢足部皮肤血流情况。统一选取中趾和足背中间两个部位作为观察和数据采集部位。

[0148] 1.2.2对糖尿病ZDF大鼠血管舒缩功能的影响

[0149] 实验大鼠从33周龄开始，采用微血管张力测定系统检测ZDF与fa/+大鼠的内皮依赖性舒张反应和非内皮依赖性舒张反应；受试药LTD2、LTD灌胃给药给予ZDF大鼠，从36周龄开始灌胃，3周后(39周)开始测定离体血管张力。

[0150] 具体检测方法：

[0151] 大鼠采血后，迅速取出心脏置于冰的MOPS-PSS液中。在体式解剖显微镜下，用显微手术器械分离出CA，剪成约1mm动脉环，用两根40μM的金属丝穿过血管环，分别挂置于DMT浴槽中的方向相反的一对金属固定器上。浴槽中盛有MOPS-PSS工作液5ml，恒温37℃且持续通入O2。待血管环全部置于DMT上后，给CA 1mN的预负荷。每隔20min换一次MOPS-PSS工作液，平衡90min后更换MOPS-KPSS工作液(含60mM K+),检测血管环活性。活性合格(>0.5mN),且两次收缩幅度<10％用于实验。

[0152] (1)LTD2体外孵育ZDF大鼠离体血管对VD的影响：血管平衡并检测活性合格后，加入LTD2(10μM、30μM)预孵育CA血管环30min，加入U46619(终浓度为1μM)或5ml60mM K+收缩血管，待收缩达到最大值且保持平衡后加入Ach或SNP累积浓度(0.001μM～100μM)，观察离体血管内皮依赖性及非依赖性舒张反应的量效曲线。

[0153] (2)LTD2灌胃给药对ZDF大鼠离体血管VD的影响：用LTD2连续灌胃给药(45mg/kg,ig)3周后处死动物，制备ZDF大鼠离体血管CA，加入累积浓度的Ach和SNP，观察离体血管内皮依赖性及非依赖性血管舒张反应。

[0154] 1.2.3 LTD2对ZDF大鼠肾组织组织损伤及肾小球硬化的影响

[0155] 大鼠经药物处理后处死，取胸主动脉和左侧肾脏组织放入4％多聚甲醛溶液中固定。经脱水、石蜡包埋、切片、HE染色，最后将切片置于显微镜下观察胸主动脉与肾脏组织的病理学变化。

[0156] 1.2.4数据与统计学处理

[0157] 实验结果均以(means±SE)表示，采用SigmaStat 10.0统计分析软件对数据进行统计分析。采用SigmaPlot作图，模拟计算半数有效浓度(EC50)。血流值、EC50、Emax等符合正态分布且方差齐的数据用t检验(t-test)、单因素方差分析(one-way ANOVA)，非正态分布数据用秩和检验(Mann-Whitney Rank Sum Test)。浓度反应曲线用双因素方差分析(two-way ANOVA)。P<0.05为差异有统计学意义。

[0158] 1.3实验结果

[0159] 1.3.0 LTD/LTD2对ZDF大鼠血糖、血脂及肝肾功能指标的影响.

[0160] 采用血液生化检测方法，通过检查有关分组动物血糖、血脂及肝肾功能等指标，证明LTD/LTD2灌胃给药(ig,45mg/kg)3周后，对动物血糖值无明显影响，有降低血脂的趋势，对动物肝肾功能指标无影响(如表4)。

[0161] 表4.LTD/LTD2对ZDF大鼠血糖、血脂的影响(means±SE)

[0162]

[0163] 1.3.1 LTD/LTD2对ZDF大鼠微循环血流量的影响.

[0164] 实验结果显示如图14和15以及表5所示：ZDF大鼠足部皮肤血流量明显低于正常对照大鼠血流(P<0.01)，说明ZDF大鼠皮肤血流量减少，提示ZDF大鼠皮肤血管损伤。LTD2灌胃给药后，ZDF大鼠足部皮肤血流量明显升高，说明LTD2具有改善血流的作用。

[0165] 表5.LTD/LTD2对ZDF大鼠微循环血流量的影响

[0166]

[0167] Mann-Whitney Rank Sum Test,ZDF vs fa+，*P＜0.05，**P＜0.01

[0168] 1.3.2 LTD2/LTD对ZDF大鼠血管舒缩功能的影响

[0169] (1)LTD2/LTD体外孵育对ZDF大鼠离体血管VD的影响

[0170] 结果如表6、7和图16所示。与正常大鼠Control(fa/+)比较，模型组Model糖尿病ZDF大鼠冠状动脉CA血管的舒张反应明显减弱，包括Ach诱导的血管内皮依赖性舒张反应与SNP诱导的非内皮依赖性舒张反应，模型组ZDF大鼠的SNP舒张反应较弱，其EC50值无法检测，证明糖尿病ZDF大鼠出现明显血管内皮及非内皮功能损伤。

[0171] LTD2/LTD(10μM)体外孵育血管CA后，其对于Ach/SNP诱导的内皮依赖性及非依赖性的血管舒张反应都有不同程度的增强作用，尤其改善了Ach诱导的内皮舒张反应，证明LTD2/LTD体外孵育可以拮抗糖尿病ZDF大鼠出现的血管损伤，其中LTD2活性较强。

[0172] 表6.LTD2/LTD(10μM)体外孵育对ZDF大鼠离体血管CA的Ach舒张作用的影响(means±SE)

[0173]

[0174] ANOVA on Ranks,Student-Newman-Keuls Method,**P<0.01，***P<0.001vs Model(ZDF)

[0175] 表7.LTD2/LTD(10μM)体外孵育对ZDF大鼠离体血管CA的SNP舒张作用的影响(means±SE)

[0176]

[0177] One Way ANOVA，***P<0.001vs Model(ZDF).

[0178] (2)LTD2灌胃给药对ZDF大鼠离体血管VD的影响

[0179] 结果如表8和图17所示。与正常大鼠Control(fa/+)比较，模型组Model糖尿病ZDF大鼠冠状动脉CA血管的Ach诱导内皮依赖性舒张反应明显减弱，其EC50值无法检测，证明糖尿病ZDF大鼠出现明显血管内皮功能损伤。

[0180] LTD2/LTD灌胃给药(ig.45mg/kg)给予大鼠3周后，其血管CA血管对于Ach诱导的内皮依赖性血管舒张反应有不同程度的增强作用，证明LTD2/LTD灌胃给药可以拮抗糖尿病ZDF大鼠出现的血管损伤。

[0181] 表8.LTD2灌胃给药对ZDF大鼠离体血管CA的Ach舒张作用的影响(means±SE)[0182]

[0183] ANOVA on Ranks,Dunn′s method,*P<0.05，***P<0.001vs Model(ZDF)[0184] 1.3.3 LTD2对ZDF大鼠肾组织组织损伤及肾小球硬化的影响

[0185] 结果如图18-19所示,与fa/+大鼠肾组织比较，ZDF大鼠肾组织体积增大，肾小球毛细血管壁增厚，肾小球系膜内有结节状玻璃样物质沉积。LTD2能明显改善ZDF大鼠肾小球硬化病变，改善肾组织中血管病变。HE染色切片也可见ZDF大鼠胸主动脉出现均质、红染、毛玻璃样透明变性，提示ZDF大鼠动脉硬化，ZDF胸主动脉内皮细胞未出现明显的结构改变。LTD2能明显改善胸主动脉的玻璃样变。提示：LTD2对糖尿病ZDF大鼠肾组织组织损伤及肾小球硬化有改善作用。

[0186] 结论：糖尿病合并高脂血症ZDF大鼠中，出现明显的血管损伤情况，包括微血管血流减少、血管舒张功能减弱、肾小球血管硬化等，而LTD2明显改善ZDF大鼠的血管舒缩功能，改善血管内皮及平滑肌功能，增加大鼠足部皮肤血流量，改善肾组织血管损伤及肾小球血管硬化等，对糖尿病诱导的血管损伤具有保护作用，可用于制备防治糖尿病血管并发症药物。

[0187] 实施例10：LTD2拮抗大鼠心肌缺血损伤实验

[0188] 1.1实验材料

[0189] 实验动物、分组：健康SD大鼠(昆明医科大学实验动物中心，许可证号：SYXK(滇)2005-0003)，雌雄各半，体重170g-220g。

[0190] 1.2实验方法

[0191] 雌雄各半，随机分为6个处理组，将SD大鼠随机分为6个处理组，即IR假手术组(Sham)，模型组(Model)，LTD2的低(12.5mg/kg,i.g.)、高(50mg/kg，i.g.)剂量组,每组n＝10。

[0192] 给药及建模：按照高(50mg/kg，i.g.)、低(12.5mg/kg，i.g.)的给药剂量以及SD大鼠体重分别称取样品，并溶于5％葡萄糖注射液。模型组给予5％葡萄糖注射液2mL/只。术前三天灌胃给药(2ml/100g)，模型组、假手术组则同法给予5％葡萄糖，每天一次，第四天再给一次，之后立即手术。具体方法为：结扎大鼠心脏左前降支(LAD)，40min后剪掉结扎线，再灌注120min，造成IR模型。

[0193] 缺血面积的测定：造模结束后，打开胸腔取出心脏，置于预冷的生理盐水中洗去血渍，去除心房、右心室及筋膜组织。将心脏置于-20℃冰箱中5min，用刀片沿横切面将心脏均匀切成厚度1mm薄片。将心脏切片放入37℃预热的1％TTC溶液中，置于水浴恒温振荡器中在37℃下振荡染色10-15min，用4％甲醛溶液固定，观察染色结果，非梗死心肌组织为红色，缺血坏死心肌组织为苍白色。将染色的心脏切片置于生理盐水中，用直尺设定好标尺后照相，用Image-Pro Plus(IPP)图像处理软件计算得出缺血面积，计算心肌缺血面积占心室面积的百分比。

[0194] 数据与统计学分析：实验结果均以 表示，采用SigmaStat 10.0统计分析软件中单因素方差分析(one-way ANOVA)的Studant-Newman-Keuls(SNK)检验进行组间两两比较，采用α＝0.05检验水平。采用SigmaPlot 10.0图形制作软件进行相关图形的制作。

[0195] 1.3实验结果

[0196] 缺血面积百分比结果见表9及图20和21,各组值间比较采用单因素方差分析(Student-Newman Keuls检验)，可见与模型组比较，LTD2低、高剂量(12.5、50mg/kg)处理组的缺血面积百分比明显减小(P<0.01,P<0.001)，提示通过灌胃给药LTD2对大鼠心IR损伤具有明显保护作用，且Lab03低、高剂量(12.5、50mg/kg)处理组与模型组比较，缺血面积百分比明显减少(P<0.001,P<0.01)，提示通过灌胃给药Lab03对大鼠心IR损伤具有明显保护作用。与LTD2低剂量(12.5mg/kg)比较，Lab03低剂量(12.5mg/kg)处理组对大鼠心肌缺血再灌注后的心肌缺血面积比明显减少(P<0.05)，提示灌胃给药Lab03(12.5mg/kg)的作用优于LTD2(12.5mg/kg)。

[0197] 表9.LTD2对大鼠心肌缺血再灌注的保护作用

[0198]

[0199] 结论：LTD2低、高剂量对大鼠心肌IR损伤均有明显的保护作用。可用于制备防治冠心病、心绞痛药物。

[0200] 实施例11：LTD2拮抗大鼠脑缺血损伤实验

[0201] 1.1实验材料

[0202] 实验动物、分组：健康SD大鼠(昆明医科大学实验动物中心，许可证号：SYXK(滇)2005-0003)，雌雄各半，体重160-180g。

[0203] 1.2实验方法

[0204] 雌雄各半，随机分为6个处理组，将SD大鼠随机分为6个处理组，即IR假手术组(Sham)，模型组(Model)，LTD2的低(12.5mg/kg,i.g.)、高(50mg/kg，i.g.)剂量组,每组n＝10。

[0205] 给药及建模：按照高(50mg/kg，i.g.)、低(12.5mg/kg，i.g.)的给药剂量以及SD大鼠体重分别称取样品，并溶于5％葡萄糖注射液。模型组给予5％葡萄糖注射液2mL/只。于术前4d给药，采用灌胃给药，2mL/只。参照Longa及沈斌等方法建立大鼠大脑中动脉缺血(MCAO)/再灌注模型。栓塞1h后行再灌注，每只动物均行右侧MCAO。

[0206] 观察指标：建模结束，腹腔注射10％水合氯醛麻醉，断头取脑，置于-20℃低温冰箱中冷冻，约15min后取出自头侧向尾侧将大脑均匀切成6片，放入1％TTC溶液中，37℃水浴恒温振荡染色10min，后在4％多聚甲醛溶液中固定1-2h。观察指标有神经功能缺失体征评分、缺血面积及校正缺血体积。

[0207] 数据与统计学分析：脑片照片用Image-Pro Plus17.0图像分析软件处理，计算出缺血面积及校正缺血体积。实验结果以 表示，采用Sigma Stat 10.0统计分析软件对数据进行分析处理。各指标多组间采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两组间采用t-test检验。

[0208] 1.3实验结果

[0209] (1)LTD2对IR大鼠校正缺血体积百分比的影响：

[0210] 与模型组(Model)比较，LTD2高剂量组的校正缺血体积百分比有明显减少(P<0.05)；结果见表10与图22和23。

[0211] 表10.校正缺血体积百分比

[0212]

[0213] (2)LTD2对IR大鼠缺血面积百分比的影响：

[0214] 与模型组(Model)比较，LTD2高剂量组的缺血面积百分比有明显减少(P<0.05)；结果见表11与图24。

[0215] 表11.缺血面积百分比

[0216]

[0217] (3)LTD2对IR大鼠神经功能的影响：

[0218] 与模型组(Model)比较，LTD2高剂量组的神经功能有明显改善(P<0.05)；结果见表12与图25。

[0219] 表12.神经行为学评分

[0220]

[0221] 结果与结论：与模型组比较，LTD2高(50mg/kg，i.g.)处理组的缺血体积百分比、缺血面积百分比及神经学评分显著减少。LTD2对大鼠脑IR损伤有明显的保护作用，可用于制备防治脑中风、脑缺血药物。