基于杜氏藻代谢途径的番茄红素高产工程菌及其构建方法与应用转让专利
申请号 : CN201910665392.6
文献号 : CN110511919B
文献日 : 2021-03-30
发明人 : 姜建国 , 陈浩宏 , 吴芳纯 , 谢红
申请人 : 华南理工大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种类胡萝卜素异构酶Crtiso,其特征在于:其氨基酸序列如SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:16所示。
2.编码权利要求1所述的类胡萝卜素异构酶Crtiso的基因,其特征在于:所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:15所示。
3.权利要求1所述的类胡萝卜素异构酶Crtiso的应用,其特征在于:所述的应用包括如下应用之一:
所述的类胡萝卜素异构酶Crtiso在合成类胡萝卜素中的应用;
或者,15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶Ziso和所述的类胡萝卜素异构酶Crtiso在合成类胡萝卜素中的应用;
或者,牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶Ggps、八氢番茄红素合成酶Psy、八氢番茄红素脱氢酶Pds、15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶Ziso、ζ-胡萝卜素脱氢酶Zds和所述的类胡萝卜素异构酶Crtiso在合成类胡萝卜素中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于:所述的牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶Ggps的氨基酸序列如GenBank:APW83740.1或SEQ ID NO:10所示;
所述的八氢番茄红素合成酶Psy的氨基酸序列如SEQ ID NO:2或GenBank:AAB51287.1所示;
所述的八氢番茄红素脱氢酶Pds的氨基酸序列如GenBank:ADD52599.1或GenBank:CAA75094.1所示;
所述的15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶Ziso的氨基酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:12所示;
所述的ζ-胡萝卜素脱氢酶Zds的氨基酸序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:14所示。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于:编码牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶Ggps的基因的核苷酸序列如GenBank:KX231795.1或SEQ ID NO:9所示;
编码八氢番茄红素合成酶Psy的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或GenBank:U91900.1所示;
编码八氢番茄红素脱氢酶Pds的基因的核苷酸序列如GenBank:GQ923693.1或GenBank:Y14807.1所示;
编码15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶Ziso的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:11所示;
编码ζ-胡萝卜素脱氢酶Zds的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:13所示。
6.根据权利要求3或4或5所述的应用,其特征在于:所述的类胡萝卜素为β-胡萝卜素或番茄红素。
7.一种基于杜氏藻代谢途径的番茄红素高产工程菌,其特征在于:基于杜氏巴氏藻(Dunaliella bardawil)代谢途径时,所述番茄红素高产工程菌含有编码GenBank:APW83740.1所示氨基酸序列的牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶Ggps基因、编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的八氢番茄红素合成酶Psy基因、编码GenBank:ADD52599.1所示氨基酸序列的八氢番茄红素脱氢酶Pds基因、编码SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶Ziso基因、编码SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的ζ-胡萝卜素脱氢酶Zds基因和编码SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的类胡萝卜素异构酶Crtiso基因;
基于杜氏盐藻(Dunaliella saline)代谢途径时,所述番茄红素高产工程菌含有编码SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶Ggps基因、编码GenBank:AAB51287.1所示氨基酸序列的八氢番茄红素合成酶Psy基因、编码GenBank:CAA75094.1所示氨基酸序列的八氢番茄红素脱氢酶Pds基因、编码SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶Ziso基因、编码SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的ζ-胡萝卜素脱氢酶Zds基因和编码SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的类胡萝卜素异构酶Crtiso基因。
8.根据权利要求7所述的基于杜氏藻代谢途径的番茄红素高产工程菌,其特征在于:基于杜氏巴氏藻(Dunaliella bardawil)代谢途径时,编码GenBank:APW83740.1所示氨基酸序列的牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶Ggps基因的核苷酸序列为如GenBank:KX231795.1所示的核苷酸序列;
编码SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的八氢番茄红素合成酶Psy基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列;
编码GenBank:ADD52599.1所示氨基酸序列的八氢番茄红素脱氢酶Pds基因的核苷酸序列为如GenBank:GQ923693.1所示的核苷酸序列;
编码SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶Ziso基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列;
编码SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的ζ-胡萝卜素脱氢酶Zds基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列;
编码SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的类胡萝卜素异构酶Crtiso基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列;
基于杜氏盐藻(Dunaliella saline)代谢途径时,编码SEQ ID NO:10所示氨基酸序列的牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶Ggps基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列;
编码GenBank:AAB51287.1所示氨基酸序列的八氢番茄红素合成酶Psy基因的核苷酸序列为如GenBank:U91900.1所示的核苷酸序列;
编码GenBank:CAA75094.1所示氨基酸序列的八氢番茄红素脱氢酶Pds基因的核苷酸序列为如GenBank:Y14807.1所示的核苷酸序列;
编码SEQ ID NO:12所示氨基酸序列的15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶Ziso基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列;
编码SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的ζ-胡萝卜素脱氢酶Zds基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列;
编码SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的类胡萝卜素异构酶Crtiso基因的核苷酸序列为如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。
9.权利要求7或8所述的基于杜氏藻代谢途径的番茄红素高产工程菌的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)利用相关基因工程手段从杜氏藻中克隆到牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶Ggps、八氢番茄红素合成酶Psy、八氢番茄红素脱氢酶Pds、15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶Ziso、ζ-胡萝卜素脱氢酶Zds、类胡萝卜素异构酶Crtiso;
(2)将Ggps和Psy构建在pACYduet-1载体上,氯霉素抗性,得到重组载体pACYduet-ggps-psy;将Pds和Zds构建在pCDFduet-1载体上,链霉素抗性,得到重组载体pCDFduet-pds-zds;将Ziso和Crtiso构建在pETduet-1载体上,氨苄抗性,得到重组载体pETduet-ziso-crtiso;
(3)然后将步骤(2)构建的三个重组载体共转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,获得基于杜氏藻代谢途径的番茄红素高产工程菌;
所述的杜氏藻为杜氏巴氏藻(Dunaliella bardawil)或杜氏盐藻(Dunaliella saline)。
10.权利要求7或8所述的基于杜氏藻代谢途径的番茄红素高产工程菌在生产番茄红素中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用,其特征在于:当杜氏藻为杜氏巴氏藻(Dunaliella bardawil)时,所述番茄红素高产工程菌的番茄红素的产率为2.0 mg/g细胞干重;
当杜氏藻为杜氏盐藻(Dunaliella saline)时,所述番茄红素高产工程菌的番茄红素的产率为3.8 mg/g细胞干重。
说明书 :
基于杜氏藻代谢途径的番茄红素高产工程菌及其构建方法与
应用
技术领域
涉及一种杜氏藻(如杜氏巴氏藻(Dunaliella bardawil)、杜氏盐藻(Dunaliella saline))
中牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Ggps)、八氢番茄红素合成酶(Psy)、八氢番茄红素脱氢
酶(Pds)、15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶(Ziso)、ζ-胡萝卜素脱氢酶(Zds)、类胡萝卜素异构酶
(Crtiso)基因的cDNA并构建出高产番茄红素的工程菌。
背景技术
在特定条件下,杜氏藻细胞中类胡萝卜素含量可达到细胞干重的14%。其高含量可能跟酶
的转化效率有很大的关系。
发明内容
(Zds)和类胡萝卜素异构酶(Crtiso)在合成类胡萝卜素中的应用。
NO:9所示。
APW83740.1所示氨基酸序列的牦牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Ggps)基因、编码SEQ ID
NO:2所示氨基酸序列的八氢番茄红素合成酶(Psy)基因、编码GenBank:ADD52599.1所示氨
基酸序列的八氢番茄红素脱氢酶(Pds)基因、编码SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的15-顺式-
ζ-胡萝卜素异构酶(Ziso)基因、编码SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的ζ-胡萝卜素脱氢酶
(Zds)基因和编码SEQ ID NO:8所示氨基酸序列的类胡萝卜素异构酶(Crtiso)基因;
GenBank:AAB51287.1所示氨基酸序列的八氢番茄红素合成酶(Psy)基因、编码GenBank:
CAA75094.1所示氨基酸序列的八氢番茄红素脱氢酶(Pds)基因、编码SEQ ID NO:12所示氨
基酸序列的15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶(Ziso)基因、编码SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的
ζ-胡萝卜素脱氢酶(Zds)基因和编码SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的类胡萝卜素异构酶
(Crtiso)基因;
为如GenBank:KX231795.1所示的核苷酸序列;其中,GenBank:APW83740.1与GenBank:
KX231795.1中的来源Dunaliella salina记载有误,实际来源应该是Dunaliella
bardawil;
GenBank:GQ923693.1中的来源Dunaliella salina记载有误,实际来源应该是Dunaliella
bardawil;
所示的核苷酸序列;
Dunaliella bardawil记载有误,实际来源应该是Dunaliella saline;
Dunaliella bardawil记载有误,实际来源应该是Dunaliella saline;
酶(Ziso)、ζ-胡萝卜素脱氢酶(Zds)、类胡萝卜素异构酶(Crtiso);
pds-zds;将Ziso和Crtiso构建在pETduet-1载体上,氨苄抗性,得到重组载体pETduet-
ziso-crtiso;
高的植物之一。本发明采用的载体的启动子都是T7启动子,包含lacZ调控元件,其在IPTG作
用的大肠杆菌BL21(DE3)中能够高表达,这有利于番茄红素的大量积累,可用于实际应用生
产。同时本发明还鉴定了ziso和crtiso的功能,验证了植物番茄红素、β-胡萝卜素的生成必
须有这两个酶的共同参与。
附图说明
BL21(DE3)菌株,2:番茄红素高产菌株);C是组合③、④、⑤、⑥、⑦、⑧获得的目的菌株。
③、④、⑤、⑥、⑦、⑧获得的目的菌株。
具体实施方式
和材料。
(高保真酶,购自Takara),进行PCR反应。
SEQ ID NO:3、5、7、GenBank:KX218392.1所示,对应编码的氨基酸序列如GenBank:
APW83740.1、SEQ ID NO:2、GenBank:ADD52599.1、SEQ ID NO:4、6、8、GenBank:ANY98896.1
所示。其中,番茄红素β-环化酶(Lycb)的氨基酸序列如GenBank:ANY98896.1所示;其基因的
核苷酸序列如GenBank:KX218392.1所示;GenBank:ANY98896.1与GenBank:KX218392.1中的
来源Dunaliella salina记载有误,实际来源应该是Dunaliella bardawil。
Dbggps并插入用引物Pac_dbpsy_F和Pac_dbpsy_R扩增得到的Dbpsy,得到pACYduet-
Dbggps-Dbpsy。引物序列如表1所示。
并插入用引物Pcd_dbzds_F和Pcd_dbzds_R扩增得到的Dbzds,得到pCDFduet-Dbpds-Dbzds;
再用AatII和KpnI双酶切pCDFduet-Dbpds-Dbzds并插入用引物Pcd_dblycb_F和Pcd_
dblycb_R扩增得到的Dblycb,得到pCDFduet-Dbpds-Dbzds-Dblycb。引物序列如表1所示。
Dbziso并插入用引物Pet_dbcrtiso_F和Pet_dbcrtiso_R扩增得到的Dbcrtiso,得到
pETduet-Dbziso-Dbcrtiso。引物序列如表1所示。
纯化的PCR片段 2μL
dH2O 5μL
Total 10μL
注意培养时间不宜过长,否则抗性失效,生长出卫星菌落,给筛选阳性克隆造成困难。
Dblycb(图2B)、pETduet-Dbziso(图3A)、pETduet-Dbcrtiso(图3B)、pETduet-Dbziso-
Dbcrtiso(图1B)。
轻轻摇匀,10000g,10min离心。(5)转上清至Hibind柱,10000g,1min离心。(6)弃掉滤液,加
入500μL Buffer HB,10000g,1min离心。(7)弃掉滤液,加入700μL DNA Wash Buffer,
10000g,1min离心。(8)重复洗一次(步骤(7))。(9)10000g,空管离心2min。(10)弃掉收集管
将HiBind柱套进干净的1.5mL EP管,加入50~100μL灭菌水(60℃预热)洗脱DNA,静置1~
2min后,10000g,1min离心。
示,组合①、②获得的目的菌株分别对应图4A、4B,组合③、④、⑤、⑥、⑦、⑧获得的目的菌株
分别对应图4C。结果表明可知,缺少15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶(Ziso)和/或类胡萝卜素异
构酶(Crtiso)时,均不能生成番茄红素的红色菌和β-胡萝卜素的土黄色菌,说明它们在生
成类胡萝卜素中起到必不可少的作用,在缺少其的情况下,均不能生成相应类胡萝卜素。
℃下振荡培养6h。加入IPTG进行诱导,培养6小时。
淀,涡旋振荡分散。(5)55℃水浴20min,每隔5min振荡一次。(6)将混合物于4℃,8000rpm下
离心20min,收集上清。(7)用丙酮定容至6mL,-20℃保存。
29.5min,90%A相和10%B相),以1mL/min的流速进行洗柱,直至平衡。
定473nm波长下工作液的峰面积,根据结果分别绘制标准曲线。
为峰面积,y为β-胡萝卜素的含量),再根据细胞的干重,可以计算出β-胡萝卜素的产率为
2.7mg/g(细胞干重)。
茄红素的含量),再根据细胞的干重,可以计算出番茄红素的含量为2.0mg/g。
Polymerase(高保真酶,购自Takara),进行PCR反应。
NO:11、13、15、GenBank:HQ728089.1所示,对应编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:10、
GenBank:AAB51287.1、GenBank:CAA75094.1、SEQ ID NO:12、14、16、GenBank:ADX41685.1所
示。其中,番茄红素β-环化酶(Lycb)的氨基酸序列如GenBank:ADX41685.1所示;其基因的核
苷酸序列如GenBank:HQ728089.1所示。
Dsggps并插入用引物Pac_dspsy_F和Pac_dspsy_R扩增得到的Dspsy,得到pACYduet1-
Dsggps-Dspsy。引物序列如表2所示。
入用引物Pcd_dszds_F和Pcd_dszds_R扩增得到的Dszds,得到pCDFduet1-Dspds-Dszds;再
用AatII和KpnI双酶切pCDFduet1-Dspds-Dszds并插入用引物Pcd_dslycb_F和Pcd_dslycb_
R扩增得到的Dslycb,得到pCDFduet1-Dspds-Dszds-Dslycb。引物序列如表2所示。
Dsziso并插入用引物Pet_dscrtiso_F和Pet_dscrtiso_R扩增得到的Dscrtiso,得到
pETduet1-Dsziso-Dscrtiso。引物序列如表2所示。
纯化的PCR片段 2μL
dH2O 5μL
Total 10μL
16h。注意培养时间不宜过长,否则抗性失效,生长出卫星菌落,给筛选阳性克隆造成困难。
Dslycb(图9)、pETduet1-Dsziso(图10)、pETduet1-Dscrtiso(图11)、pETduet1-Dsziso-
Dscrtiso(图12)。
轻轻摇匀,10000g,10min离心。(5)转上清至Hibind柱,10000g,1min离心。(6)弃掉滤液,加
入500μL Buffer HB,10000g,1min离心。(7)弃掉滤液,加入700μL DNA Wash Buffer,
10000g,1min离心。(8)重复洗一次(步骤(7))。(9)10000g,空管离心2min。(10)弃掉收集管
将HiBind柱套进干净的1.5mL EP管,加入50~100μL灭菌水(60℃预热)洗脱DNA,静置1~
2min后,10000g,1min离心。
图13所示,组合①、②获得的目的菌株分别对应图13A、13B,组合③、④、⑤、⑥、⑦、⑧获得的
目的菌株分别对应图13C。结果表明可知,缺少15-顺式-ζ-胡萝卜素异构酶(Ziso)和/或类
胡萝卜素异构酶(Crtiso)时,均不能生成番茄红素的红色菌和β-胡萝卜素的土黄色菌,说
明它们在生成类胡萝卜素中起到必不可少的作用,在缺少其的情况下,均不能生成相应类
胡萝卜素。
℃下振荡培养6h。加入IPTG进行诱导,培养6小时。
淀,涡旋振荡分散。(5)55℃水浴20min,每隔5min振荡一次。(6)将混合物于4℃,8000rpm下
离心20min,收集上清。(7)用丙酮定容至6mL,-20℃保存。
29.5min,90%A相和10%B相),以1mL/min的流速进行洗柱,直至平衡。
为峰面积,y为β-胡萝卜素的含量),再根据细胞的干重,可以计算出β-胡萝卜素的产率为
3.3mg/g(细胞干重)。
茄红素的含量),再根据细胞的干重,可以计算出番茄红素的含量为3.8mg/g。
均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。