参与调控番茄甾体生物碱合成转录因子的应用

摘要

本发明公开了参与调控番茄甾体生物碱合成转录因子的应用，转录因子SlbHLH114的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，过表达该转录因子对番茄甾体生物碱合成具有正向调控作用，因此可以通过在植物中过表达转录因子SlbHLH114，提高转基因株系的甾体生物碱含量，为番茄品质改良及优良选育提供理论依据。

权利要求

1.过表达参与调控番茄甾体生物碱合成转录因子SlbHLH114在提高植物甾体生物碱含量中的应用，其特征在于：所述转录因子SlbHLH114的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述甾体生物碱为羟基脱氢番茄碱，羟基番茄碱，δ-番茄碱苷，β2-番茄碱苷，番茄碱-o-鼠李糖苷，番茄碱，filotomatine，γ-番茄碱，番茄碱-o-己糖-戊糖苷，乙酸脱氢番茄碱，lycoperoside A和lycoperside H中的一种或多种；所述植物为番茄。

2.根据权利要求1所述参与调控番茄甾体生物碱合成转录因子SlbHLH114在提高植物甾体生物碱含量中的应用，其特征在于：所述转录因子SlbHLH114的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一种提高植物甾体生物碱含量的方法，其特征在于：将参与调控番茄甾体生物碱合成转录因子SlbHLH114在植物中过表达，所述转录因子SlbHLH114的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述植物为番茄；所述甾体生物碱为羟基脱氢番茄碱，羟基番茄碱，δ-番茄碱苷，β2-番茄碱苷，番茄碱-o-鼠李糖苷，番茄碱，filotomatine，γ-番茄碱，番茄碱-o-己糖-戊糖苷，乙酸脱氢番茄碱，lycoperoside A和lycoperside H中的一种或多种。

4.根据权利要求3所述提高植物甾体生物碱含量的方法，其特征在于：植物中过表达的方法如下：克隆转录因子SlbHLH114基因，然后构建植物表达载体，获得含有转录因子SlbHLH114的重组植物表达载体，再将获得的重组植物表达载体转化根癌农杆菌获得工程菌，最后用工程菌转化植物外植体，通过共培养、重生培养、生根培养，经阳性鉴定获得转基因植株，即为甾体生物碱含量高的植株。

5.根据权利要求4所述提高植物甾体生物碱含量的方法，其特征在于：克隆转录因子SlbHLH114基因的方法如下：以番茄cDNA为模板，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述序列为引物进行PCR扩增，扩增获得隆转录因子SlbHLH114基因。

6.根据权利要求4所述提高植物甾体生物碱含量的方法，其特征在于：所述构建植物表达载体的方法如下：将核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的序列连入pBin19-E8-GW和pBin19-

35S-GW载体而得。

说明书

参与调控番茄甾体生物碱合成转录因子的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及参与调控番茄甾体生物碱合成转录因子的应用。

背景技术

[0002] 甾体生物碱(SAs)及其糖基化形式(甾族生物碱糖苷，SGAs)是植物家族中的含氮有毒化合物，也被称为茄属生物碱，是属于茄科(Solanaceae)，特别是茄属(Solanum)家族的常见成分。在植物中，甾体生物碱常作为抗菌素，为植物提供一种预先存在的针对各种病原体的化学屏障，如α-番茄碱通过破坏膜的作用，导致电解质的泄漏和膜电位的去极化。研究表明，由于番茄细胞膜中甾体糖苷生物碱和乙酰化甾体糖苷生物碱的存在，降低α-番茄碱对植物细胞的毒性，从而使番茄植株不受其毒害。但对于人类而言，有些甾体生物碱会引起胃肠道和神经系统疾病，并在高浓度时可能致命，毒性机制包括破坏细胞膜和抑制乙酰胆碱酯酶活性。虽然甾体生物碱有助于植物抵抗多种病原体和食肉动物(包括细菌，真菌，卵菌，病毒，昆虫和动物)，但由于它们的毒性作用，多数被认为是人类的抗营养化合物。

[0003] 研究表明，茄碱的存在使番茄具有涩味，而从野生番茄到栽培番茄的育种过程中，茄碱含量在逐渐降低，其自然变异主要受到5个遗传位点控制，且受到强烈选择，其中效应最大的是位于10号染色体上的一个糖基转移酶基因簇，主要存在于红果中，通过两个主效位点便能将主要茄碱含量降低80％。最近利用多组学分析和分子生物学技术，已基本确定番茄中甾体生物碱合成的分子机制，从糖酵解途径经由甲羟戊酸途径，到环阿屯醇途径生成胆固醇，经过一系列羟化、氧化、转氨、成环等反应生成甾体生物碱，但代谢调控机制尚不清楚。因此，对参与调控番茄甾体生物碱合成的转录因子进行研究，对于改良番茄甾体生物碱含量具有重要意义。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种参与调控番茄甾体生物碱合成转录因子SlbHLH114在提高植物甾体生物碱含量中的应用；本发明的目的之二在于提供一种提高植物甾体生物碱含量的方法。

[0005] 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

[0006] 1、参与调控番茄甾体生物碱合成转录因子SlbHLH114在提高植物甾体生物碱含量中的应用，所述转录因子SlbHLH114的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0007] 优选的，所述转录因子SlbHLH114的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

[0008] 优选的，所述植物为茄科植物。

[0009] 优选的，所述植物为番茄。

[0010] 更优选的，所述甾体生物碱为hydroxytomatidenol(羟基脱氢番茄碱)，hydroxytomatidine(羟基番茄碱)，δ-tomatine(δ-番茄碱苷)，β2-tomatine(β2-番茄碱苷)，tomatidine-o-rhamnoside(番茄碱-o-鼠李糖苷)和dihydroxy tomatidine-o-hexoside-o-rhamnoside(二羟番茄碱-o-己糖-鼠李糖苷)，tomatidine(番茄碱)，tomatidine derivative(番茄碱衍生物)，filotomatine，γ-tomatine(γ-番茄碱)，tomatine(番茄碱苷)，tomatidine-o-hexosyl-o-pentoside(番茄碱-o-己二酰基-o-戊糖苷)，Acetoxydehydrotomatine(乙酸脱氢番茄碱)，lycoperoside A和lycoperside H中的一种或多种。

[0011] 2、一种提高植物甾体生物碱含量的方法，将参与调控番茄甾体生物碱合成转录因子SlbHLH114在植物中过表达，所述转录因子SlbHLH114的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0012] 优选的，植物中过表达的方法如下：克隆转录因子SlbHLH114基因，然后构建植物表达载体，获得含有转录因子SlbHLH114的重组植物表达载体，再将获得的重组植物表达载体转化根癌农杆菌获得工程菌，最后用工程菌转化植物外植体，通过共培养、重生培养、生根培养，经阳性鉴定获得转基因植株，即为甾体生物碱含量高的植株。

[0013] 优选的，克隆转录因子SlbHLH114基因的方法如下：以番茄cDNA为模板，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述序列为引物进行PCR扩增，扩增获得隆转录因子SlbHLH114基因。

[0014] 优选的，所述构建植物表达载体的方法如下：将核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的序列连入pBin19-E8-GW和pBin19-35S-GW载体而得。

[0015] 更优选的，所述植物为番茄。

[0016] 本发明的有益效果在于：本发明提供了SlbHLH114转录因子对番茄甾体生物碱合成具有正向调控作用，通过调控番茄甾体生物碱合成基因的表达从而进一步调控甾体生物碱的积累，揭示了番茄甾体生物碱代谢途径的调控机制，因此可以通过在植物中，特别是茄科植物中过量表达SlbHLH114转录因子基因获得甾体生物碱含量提高的植物，为番茄甾体生物碱的合成和分子辅助育种提供理论依据。

附图说明

[0017] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

[0018] 图1为实时荧光定量PCR检测番茄稳定转基因果实中和叶片SlbHLH114表达量情况(A：果实；B：叶片；E8-SlbHLH114-C/I：表示含有E8启动子的不同转基因番茄品系；35S-SlbHLH114-NPTII-11/24：表示含有35S启动子的不同转基因番茄品系；WT：wild type)。

[0019] 图2为LC-MS检测番茄稳定转基因果实中甾体生物碱含量情况(E8-SlbHLH114-C/I：表示含有E8启动子的不同转基因番茄品系；WT：wild type)。

[0020] 图3为LC-MS检测番茄稳定转基因叶片中甾体生物碱含量情况(35S-SlbHLH114-NPTII-11/24：表示含有35S启动子的不同转基因番茄品系，WT：wild type)。

具体实施方式

[0021] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

[0022] 通过对番茄甾体生物碱合成与调控的研究，通过转录组、代谢组和蛋白组联合分析阐述了番茄甾体生物碱的合成代谢通路。接着通过时空高分辨率代谢组与转录组联合分析的方法，定位到一个bHLH家族转录因子(Solyc01g096370)与番茄甾体生物碱及其代谢通路基因呈现共表达模式，因此，推测该转录因子可能调控番茄甾体生物碱的合成。为验证上述猜想，本发明采用农杆菌介导法，将SlbHLH114导入番茄子叶中，经发芽、生根，长出稳定转基因番茄植株，T0代鉴定及筛选阳性植株，T1代发现转录因子和合成基因大量表达，从而导致甾体生物碱含量显著提高。

[0023] 实施例1、番茄SlbHLH114基因的克隆

[0024] (1)番茄叶片总RNA的提取

[0025] 取适量番茄叶片，速冻于液氮中，使用快速研磨仪，按照45Hz,30s,进行充分粉碎三次，加入裂解液，按照植物RNA提取试剂盒V1.5(BIOFIT)说明书抽提总RNA。使用琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，使用NanoDrop 2000分光光度计检测RNA浓度。

[0026] (2)番茄SlbHLH114基因的克隆

[0027] 以提取的总RNA为模板，按照Takara反转录试剂盒说明书合成cDNA；根据SlbHLH114基因的序列设计基因特异性引物，具体序列如下：

[0028] SlbHLH114上游引物：5’-atggaacaactcgcggtttc-3’(SEQ ID NO.1)；

[0029] SlbHLH114下游引物：5’-atttacaaatcatagctagtaagaa-3’(SEQ ID NO.2)。

[0030] 以Takara高保真酶Primerstar Max通过PCR扩增SlbHLH114基因，然后连接T4载体，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆测序。

[0031] 结果显示，扩增获得番茄SlbHLH114的全长编码序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；蛋白质编码氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，且起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。

[0032] 实施例2、含SlbHLH114的植物表达载体的构建

[0033] 为研究SlbHLH114基因对番茄中甾体生物碱含量的影响，分别构建过表达载体pBin19-E8-SlbHLH114和35S-SlbHLH114-NPTII载体。正反向引物中均加入各自载体的非特异性臂，引物如表1所示。

[0034] 表1、pBin19-E8-SlbHLH114和35S-SlbHLH114-NPTII载体构建引物序列[0035]

[0036] 以测序正确的含SlbHLH114基因的T4载体为模板，分别以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，以及SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8为引物，采用Takara公司的Primerstar Max高保真酶进行PCR扩增。通过gateway和goldenbraid分别连入pBin19-E8-GW和P35S-SlbHLH114-T35S-PnoS-NPTII-TnoS-Ω1载体(Ying,Su et al.2019，Sarrion-Perdigones,Vazquez-Vilar et al.2013)，测序验证，获得表达载体pBin19-E8-SlbHLH114和35S-SlbHLH114-NPTII。

[0037] 本实施例将番茄SlbHLH114基因可操作性地连接于表达调控序列，该载体可用于通过转录调控策略来调控番茄甾体生物碱含量。

[0038] 实施例3、根癌农杆菌介导的SlbHLH114过表达载体遗传转化番茄获得转基因番茄植株

[0039] (1)含pBin19-E8-SlbHLH114和35S-SlbHLH114-NPTII表达载体的根癌农杆菌工程菌的获得

[0040] 将实施例2获得的pBin19-E8-SlbHLH114和35S-SlbHLH114-NPTII表达载体采用电转法转入根癌农杆菌(如EHA105)，进行PCR验证。结果表明，pBin19-E8-SlbHLH114和35S-SlbHLH114-NPTII表达载体已成功构建到根癌农杆菌菌株中。

[0041] (2)根癌农杆菌介导SlbHLH114基因转化番茄

[0042] a.番茄无菌子叶准备及预培养

[0043] 将种子用10ml，5％PPM(真菌抑制剂)，3×MS溶液消毒4小时；每瓶约30颗种子，平铺于1/2MS(Murashige and Skoog，1962)固体培养基，25℃、16h/8h(光照/黑暗)培养7-10天，即可获得番茄无菌子叶。于切苗液(MS+KH2PO4 200mg/L+2,4-D 0.2mg/L+KT 0.1mg/L)中剪去子叶两端，置于预培养基(1/2MS+IAA 1mg/L+ZR 2mg/L)培养，用于后续转化。

[0044] b.农杆菌与外植体的共培养

[0045] 将步骤a制得的外植体加入已活化的含有pBin19-E8-SlbHLH114和35S-SlbHLH114-N[TII表达载体的根癌农杆菌重悬液(MS+KH2PO4 200mg/L+AS 200μmol/L)，菌液与外植体充分接触18分钟，转到共培养培养基(MS+AS 200μmol/L)，卫生纸包裹，置于25℃培养箱中弱光培养2天。

[0046] c.外植体的重生培养和生根培养

[0047] 将步骤b中的外植体置于重生培养基(MS+IAA 1mg/L+ZR 2mg/L+Kan 100mg/L+Tim 320mg/L)，每两周更换一次培养基，直至长出芽；后剥离愈伤组织，转入生根培养基中(MS+Kan 50mg/L+Tim 320mg/L)，每4周更换一次培养基，直至长出根，形成完整植株。

[0048] d.移苗转基因植株

[0049] 将步骤c中获得的无菌稳定转基因植株在25℃培养箱中过夜练苗，后移入土盆中，直至长出茁壮的根茎叶等组织。

[0050] (3)阳性转基因植株的鉴定

[0051] 根据pBin19-E8-SlbHLH114和35S-SlbHLH114-PTII表达载体分别设计正反向检测引物对转基因植株进行检测，具体引物序列如表2：

[0052] 表2、SlbHLH114阳性转基因番茄植株鉴定引物序列

[0053]引物名称 引物序列(5‘-3’)
qRT-SlbHLH114-F aagagaaaacagcagaaaaccg(SEQ ID NO.9)
T35S CAMV-R tcaacacatgagcgaaaccct(SEQ ID NO.10)
P35S-F gagcatcgtggaaaaagaagacgttc(SEQ ID NO.11)
T35S-R gctcaacacatgagcgaaaccctata(SEQ ID NO.12)
qRT-SlbHLH114-R gttgattgatgtaggacacagc(SEQ ID NO.13)

[0054] 以SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10检测含有pBin19-E8-SlbHLH114表达载体的转基因植株，以SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.13以及SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.12共同检测含有35S-SlbHLH114-NPTII表达载体的转基因植株。

[0055] 检测结果表明，采用所设计的引物序列，阳性转基因植株均能扩增出特异DNA片段，而阴性和野生型番茄没有扩增出任何片段。

[0056] (4)定量检测转基因番茄植株SlbHLH114基因表达量

[0057] 收取含有pBin19-E8-SlbHLH114表达载体的转基因番茄各株系破色后三天的果实，收取含有35S-SlbHLH114-NPTII表达载体的转基因番茄叶片，速冻于液氮，使用快速研磨仪，按照实施例1的方法提取RNA，获得cDNA。将cDNA用RNA-free水稀释20倍，使用Bio-Rad公司的SYBR Supermix进行荧光定量PCR，以SlUBI为对照基因，检测转基因番茄果实表达量，其中目的基因引物序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.13所示，对照UBI引物序列如表3所示。

[0058] 表3、SlbHLH114转基因番茄毛状根基因表达量检测引物序列

[0059] 引物名称 引物序列(5‘-3’)qRT-SlUBI-F gccaaagaagatcaagcaca(SEQ ID NO.14)
qRT-SlUBI-R tcagcattagggcactcctt(SEQ ID NO.15)

[0060] 结果如图1所示。结果表明，连接有E8启动子的转基因番茄SlbHLH114果实表达量均高于野生型，连有35S启动子的转基因番茄SlbHLH114叶片表达量均高于野生型，表明SlbHLH114基因成功转入番茄，成功获得过表达SlbHLH114基因的番茄植株。

[0061] 本实施例将所述的植物表达载体转化根癌农杆菌，获得用于转化番茄的pBin19-E8-SlbHLH114和35S-SlbHLH114-NPTII表达载体的根癌农杆菌工程菌株，利用所构建的根癌农杆菌转化番茄，获得经PCR检测阳性的转基因番茄植株。转基因番茄植株的获得为筛选高含量甾体生物碱提供直接素材和理论基础。

[0062] 实施例4、LC-MS法测定转基因番茄中甾体生物碱含量

[0063] (1)LC-MS条件

[0064] UPLC：岛津公司的Shim-pack  UFLC  SHIMADZU CBM30A系统(https://www.shimadzu.com.cn/)。

[0065] 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱(粒径：1.8μm；长宽：100×2.1mm)。

[0066] 流动相：有机相为醇乙腈溶液、水相为含0.01％乙酸的超纯水；梯度洗脱条件：0min—水相/有机相(95：5V/V)，11.0min-5:95V/V，12.0min-5:95V/V，12.1min-95:5V/V，
15.0min—95:5V/V。柱温为40℃，样品进量为2μl，进样流速为进样流速为0.4ml/min。

[0067] MS：爱博才思公司的SCIEX Triple QuadTM 5500LC-MS/MS系统(http://www.appliedbiosystems.com.cn/)。

[0068] 电喷雾离子源(ESI,Electrospray ionization)：质谱电压为5500V，温度为500℃，气帘气(CUR,curtain gas)为40psi，碰撞诱导电离(CAD,collision-activated dissociation)参数设置为中等；在三重四极杆(QQQ)中，每个离子对是根据优化的去簇电压(DP,declustring potential)和(CE,collision energy)进行扫描检测。化合物按照已发表文献中的离子对进行定量。

[0069] (2)样品的制备及甾体生物碱含量的测定

[0070] 收取pBin19-E8-SlbHLH114转基因果实破色后10天的果皮样品和35S-SlbHLH114-NPTII转基因叶片，速冻于液氮，于冷冻干燥机中低温冻干至恒重，研磨成粉，称取0.1g干粉，溶于1ml提取液80％甲醇(含0.1％甲酸)中，涡旋30s，40W超声30min，然后涡旋30s，再3000g、4℃离心10分钟，转移上清至新管，继续20000g、4℃离心10分钟，上清过0.22μm滤膜，保存于棕色进样瓶中。

[0071] 采用LC-MS法测定甾体生物碱含量，样品进样体积为2μL，根据质谱峰面积表示野生型及转基因番茄果实及叶片含量，结果如图2和图3所示。

[0072] 结果显示，SlbHLH114过表达载体的番茄果实和叶片显著提高了甾体生物碱含量，最高为tomatine(番茄碱苷)在pBin19-E8-SlbHLH114-I株系中提高了2.7倍，Acetoxydehydrotomatine(乙酸脱氢番茄碱)在35S-SlbHLH114-NPTII-24株系中提高了1.7倍。此外，在pBin19-E8-SlbHLH114-I株系中，hydroxytomatidenol(羟基脱氢番茄碱)，hydroxytomatidine(羟基番茄碱)，δ-tomatine(δ-番茄碱苷)，β2-tomatine(β2-番茄碱苷)，tomatidine-o-rhamnoside(番茄碱-o-鼠李糖苷)和dihydroxy tomatidine-o-hexoside-o-rhamnoside(二羟番茄碱-o-己糖-鼠李糖苷)的含量也明显提高，cholesterol(胆固醇)提高幅度不明显。在35S-SlbHLH114-NPTII株系中，tomatidine(番茄碱)，hydroxytomatidine(羟基番茄碱)，hydroxytomatidenol(羟基脱氢番茄碱)，tomatidine derivative(番茄碱衍生物)，filotomatine，δ-tomatine(δ-番茄碱苷)，γ-tomatine(γ-番茄碱)，tomatidine-o-rhamnoside(番茄碱-o-鼠李糖苷)，tomatine(番茄碱苷)，tomatidine-o-hexosyl-o-pentoside(番茄碱-o-己糖-戊糖苷)，lycoperoside A，lycoperside H的含量也明显提高。

[0073] 本实施例中，采用LC-MS法测定了SlbHLH114过表达载体的转基因番茄果实和叶片中甾体生物碱含量，采用成功转化SlbHLH114过表达载体代谢工程策略发现SlbHLH114基因的表达量与甾体生物碱的含量具有明显的正相关关系，为利用该基因进行过表达研究进而提高番茄甾体生物碱含量提供有力的实验依据。

[0074] 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。