基于流感嗜血杆菌表面蛋白的乳胶微球免疫层析试纸的制备方法转让专利
申请号 : CN201811566005.5
文献号 : CN110540597B
文献日 : 2021-04-30
发明人 : 杨波 , 陶冶 , 胡征 , 王毅
申请人 : 湖北工业大学
摘要 :
权利要求 :
1.一种流感嗜血杆菌表面蛋白D15+PCP,其特征在于:所述流感嗜血杆菌表面蛋白D15+PCP的氨基酸序列是:
MQRVTDNDVANIVRSLFVSGRFDDVKAHQEGDVLVVSVVAKSIISDVKIKGNSIIPTEALKQNLDANGFKVGDVLIREKLNEFAKSVKEHYASVGRYNATVEPIVNTLPNNRAEILIQINEDDKAKLASLTFKGNESVSSSTLQEQMELQPDSWWKLWGNKFEGAQFEKDLQSIRDYYLNNGYAKGGSGGSGGSGGSRPVKIQADNQGVIGTLGGGALGGIAGSAIGGGRGQVIAAVVGAIGGAVAGSKIEEKVSQVNGAELVIKKDDGQEIVVVQKADSSFVAGRRVRIVGGGSNLNVSVL;
用于编码所述流感嗜血杆菌表面蛋白D15+PCP的核酸基因全序列是:CATATGCAGCGCGTAACCGACAACGACGTTGCAAACATCGTACGTTCTCTGTTTGTGTCCGGCCGTTTCGATGACGTTAAAGCTCACCAGGAAGGTGATGTTCTGGTTGTTTCTGTTGTTGCAAAATCCATCATCAGTGACGTTAAAATCAAGGGCAACTCTATCATCCCAACTGAAGCTCTGAAGCAGAACCTGGACGCTAACGGTTTTAAAGTAGGTGATGTTCTGATCCGTGAAAAGCTGAACGAATTCGCTAAATCCGTTAAGGAGCATTATGCGAGTGTTGGTCGTTACAACGCTACCGTAGAACCGATTGTTAACACTCTGCCGAACAACCGCGCGGAAATCCTGATCCAGATCAACGAAGATGATAAAGCAAAACTGGCTTCTCTGACCTTCAAAGGTAACGAATCTGTATCCTCATCCACTCTTCAGGAACAGATGGAACTGCAGCCGGACTCTTGGTGGAAGCTGTGGGGCAACAAATTCGAAGGCGCGCAGTTCGAAAAAGACCTGCAATCTATTCGTGATTATTACCTGAACAACGGTTATGCAAAAGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTCGCCCGGTTAAAATCCAGGCTGATAACCAGGGTGTAATCGGCACCCTGGGCGGCGGCGCTCTGGGCGGTATCGCAGGTTCTGCTATCGGCGGCGGTCGCGGCCAGGTTATTGCCGCTGTAGTAGGCGCTATCGGTGGTGCGGTGGCCGGTTCTAAAATCGAAGAAAAGGTTTCCCAGGTAAACGGTGCTGAGCTGGTAATCAAAAAAGACGATGGCCAGGAAATAGTTGTTGTACAGAAAGCCGACTCTTCCTTTGTAGCAGGTCGTCGCGTGCGCATCGTTGGTGGTGGGTCTAACCTGAACGTCTCTGTTCTGTAAGGATCC。
2.一种流感嗜血杆菌表面蛋白D15+PCP的制备方法,其特征在于:所述制备方法是:分别获取流感嗜血杆菌表面蛋白D15及表面蛋白PCP胞外结构域中抗原表位最为丰富的肽段并找到该肽段基因编码序列,优化肽段基因编码序列,并将优化后的肽段基因编码序列用柔性连接肽的编码序列进行连接,形成融合基因;
所述流感嗜血杆菌表面蛋白D15及表面蛋白PCP在NCBI蛋白质数据库中的accession number分别为AAX87955及AAX88288;
所述柔性连接肽的序列是ggsggsggsggs;
同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列,记为d15pcp;
所述d15pcp的基因全序列是:
CATATGCAGCGCGTAACCGACAACGACGTTGCAAACATCGTACGTTCTCTGTTTGTGTCCGGCCGTTTCGATGACGTTAAAGCTCACCAGGAAGGTGATGTTCTGGTTGTTTCTGTTGTTGCAAAATCCATCATCAGTGACGTTAAAATCAAGGGCAACTCTATCATCCCAACTGAAGCTCTGAAGCAGAACCTGGACGCTAACGGTTTTAAAGTAGGTGATGTTCTGATCCGTGAAAAGCTGAACGAATTCGCTAAATCCGTTAAGGAGCATTATGCGAGTGTTGGTCGTTACAACGCTACCGTAGAACCGATTGTTAACACTCTGCCGAACAACCGCGCGGAAATCCTGATCCAGATCAACGAAGATGATAAAGCAAAACTGGCTTCTCTGACCTTCAAAGGTAACGAATCTGTATCCTCATCCACTCTTCAGGAACAGATGGAACTGCAGCCGGACTCTTGGTGGAAGCTGTGGGGCAACAAATTCGAAGGCGCGCAGTTCGAAAAAGACCTGCAATCTATTCGTGATTATTACCTGAACAACGGTTATGCAAAAGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTGGTGGTTCTCGCCCGGTTAAAATCCAGGCTGATAACCAGGGTGTAATCGGCACCCTGGGCGGCGGCGCTCTGGGCGGTATCGCAGGTTCTGCTATCGGCGGCGGTCGCGGCCAGGTTATTGCCGCTGTAGTAGGCGCTATCGGTGGTGCGGTGGCCGGTTCTAAAATCGAAGAAAAGGTTTCCCAGGTAAACGGTGCTGAGCTGGTAATCAAAAAAGACGATGGCCAGGAAATAGTTGTTGTACAGAAAGCCGACTCTTCCTTTGTAGCAGGTCGTCGCGTGCGCATCGTTGGTGGTGGGTCTAACCTGAACGTCTCTGTTCTGTAAGGATCC;
所述d15pcp基因编码的蛋白质序列是:
MQRVTDNDVANIVRSLFVSGRFDDVKAHQEGDVLVVSVVAKSIISDVKIKGNSIIPTEALKQNLDANGFKVGDVLIREKLNEFAKSVKEHYASVGRYNATVEPIVNTLPNNRAEILIQINEDDKAKLASLTFKGNESVSSSTLQEQMELQPDSWWKLWGNKFEGAQFEKDLQSIRDYYLNNGYAKGGSGGSGGSGGSRPVKIQADNQGVIGTLGGGALGGIAGSAIGGGRGQVIAAVVGAIGGAVAGSKIEEKVSQVNGAELVIKKDDGQEIVVVQKADSSFVAGRRVRIVGGGSNLNVSVL;
所述d15pcp基因编码的蛋白质序列为流感嗜血杆菌表面蛋白D15的50‑233aa及表面蛋白PCP的50‑154aa这两段蛋白序列中间以柔性连接肽进行连接;将此基因片段按常规方法
2+
克隆入原核表达载体pET‑28a(+),用IPTG诱导重组大肠杆菌表达,用Ni 亲和层析法纯化重组D15PCP蛋白。
3.一种用于制备流感嗜血杆菌表面蛋白D15+PCP抗体的方法,其特征在于:所述方法是将如权利要求2中所述的重组D15PCP蛋白作为免疫抗原,与弗氏佐剂混合后反复人工免疫健康的新西兰大白兔,抽血进行效价测定,分离高效价重组蛋白抗体并进行纯化,最终获得流感嗜血杆菌表面蛋白D15+PCP抗体。
4.一种基于流感嗜血杆菌表面蛋白的乳胶微球免疫层析试纸,其特征在于:所述基于流感嗜血杆菌表面蛋白的乳胶微球免疫层析试纸包括包被有权利要求3所述方法制备得到的流感嗜血杆菌表面蛋白D15+PCP抗体的乳胶微球标记物以及包被有流感嗜血杆菌表面蛋白Pe+pilA抗体的硝酸纤维素膜;所述流感嗜血杆菌表面蛋白Pe+pilA抗体是将重组Pepil蛋白作为免疫抗原,与弗氏佐剂混合后反复人工免疫健康的新西兰大白兔,抽血进行效价测定,分离高效价重组蛋白抗体并进行纯化,最终获得流感嗜血杆菌表面蛋白Pe+pilA抗体;
所述重组Pepil蛋白的氨基酸序列是:
MLVKNVNYYIDSESIWVDNQEPQIVHFDAVVNLDKGLYVYPEPKRYARSVRQYKILNCANYHLTQVRTDFYDEFWGQGLRAAPKKQKKHEAAAAKEAAAAKLIELMIVIAIIAILATIAIPSYQNYTKKAAVSELLQASAPYKADVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWTTTCKG。
5.一种用于制备如权利要求4所述的基于流感嗜血杆菌表面蛋白的乳胶微球免疫层析试纸的方法,其特征在于:所述方法包括以下步骤:
1)制备流感嗜血杆菌表面蛋白D15+PCP抗体以及流感嗜血杆菌表面蛋白Pe+pilA抗体;
2)制备流感嗜血杆菌表面蛋白D15+PCP抗体的乳胶微球标记物:
2.1)乳胶微球的活化
取浓度为10%的彩色羧基化聚苯乙烯乳胶微球溶液1mL,加入9mL MES缓冲液后混匀,加入NHS以及EDC,至二者的终浓度均为1mg/mL,在室温下缓慢混匀30分钟,孵育结束后
19000g离心20分钟,去上清,沉淀用10mL硼砂缓冲液重悬,振荡,超声处理后即成活化后的乳胶微球;所述MES缓冲液的组分及含量是:0.1mol/L MES,所述MES缓冲液的pH=8.5;所述彩色羧基化聚苯乙烯乳胶微球的粒径是100nm;所述硼砂缓冲液的组分及含量为0.1mol/L Na2B4O7,所述硼砂缓冲液的pH=8.5;
2.2)乳胶微球标记物的制备
用硼砂缓冲液将步骤1)所得的流感嗜血杆菌表面蛋白D15+PCP抗体稀释成1mg/mL;取
10mL流感嗜血杆菌表面蛋白D15+PCP抗体加入10mL活化乳胶微球,缓慢混匀30分钟后
19000g离心10分钟,去上清;沉淀用10mL含有1%酪蛋白的硼砂缓冲液重悬,经超声粉碎后重复离心1次,去上清;沉淀同法重悬,经超声粉碎、振荡后重复离心1次,去上清;沉淀用
10mL含有1%酪蛋白的硼砂缓冲液重悬,即为流感嗜血杆菌表面蛋白D15+PCP抗体的乳胶微球标记物;所述硼砂缓冲液的组分及含量为0.1mol/L Na2B4O7,所述硼砂缓冲液的pH=8.5;
3)结合垫的制备:
向聚酯纤维材质的结合垫上喷涂步骤2)所得到的流感嗜血杆菌表面蛋白D15+PCP抗体的乳胶微球标记物,每平方厘米聚酯纤维膜的喷涂量为10μL乳胶微球标记物;喷涂完后在相对湿度不超过30%的环境中在37℃下烘干,25℃密封干燥保存;
4)抗体固相硝酸纤维素膜的制备:
用硼砂缓冲液将步骤1)所得的流感嗜血杆菌表面蛋白Pe+pilA抗体稀释成1.5mg/mL后用喷膜仪包被到硝酸纤维素膜上的检测线位置作为检测线捕获抗体,包被参数为1μL/cm;
将羊抗兔IgG喷涂到硝酸纤维素膜上的质控线位置作为控制线捕获抗体,浓度为1mg/mL,包被参数为1μL/cm;包被完后将该硝酸纤维素膜放在相对湿度不超过30%的环境中,于37℃下烘干,25℃密封干燥保存;所述硼砂缓冲液的组分及含量为0.1mol/L Na2B4O7,所述硼砂缓冲液的pH=8.5;
5)样品垫的制备
取玻璃纤维素膜一张,将其在样品垫处理液中浸泡至少3h以上,再置于生物安全柜内
37℃通风干燥后,剪裁成所需的规格,25℃密封干燥保存;至此制得样品垫;
所述样品垫处理液的各组分及含量分别是:0.01mol/L Na2B4O7、2g/L氯化钠、20g/L酪蛋白、10ml/L吐温‑20以及10ml/L消泡剂S‑17;所述样品垫处理液的pH=8.5;
6)试纸条的组装
分别将吸水滤纸材质的吸水垫、抗体固相硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫、依次粘贴在PVC底板上,硝酸纤维素膜上所述质控线靠近吸水垫端,所述检测线靠近样品垫端,再切割成一定宽度的试纸条,密封包装,干燥低温保存;至此制得流感嗜血杆菌乳胶微球免疫层析检测试纸条。
说明书 :
基于流感嗜血杆菌表面蛋白的乳胶微球免疫层析试纸的制备
方法
技术领域
背景技术
长为兼性厌氧生物。流感嗜血杆菌最初被误认为是流行性感冒的病因,但直至1933年,当发
现流行性感冒的病毒性病原后,才消除了这种误解。流感嗜血杆菌一般有六种菌株,称为a
型、b型(又称乙型)、c型、d型、e型及f型。由流感嗜血杆菌自然产生的疾病只会在人类出现。
在婴儿及孩童中,乙型流感嗜血杆菌会引致菌血病症及急性细菌性脑膜炎。偶尔地它会引
致蜂窝组织炎、骨髓炎及关节感染。自从1990年开始,美国使用HiB结合型疫苗后,HiB病症
的患病率减少至每十万名儿童有1.3名儿童感染。但是,HiB仍然是发展中国家引致婴儿及
儿童下呼吸道疾病的主因。没有荚膜的流感嗜血杆菌会引致儿童的耳朵感染(如中耳炎)、
眼睛感染(结膜炎)及鼻窦炎,并且联带肺炎。此种细菌对培养的营养需要较为严格且往往
寄生在上气道内,因此培养常出现假阴性和假阳性。
快速、灵敏、特异性好的技术,但是目前该技术还是依赖于传统方法的前增菌步骤,而增菌
液中往往还有PCR抑制剂,从而影响扩增的效果。同时,该技术还需要专业的检测设备,不适
合进行床旁检测。以抗体为基础的免疫学检测已成为人体病原微生物检测不可或缺的重要
技术手段。目前已发展了多种特异性免疫检测技术,如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析
(EIA)、荧光免疫分析(FIA)、化学发光免疫分析(CIA)、免疫沉淀反应、免疫凝集反应、ELISA
检测试剂盒、免疫胶体金试纸条、免疫乳胶检测试剂等。其中免疫乳胶试纸条等多种以抗体
为基础的免疫学检测技术,以其简便、快速、灵敏、准确、实用的特点已成为病原微生物检测
不可或缺的重要手段。因而,研究开发具有自主知识产权的病原微生物的抗体,是开发拥有
自主知识产权的ELISA检测方法、乳胶微球标记检测法等的基础。
理想的检测标的物。本研究选用具有种间特异性的表面蛋白Pe、D15、PCP及PilA等作为抗
原,在去除与其它细菌相似性高的基因序列,使其与其它细菌抗原的交叉性降低的同时通
过基因优化,融合表达等技术手段制备特异性良好的多克隆抗体,并将其应用于制备流感
嗜血杆菌乳胶微球免疫层析检测试纸条。
发明内容
编码序列用柔性连接肽的编码序列进行连接,形成融合基因;所述流感嗜血杆菌表面蛋白
D15及表面蛋白PCP在NCBI蛋白质数据库中的accession number分别为AAX87955及
AAX88288;所述柔性连接肽的序列是ggsggsggsggs;同时在该融合基因的5’引入酶切位点
NdeI、3’端引入终止信号TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列,记为d15pcp;
EQMELQPDSWWKLWGNKFEGAQFEKDLQSIRDYYLNNGYAKGGSGGSGGSGGSRPVKIQADNQGVIGTLGGGALGG
IAGSAIGGGRGQVIAAVVGAIGGAVAGSKIEEKVSQVNGAELVIKKDDGQEIVVVQKADSSFVAGRRVRIVGGGSN
LNVSVL;
2+
法克隆入原核表达载体pET‑28a(+),用IPTG诱导重组大肠杆菌表达,用Ni 亲和层析法纯化
重组His‑D15PCP蛋白;将该重组蛋白作为免疫抗原,与弗氏佐剂混合后反复人工免疫健康
的新西兰大白兔,抽血进行效价测定,分离高效价重组蛋白抗体并进行纯化,最终获得流感
嗜血杆菌表面蛋白(D15+PCP)抗体;
性连接肽的编码序列进行连接,形成融合基因;所述流感嗜血杆菌表面蛋白Pe及表面蛋白
pilA在NCBI蛋白质数据库中的accession number分别为AGT37361及AAX12377;所述刚性连
接肽的序列是eaaakeaaak;同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号
TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列,记为pepil;
DVELCVYSTNETTNCTGGKNGIAADITTAKGYVKSVTTSNGAITVKGDGTLANMEYILQATGNAATGVTWTTTCKG;
法克隆入原核表达载体pET‑28a(+),用IPTG诱导重组大肠杆菌表达,用Ni2+亲和层析法纯
化重组His‑Pepil蛋白;将该重组蛋白作为免疫抗原,与弗氏佐剂混合后反复人工免疫健康
的新西兰大白兔,抽血进行效价测定,分离高效价重组蛋白抗体并进行纯化,最终获得流感
嗜血杆菌表面蛋白(Pe+pilA)抗体;
乙基碳二亚胺盐酸盐),至二者的终浓度均为1mg/mL,在室温下缓慢混匀30分钟,孵育结束
后19000g离心20分钟,去上清,沉淀用10mL硼砂缓冲液重悬,振荡,超声处理后即成活化后
的乳胶微球;所述MES缓冲液中组分及含量是:0.1mol/L MES,所述MES缓冲液的pH=8.5;所
述彩色羧基化聚苯乙烯乳胶微球的粒径是100nm;所述硼砂缓冲液中组分含量为0.1mol/L
Na2B4O7,所述硼砂缓冲液的pH=8.5;
后19000g离心10分钟,去上清;沉淀用10mL含有1%酪蛋白的硼砂缓冲液重悬,经超声粉碎
后重复离心1次,去上清;沉淀同法重悬,经超声粉碎、振荡后重复离心1次,去上清;沉淀用
10mL含有1%酪蛋白的硼砂缓冲液重悬,即为流感嗜血杆菌表面蛋白(D15+PCP)抗体的乳胶
微球标记物;所述硼砂缓冲液中组分含量为0.1mol/L Na2B4O7,所述硼砂缓冲液的pH=8.5;
涂完后在相对湿度不超过30%的环境中在37℃下烘干,25℃密封干燥保存;
为1μL/cm;将羊抗兔IgG喷涂到硝酸纤维素膜上的质控线位置作为控制线捕获抗体,浓度为
1mg/mL,包被参数为1μL/cm;包被完后将该硝酸纤维素膜放在相对湿度不超过30%的环境
中,于37℃下烘干,25℃密封干燥保存;所述硼砂缓冲液中组分含量为0.1mol/L Na2B4O7,所
述硼砂缓冲液的pH=8.5;
切割成一定宽度的试纸条,密封包装,干燥低温保存;至此制得流感嗜血杆菌乳胶微球免疫
层析检测试纸条。
种融合蛋白表达量高,制备成本低廉,蛋白可溶性好,抗原性强,用其制备抗体效价高,成本
低。
4
标准菌株ATCC49247的检测灵敏度达到2×10CFU/mL,明显高于微生物传统检测方法,并且
具有快速、高效等优点。
的特异性和稳定性,其可检出所有所试的流感嗜血杆菌,而与所有非流感嗜血杆菌标准菌
株均无交叉反应,十分适合临床非诊断性应用。
可以在10min内完成,更适合于床旁检测。
附图说明
具体实施方式
形式为10%固体水悬液,产品货号MSI‑CAR100NM。
编码序列,优化其基因编码序列,并将此二序列用柔性连接肽(ggsggsggsggs)的编码序列
进行连接,形成融合基因。同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号
TAA和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列,记为d15pcp。其基因全序列及编码的氨基酸
序列如序列表所示。具体的说,d15pcp基因编码的蛋白质序列为流感嗜血杆菌表面蛋白D15
的50‑233aa及表面蛋白PCP的50‑154aa,两个蛋白序列中间以柔性连接肽(ggsggsggsggs)
进行连接。将此基因序列交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因化学合成,交货时
该人工合成的基因片段连于载体pUC57上。将含有该段人工合成的DNA片段的载体pUC57用
NdeI及BamHI进行双酶切后按常规方法回收目的片段,备用。同时采用NdeI及BamHI对载体
pET‑28a(+)进行双酶切,并按常规分子生物学方法将经双酶切后获得的d15pcp基因连入
pET‑28a(+)载体中,并转化大肠杆菌TOP10,构建pET‑d15pcp表达载体。经酶切和序列测定
证实表达载体构建无误。该载体表达重组D15PCP融合蛋白。
表达菌株。挑取pET‑d15pcp转化的具有外源蛋白表达能力的单个菌落并接种入100mL LB培
养基中,于37℃培养过夜。取出菌液后,按1:100接种于100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培
养基中,于30℃培养至OD600=0.6时,加入1mol/L IPTG至终浓度为0.5mmol/L,于37℃摇菌
培养,诱导融合蛋白表达。诱导4h后于8000r/min下离心10min收集菌体。将此菌体用50mL
Buffer A(50mM Na3PO4,0.5M NaCl;pH7.4)洗涤3次并用50mL上样缓冲液(50mM Na3PO4,
0.5M NaCl;5mM咪唑,pH7.4)重悬后进行超声破碎,操作条件为:功率50W,工作时间2s,间隔
时间3s,报警温度60℃,总时间30min。超声完成后,12000g离心15min分别收集沉淀和上清
后进行电泳检测。发现重组D15PCP融合蛋白以溶解形式存在于菌体中。薄层扫描显示,该重
组蛋白占细菌总蛋白的25%以上。而将未经基因优化的野生型d15pcp按上述同样方式进行
表达,结果发现表达产物仅占总蛋白的5%,说明基因优化效果突出。将上述获得的超声破
碎上清液用0.45μm的滤膜进行过滤后用His Trap affinity columns(GE healthcare公司
产品),按照说明书的方法进行重组D15PCP蛋白的纯化。具体方法如下:
测器(上海沪西分析仪器厂,型号HD1),柱体积为2ml,预热紫外检测仪30min左右至读数稳
定;
菌D15PCP融合蛋白。
后每隔两周用FhuOmp融合蛋白与福氏不完全佐剂形成的乳化液免疫一次,共免疫5次,抗原
用量与初次免疫相同。五免后3‑5天进行心脏大量取血,置37℃1小时,然后放冰箱4℃过夜,
隔天取血清。
3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200、1:102400、1:204800;
编码序列,优化其基因编码序列,并将此二序列用刚性连接肽(eaaakeaaak)的编码序列进
行连接,形成融合基因。同时在该融合基因的5’引入酶切位点NdeI、3’端引入终止信号TAA
和酶切位点BamHI后化学合成全基因序列,记为Pepil。其基因全序列及编码的氨基酸序列
如序列表所示。具体的说,Pepil基因编码的蛋白质序列为流感嗜血杆菌表面蛋白Pe的43‑
130aa及表面蛋白pilA的17‑133aa,两个蛋白序列中间以刚性连接肽(eaaakeaaak)进行连
接。将此基因序列交由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因化学合成,交货时该人工
合成的基因片段连于载体pUC57上。将含有该段人工合成的DNA片段的载体pUC57用NdeI及
BamHI进行双酶切后按常规方法回收目的片段,备用。同时采用NdeI及BamHI对载体pET‑28a
(+)进行双酶切,并按常规分子生物学方法将经双酶切后获得的Pepil基因连入pET‑28a(+)
载体中,并转化大肠杆菌TOP10,构建pET‑Pepil表达载体。经酶切和序列测定证实表达载体
构建无误。该载体表达重组Pepil融合蛋白。
表达菌株。挑取pET‑Pepil转化的具有外源蛋白表达能力的单个菌落并接种入100mL LB培
养基中,于37℃培养过夜。取出菌液后,按1:100接种于100mL含有50μg/mL卡那霉素的LB培
养基中,于37℃培养至OD600=0.6时,加入1mol/L IPTG至终浓度为0.5mmol/L,于37℃摇菌
培养,诱导融合蛋白表达。诱导4h后于8000r/min下离心10min收集菌体。将此菌体用50mL
Buffer A(50mM Na3PO4,0.5M NaCl;pH7.4)洗涤3次并用50mL上样缓冲液(50mM Na3PO4,
0.5M NaCl;5mM咪唑,pH7.4)重悬后进行超声破碎,操作条件为:功率50W,工作时间2s,间隔
时间3s,报警温度60℃,总时间30min。超声完成后,12000g离心15min分别收集沉淀和上清
后进行电泳检测。发现重组Pepil融合蛋白以溶解形式存在于菌体中。薄层扫描显示,该重
组蛋白占细菌总蛋白的20%以上。而将未经基因优化的野生型Pepil按上述同样方式进行
表达,结果发现表达产物仅占总蛋白的3%,说明基因优化效果突出。将上述获得的超声破
碎上清液用0.45μm的滤膜进行过滤后用His Trap affinity columns(GE healthcare公司
产品),按照说明书的方法进行重组Pepil蛋白的纯化。具体方法如下:
(上海沪西分析仪器厂,型号HD1),柱体积为2ml,预热紫外检测仪30min左右至读数稳定;
融合蛋白。
每隔两周用Pepil融合蛋白与福氏不完全佐剂形成的乳化液免疫一次,共免疫5次,抗原用
量与初次免疫相同。五免后3‑5天进行心脏大量取血,置37℃1小时,然后放冰箱4℃过夜,隔
天取血清。
3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200、1:102400、1:204800;
羟基琥珀酰亚胺(NHS)及10mg/mL的1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶
液;
(0.1mol/L Na2B4O7,pH8.5)重悬,振荡,超声处理(超声破碎仪产品型号:YJ92‑IIDN,功率
50W,工作时间2s,间隔时间3s,报警温度60℃,总时间30min)后即成活化后的乳胶微球。
乳胶微球,缓慢混匀30分钟后19000g离心10分钟,去上清。沉淀用10mL含有1%酪蛋白的硼
砂缓冲液重悬,经超声粉碎(超声破碎仪产品型号:YJ92‑IIDN,功率50W,工作时间2s,间隔
时间3s,报警温度60℃,总时间30min)后19000g重复离心1次(10分钟),去上清。沉淀同法重
悬,经超声粉碎后再19000g重复离心1次(10分钟),去上清。沉淀用10mL含有1%酪蛋白的硼
砂缓冲液重悬,即为流感嗜血杆菌表面蛋白(D15+PCP)抗体的乳胶微球标记物。
封干燥保存。
1.5mg/mL及1mg/mL;将稀释好的流感嗜血杆菌表面蛋白(Pe+pilA)抗体装入BIODOT划膜仪
喷头1中,设置1.0μl/cm的量喷于硝酸纤维素膜上,形成检测线,其与硝酸纤维素膜的边距
为0.8cm;将稀释好的羊抗兔IgG装入BIODOT划膜仪喷头2中,设置1.0μl/cm的量喷于硝酸纤
维素膜上作为质控线,其与检测线间距为0.7cm。包被完后将该硝酸纤维素膜放在相对湿度
为20%的环境中,于37℃下烘干12h,25℃密封干燥保存。
白,10ml/L吐温‑20,10ml/L消泡剂S‑17,pH 8.5)。取玻璃纤维素膜一张,将其在样品垫处理
液中浸泡3h,再置于生物安全柜内37℃通风干燥12h后,剪裁成规格为4cm×3cm/条,25℃密
封干燥保存,即制得样品垫。至此制得样品垫。经试验证实该样品垫的使用,大大提高了结
合垫上乳胶微球标记抗体的释放率,达到了较好的应用效果。
者重叠约2mm。NC膜3上划有检测线T和质控线C。用斩切机将粘贴好的试纸板切成宽为4mm试
纸条,将做好的试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内密封保存。
分溶解。
10min,阳性结果出现两条红色线,即检测线T线和质控线C线;若检测样品中不含流感嗜血
杆菌,阴性结果只在质控线C线出现一条红色线,显示该样品中没有流感嗜血杆菌。
按照实施例9及实施例10所述的试纸条的组成和使用方法对浓度均为2×10 CFU/mL的6株
流感嗜血杆菌菌株及17株非流感嗜血杆菌标准菌株进行了检测,见表1。结果表明,本发明
试纸条对所有6株流感嗜血杆菌菌株的检测结果均为阳性,而对其他17株呼吸道常见病原
微生物的检测结果均为阴性。该试纸条显示出良好的特异性。
人流感嗜血杆菌ATCC 33391 阳性
人流感嗜血杆菌ATCC 10211 阳性
人流感嗜血杆菌ATCC 49766 阳性
人流感嗜血杆菌ATCC 35056 阳性
人流感嗜血杆菌ATCC 31441 阳性
人肺炎支原体ATCC 15531 阴性
铜绿假单胞菌ATCC 27853 阴性
鲍曼不动杆菌ATCC 19606 阴性
卡他莫拉菌ATCC 46327 阴性
副流感嗜血杆菌ATCC 7901 阴性
嗜肺军团菌ATCC 33152 阴性
化脓性链球菌ATCC 19615 阴性
金黄色葡萄球菌ATCC 25923 阴性
人肺炎链球菌ATCC 49619 阴性
肺炎克雷伯菌ATCC 700603 阴性
阴沟肠杆菌ATCC 13047 阴性
大肠埃希菌ATCC 25922 阴性
假丝酵母菌ATCC 10231 阴性
甲型流感病毒ATCC VR‑1743 阴性
乙型流感病毒ATCC VR‑790 阴性
呼吸道合胞病毒ATCC VR26 阴性
腺病毒ATCC VR‑3 阴性
性。
生理盐水10倍梯度稀释,同时平板计数,得到菌体浓度为10‑10CFU/mL的菌体溶液,然后将
100μL菌体溶液滴加于样品垫上,按照实施例7及实施例8所述的试纸条组成和使用方法将
4
进行检测。结果表明本发明试剂盒的检测敏感性为2×10CFU/mL。
弱。表明该试纸条至少可在4℃或25℃保存2年。
以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离所附权利要求书所限定的本发明
的精神和范围。