增强靶基因沉默效率的siRNA分子及其应用

摘要

本发明公开了一种增强靶基因沉默效率的siRNA分子，其正义链除3’末端碱基外，所有核苷酸中的戊糖结构上的2’‑OH位均被2’‑氟或2’‑甲氧基取代；其反义链5’端碱基进行磷酸化修饰，起始后奇数位碱基用2’‑甲氧基修饰，偶数位碱基用2’‑氟修饰，且反义链3’端数起与靶基因互补的前3个碱基都用2’‑甲氧基修饰；该siRNA分子反义链3’可用磷酸酯键或硫代磷酸酯键连接1‑10个脱氧胸腺嘧啶，且确保含有2个硫代磷酸酯键修饰核苷酸骨架。本发明可用于沉默细胞因子VEGFR2、PIK3CB或EGFR的基因表达，组织靶向性分子修饰siRNA分子以提高转染效率，抑制内体质膜循环相关细胞因子功能，增加其基因沉默效率；同时这些siRNA分子单独或联合使用可用于治疗因基因突变或过表达引起的疾病。

权利要求

1.增强靶基因沉默效率的siRNA分子组，其特征在于：所述的siRNA分子组为以下几种中的一种：

siAAK1L组2：（siAAK1L+biRGD-siPD-L1-16/23-M）；

siNPC1组2：（siNPC1+biRGD-siPD-L1-16/23-M）；

siRAB5组2：（siRAB5+biRGD-siPD-L1-16/23-M）；

siRAB7组2：（siRAB7+biRGD-siPD-L1-16/23-M）；

siEHD3组2：（siEHD3+biRGD-siPD-L1-16/23-M）。

2.如权利要求1所述的增强靶基因沉默效率的siRNA分子组，其特征在于：经过细胞分别转染siAAK1L、siEHD3、siRAB5、siRAB7或siNPC1后，进一步增加对biRGD-PD-L1-16/23-M的沉默效率。

说明书

增强靶基因沉默效率的siRNA分子及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及小干扰RNA分子的核苷酸序列及其增强基因沉默的技术。

背景技术

[0002] 小干扰RNA分子（Small interfering RNA, siRNA)是RNA干扰理论（2006年诺贝尔生理医学奖）的效应分子，能在细胞质或细胞核内特异性沉默引起疾病的过表达及突变基因，具有治疗疾病的应用前景(Sullenger B A,et al. Science. 2016; 352(6292):1417-1420.)。siRNA分子是由两条单链RNA分子因序列全部互补或部分互补后形成的完全对称的双链结构或不对称双链结构，其中的一条链可与细胞内的靶RNA核苷酸序列部分或完全互补，称为指导链（guide strand）或反义链(antisense strand)。另一条链称为伴随链（passenger strand）或正义链(sense strand)；带负电荷，具有生物大分子结构特性。体内系统途径应用siRNA分子治疗疾病时存在稳定性差（易被核酸酶降解）、组织靶向性差、脱靶效应、易被肝肾清除、免疫原性、难以穿过细胞膜被靶细胞摄取、及难以从细胞内体（endosome)中逃逸等问题。即使局部给药例如眼内、皮肤、脑内、关节腔内、或其它组织局部给予siRNA时，依然存在难以穿过细胞膜被靶细胞摄取、及难以从细胞内体中逃逸等问题。
这些问题直接制约着siRNA分子的临床转化(Lee SJ,et al. Advanced Drug Delivery Reviews.2016; 104:2-15.)。

[0003] 要获得细胞内高效的沉默活性，首先要获得高沉默效率的siRNA分子的基本序列结构，然后参考对寡核酸化学修饰的理论方法，对siRNA分子结构中的核苷酸及骨架进行选择性修饰，可大大提高其在血液中的稳定性、降低免疫原性、减少脱靶效应、延缓肝肾清除。同时因siRNA分子量大且带负电荷，难以被靶细胞高效摄取，但经修饰的siRNA分子易于穿过细胞膜及从内体中逃逸进入胞浆内增强基因沉默活性（Khvorova A, et al.Nat Biotechnol. 2017 ;35(3):238-248.)。

[0004] 给药系统可帮助siRNA实现组织细胞靶向性，如RGD寡肽可靶向肿瘤组织，而胆固醇分子则可靶向多种组织细胞(Wittrup A, et al. Nature Reviews Genetics.2015;16(9):543-552.及Ku SH,et al.Advanced Drug Delivery Reviews. 2016; 104: 16-28.）。具有临床转化价值的siRNA分子高效递释系统，应该具有能够容易制备、成本低、制剂稳定性好、毒副作用低、临床顺应性强、高效递释siRNA分子进入靶细胞内、易于从细胞内体中释放、及确保不妨碍siRNA分子的基因沉默活性等特点(Lee SH,et al.Advanced Drug Delivery Reviews. 2016; 104:78-92.)。目前，常见临床前研究的siRNA分子递释系统包括病毒类和非病毒类系统。病毒类递释系统因其免疫原性及致瘤性而不适合临床应用；非病毒类递释系统如阳离子聚合物纳米粒、及纳米脂质体制剂存在制备工艺复杂、制备成本高、制剂不稳定、及体内应用毒性大等缺陷，直接制约了siRNA分子纳米粒给药系统的临床转化(Lee SH,et al.Advanced Drug Delivery Reviews. 2016;104:78- 92.)。不仅如此，siRNA分子递释系统普遍面临的关键及瓶颈问题是，即使siRNA分子借助给药系统被细胞摄取，但它容易被囊化进入内体和溶酶体中，仅有小部分（<0.01%）成功释放至细胞浆中发挥基因沉默作用，因而造成siRNA分子递释系统的效价低下，直接导致有限的基因沉默活性。
因此如能增加siRNA 分子从内体中逃逸可增加基因沉默活性(Gilleron J, et al. Nature Biotechnology. 2013；31(7):638-646. 及Dowdy SF. Nat Biotechnol. 2017; 
35 (3):222-229.)。

发明内容

[0005] 发明目的：

[0006] 提供一类采用特殊修饰技术，适合增强多种组织细胞的基因沉默效率的siRNA分子及其应用。

[0007] 技术方案：

[0008] 本发明提供的增强靶基因沉默效率的siRNA分子，所有siRNA分子由正义链和与其反向互补的反义链组成的双链核苷酸序列。全部互补或部分互补后形成的完全对称或不对称的双链结构。核苷酸由磷酸、碱基、戊糖组成，碱基包括A、G、C、U、dA、dC、dG、dT。其中A为腺嘌呤核糖核苷酸；G为鸟嘌呤核糖核苷酸；C为胞嘧啶核糖核苷酸；U为尿嘧啶核糖核苷酸；dA为腺嘌呤脱氧核苷酸；dC为胞嘧啶脱氧核苷酸；dG为鸟嘌呤脱氧核苷酸；dT为胸腺嘧啶脱氧核苷酸。

[0009] 正义链及反义链间具有15、或16、或17、或18、或19个核苷酸序列互补（互补或者部分互补）；反义链的长度可为18-29个核苷酸，其与细胞内靶RNA（单链结构，或称靶RNA）能够形成具有18-27个互补碱基对的互补序列，链太短结构不稳定，链太长移动进入细胞的活性减低。

[0010] 双链中，除正义链3’末端碱基外，所有核苷酸中戊糖结构上2’-OH位均被2’-氟（2'-Fluoro，2’-F；以n或f表示）或2’-甲氧基（2' O-methyl，2’-OMe）取代。

[0011] 本发明的反义链的3’端的核苷酸数起可通过磷酸二酯键(phosphodiester bond;以w表示)或硫代磷酸酯（phosphorothioate；以s表示）键连接0-10个胸腺嘧啶脱氧核苷酸（Thymidine deoxidation，dT），所用dT可用2’-甲氧基或2’-氟修饰，或不修饰。

[0012] 优选地，正义链3’端起始的第1位核苷酸不修饰，随后第2位核苷酸开始偶数位核苷酸用2’-甲氧基与奇数位核苷酸用2’-氟修饰。

[0013] 优选地，反义链5’端起始后奇数位核苷酸用2’-甲氧基修饰，偶数位核苷酸用2’-氟修饰。但从反义链3’端数起与靶基因互补的前3个碱基都用2’-甲氧基修饰，或反义链3’端部分不与正义链互补的单链中的每个核苷酸可随机用2’-甲氧基或2’-氟修饰。

[0014] 优选地，反义链5’端进行磷酸化修饰，反义链3’端起始后至少含有2个硫代磷酸酯键修饰核苷酸骨架。

[0015] 上述修饰可获得如附表2、3所示的siRNA序列品种。

[0016] 本发明所述的沉默靶基因表达的siRNA序列，优选靶基因分别为血管内皮细胞生长因子受体2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2，VEGFR2），磷酸肌醇3激酶催化β亚基（Phosphoinositide 3-Kinase Catalytic Beta Polypeptide  , PIK3CB）,及表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）等基因，沉默效率较高，如附图1、附图2、附图6所示。得到的siRNA为基本母核序列，与提供的siRNA序列的同源性大于75%以上的其它核酸类结构同样具有抑制母核靶基因表达的作用。这样的修饰可获得如附表1所示的siRNA序列品种。

[0017] 本发明提供组织靶向性结构分子用于增强siRNA分子结构的基因沉默效率，还具有如下特征：1) biRGD-siRNA可靶向整合素αvβ3受体高水平表达的肿瘤新生血管内皮细胞及部分肿瘤细胞，可将所携带的所述siRNA通过受体介导的方式内吞进入细胞内，发挥siRNA分子的基因沉默功能。2）Chol-siRNA可增强所述siRNA分子进入多种细胞内，增强siRNA分子的基因沉默活性，同时提供一种胆固醇分子与siRNA分子的偶联结构。

[0018] 本发明提供抑制细胞内体成熟及循环的方法，利用RNAi技术特异性沉默EHD3（Eps 15同源结构域家族成员）、AAK1L（接头蛋白相关激酶1长结构）、GTP酶Rab7及Rab7、及NPC1- (Niemann-Pick C1 protein)等基因的表达，可使αvβ3受体内体在细胞内停留更长时间，使得所述siRNA分子有更多的机会从内体中逃逸出来进入胞浆中，参与RNAi过程，增强siRNA分子的基因沉默效率。

[0019] 一般来说，可通过文献公知的方法设计获得siRNA分子的基本结构。siRNA设计遵循的基本原则（Nature. 2001;411:494-498.及Nat Biotechnol. 2004; 22(3): 326-30.）：1）从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，其后连续的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点；2）GC含量在45%-55%左右的siRNA序列基因沉默效率更有效；
3）在设计siRNA时不要针对5’和3’端的非编码区（untranslated region s, UTRs）；4）使用BLAST，与转录组序列进行比较避免同源，防止脱靶效应（off-target）；5）通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以便找到最有效的siRNA序列。

[0020] 在本发明的实施例中，根据以上原则设计了siRNA针对的靶序列为血管内皮细胞生长因子受体2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2，VEGFR2），磷酸肌醇3激酶催化β亚基（Phosphoinositide 3-Kinase Catalytic Beta Polypeptide  , PIK3CB），及表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）等基因，具体获得的具有基因沉默效率的序列见表1，这些siRNA分子序列用脂质体转染细胞后，在100nM浓度时沉默靶基因的效率均大于60%。这些siRNA中的正义链及反义链的长度为21个核苷酸，其中反义链自5’端起始后的连续19个核苷酸与细胞内靶RNA序列互补，正义链自5’端起始后的连续19个核苷酸与相应的反义链序列互补，正义链及反义链的3’端通过磷酸二酯键连接了2个悬突的脱氧胸腺嘧啶（dT）分子。与这些siRNA分子中反义链序列的同源性大于50%以上的核酸类似物同样具有抑制相应靶基因表达的作用，可优选与反义链序列同源性大于70%以上的核苷酸类似物，或与正义链序列同源性大于75%以上的核核苷酸类似物进行应用。

[0021] 不对称结构及修饰可增强siRNA分子的沉默效率

[0022] 上述设计获得的siRNA分子，正义链及反义链的长度均为21个核苷酸，其中反义链中自5’端始的连续19个核苷酸片段与细胞内靶RNA序列互补，反义链中连续19个核苷酸长度的片段与正义链互补。siRNA分子为核苷酸类结构，21个核苷酸的双链siRNA分子在体内或局部应用时，可产生免疫应答激活细胞膜上的Toll样受体3（Toll-like receptor 3, TLR3) ，从而激活NF-кB通路及caspase 3凋亡通路，释放炎症细胞因子，对细胞产生炎症反应，并引起细胞凋亡(Kleinman ME, et al.Nature. 2008; 452(7187):591-7. Mol Ther Nucleic Acids, 2018, 11, 300-311.)。因此，在获得上述有效沉默靶基因表达的siRNA分子模体（motif）结构后，在本发明中特异性设计出一种不对称结构，其中正义链与反义链互补形成的双链结构部分长度不超过20个核苷酸，可有效避免≥20个核苷酸的双链结构引起的免疫原性。同时，因核苷酸类结构性质，siRNA分子在生物体内或细胞内应用时会被核酸外切酶及内切酶降解，降低了siRNA分子的基因沉默效；通过对单个核苷酸中戊糖结构上2’-OH位进行2’-氟（2'-Fluoro，2’-F）或2’-甲氧基（2' O-methyl，2’-OMe）取代修饰，最优是对所有核苷酸进行稳定性修饰，可有效降低各种核苷酶的降解，延长体内作用时间；但对不同位置上核苷酸进行不确当的修饰，如连续的2’-氟或2’-甲氧基修饰，或跳跃式修饰（部分修饰）可能使得siRNA双螺旋结构本身，或在细胞内解螺旋后的siRNA反义链与靶mRNA之间不能形成类似天然的RNA双螺旋A型结构，可大大降低siRNA的基因沉默效率（Nat Biotechnol  . 2017；35(3): 238–248.）。在本发明中，采取对所有核苷酸都进行稳定性修饰的方式，经测试发现该修饰方式增加了模体衍生出的新siRNA结构的活性。

[0023] 另外，siRNA分子的作用靶部位为细胞内，siRNA分子首先必需穿过细胞膜进入胞内，然后继续穿过内体膜释放进入胞浆中，才能进入基因沉默复合体内发挥基因沉默效率(Sullenger B A,et al. Science. 2016; 352(6292):1417-1420.)。因此，体内或局部应用siRNA，不仅要克服siRNA分子产生免疫应答防止对机体细胞产生损伤及确保siRNA分子不被核酸酶降解，同时要有足够的脂溶性能最大量的穿过细胞膜及内体膜进入作用部位，才能最大限度地发挥siRNA分子的基因沉默活性。在本发明中，对siRNA中核苷酸链骨架采用硫代磷酸酯键修饰，可增加整个siRNA分子的脂溶性，尤其在反义链3’端单链部分采用足够多的硫代磷酸酯键骨架修饰，增加了siRNA分子的基因沉默活性。但反义链与靶mRNA互补序列太长，如大于25nt，可反过来抑制siRNA分子的沉默活性；在本发明中，在反义链的3’端用硫代磷酸酯键连接更多的脱氧胸腺嘧啶（dT），提高了整个分子的脂溶性，通过与细胞膜或内体膜相似相溶原理、或通过表皮生长因子（Epidermal growth factor, EGF）内吞循环通路（Nucleic Acids Research. 2017；45（1）：15–25），增加了siRNA释放进入细胞内基因沉默复合体内的数量，从而达到了提高基因沉默效率的目的。

[0024] 本发明提供的siRNA分子结构及修饰方式具有如下特征： 1）所有siRNA分子由正义链和与其反向互补的反义链组成的双链核苷酸分子，其中核苷酸分子包括：A、G、C、U、dA、dC、dG、dT，其中A为腺嘌呤核糖核苷酸；G为鸟嘌呤核糖核苷酸；C为胞嘧啶核糖核苷酸；U为尿嘧啶核糖核苷酸；dA为腺嘌呤脱氧核苷酸；dC为胞嘧啶脱氧核苷酸；dG为鸟嘌呤脱氧核苷酸；dT为胸腺嘧啶脱氧核苷酸。2）双链中，除正义链3’末端碱基外，所有核苷酸中戊糖结构上2’-OH位均被2’-氟（2'-Fluoro，2’-F）或2’-甲氧基（2' O-methyl，2’-OMe）取代。3）正义链及反义链间具有15、或16、或17、或18、或19个核苷酸序列互补。4）反义链的长度可为18-29个核苷酸，其中与细胞内靶RNA的互补序列长度为18-27个核苷酸。5）反义链的3’端的核苷酸数起可通过磷酸二酯键(phosphodiester bond)或硫代磷酸酯（phosphorothioate）键连接1-10个胸腺嘧啶脱氧核苷酸（Thymidine deoxidation，dT），所用dT可用2’-甲氧基或
2’-氟修饰，或不修饰。6）正义链3’端起始的第1位核苷酸不修饰，随后第2位核苷酸开始偶数位核苷酸用2’-甲氧基与奇数位核苷酸用2’-氟修饰。7）反义链5’端起始后奇数位核苷酸用2’-甲氧基修饰，偶数位核苷酸用2’-氟修饰。但从反义链3’端数起前3个核苷酸都用2’-甲氧基修饰，或反义链3’端部分不与正义链互补的单链中的每个核苷酸可随机用2’-甲氧基或2’-氟修饰。8）反义链5’端进行磷酸化修饰，反义链3’端起始后至少含有2个硫代磷酸酯键修饰核苷酸骨架。

[0025] 本发明提供的不对称结构及修饰方式，意外地发现可增加siRNA分子的基因沉默效率，这可能是本发明提供的对核苷酸进行稳定性修饰的方法，减少了核酸酶对siRNA分子的降解，没有破坏siRNA分子的A-型螺旋结构，且增加了细胞摄取及内体释放量，因而提高了siRNA分子的沉默效率。

[0026] 细胞靶向性分子修饰增加siRNA分子的沉默效率

[0027] 本发明提供细胞靶向性分子修饰上述siRNA分子可增加siRNA分子基因沉默效率的方法。siRNA分子必须进入细胞内才能具有基因沉默活性，但siRNA分子的核苷酸结构特性，无法主动进入细胞内，必须借助给药系统帮助其被动进入细胞内发挥作用。合适的给药系统确保siRNA分子进入特定靶细胞内，减少了siRNA分子的脱靶效应和副作用。本发明所述的给药系统为一种偶联物结构，为一种细胞靶向性结构分子与siRNA分子之间通过连接头（linker）分子偶联而成。这里所述的细胞靶向性分子可为某种特定细胞膜表达受体的配体（ligand）、或单克隆抗体及其类似结构、或某种细胞膜穿膜肽、或某种脂质结构分子、或适体（aptamer），特别优选αvβ3整合素受体的配体cyclo(RGDfK)（cRGD）寡肽，该寡肽可以是单价分子结构、双价分子结构、或三价分子结构，特别优选双价分子结构，简称biRGD分子，得到的偶联物结构为biRGD-siRNA。另一个特别优选的脂质结构为胆固醇（Cholesterol, Chol）分子，得到偶联物结构为Chol-siRNA。公开的研究表明，biRGD分子或胆固醇分子，可通过受体介导内吞或脂质相溶的途径将所携带的分子穿过细胞膜带入靶细胞内，从而发挥所携带分子的生物活性，这种所携带的分子可为上述任何一种siRNA分子，不需要任何其他给药系统，可帮助进入细胞内的siRNA分子发挥基因沉默效率。αvβ3整合素受体高水平表达于新生血管内皮细胞膜及部分肿瘤细胞膜，在人体正常及静止细胞膜上不表达或表达水平很低，因此biRGD-siRNA可治疗血管增生性伴随的疾病，如肿瘤及老年性黄斑病变（AMD）等疾病。由于胆固醇为细胞膜结构组成成分，系统给予Chol-siRNA分子可靶向进入体内多种组织细胞内，如肝脏、肾脏、肌肉、心脏、肺、胎盘。局部给药可进入脑、体腔、眼、关节、及皮肤等组织细胞内发挥基因沉默活性，具有治疗多种疾病的应用前景。本发明实施例中合成得到的biRGD-siPD-L1，及Chol-siPD-L1，在没有任何转染试剂的情况下，加入体外培养的细胞中，与未经细胞靶向性分子修饰的siRNA相比，大大增加了siRNA分子的沉默效率。特别是400nM 的Chol-siPD-L1，其中的siPD-L1为上述全修饰的不对称结构，共培养细胞96小时后，PD-L1目的蛋白表达水平仅为不加任何处理细胞水平的20%，显示了极高的基因沉默效率。

[0028] 本发明同时提供一种biRGD-linker-siRNA结构及一种Chol-linker-siRNA结构，可确保siRNA分子主动及被动进入靶细胞内，从而提高了未经靶向性分子修饰的siRNA的基因沉默效率。这里所述的siRNA不仅是上述siRNA分子，还包括其它能特异性沉默靶基因表达的其它核苷酸分子。

[0029] 抑制内体循环可增加siRNA分子的沉默效率

[0030] 本发明提供了抑制内体胞内循环增加siRNA从内体内释放、从而提高siRNA基因沉默效率的思路和方法。siRNA分子临床转化存在的最大问题是生物有效性有限。无论采用纳米载体给药系统，还是偶联物结构给药系统，目前制约siRNA分子生物有效性的最大瓶颈是进入细胞内体中的siRNA分子，仅有<0.01%的分子逃逸出来，进入胞浆中的基因沉默复合体发挥基因沉默效果。因此，增加内体内siRNA分子的逃逸数量可提高siRNA分子的基因沉默活性。

[0031] 目前认为细胞摄取siRNA分子后在细胞内的转运过程包括（Juliano R L.Nucleic Acid Ther. 2018；28(3):166-177. Crooke S T, et al.Nat Biotechnol. 2017; 35 (3): 230-237. Grant BD, et al. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009;10(9):597-608.): 1）由细胞膜上特异性受体及网格蛋白等介导摄取siRNA的纳米粒或偶联物形式的siRNA分子后形成内体。内体的胞内转运过程包括形成内吞小泡（Endocytic vesicles）、早期内体（Early endosome，EE）、多泡体（Multivesicular bodies，MVB）或称分选内体（Sorting endosome，SE）、腔内小泡（Intraintraluminal vesicles，ILVs）、循环内体（Recycling endosome，RE）、晚期内体（Late endosome，LE）、内吞溶酶体（Endolysosome）、及溶酶体（Lysosome）。2）多泡体（MVB）或称分选内体（SE）阶段后内体可向两个方向转运:①向晚期内体及溶酶体方向转运直至降解，同时有部分晚期内体通过长循环路径（Long loop）外排至胞外。②向循环内体（Recycling endosome，RE）方向转运，通过快速循环（Fast recycling）路径及慢循环（Slow recycling）路径外排至细胞膜供循环再利用，保持细胞膜的受体动态完整性及细胞的正常活性。由摄取的物质及膜受体种类等自身特性决定胞内内体转运的路径、循环方向、及转运各种路径的比例等。3）在早期内体（双层脂层）、多泡体（双层脂或单层脂）、循环内体及晚期内体（双层脂）间转运过程中，随着内体内及多泡体中pH值下降，内体荷载物质出现质子化（带更多的正电荷），此时细胞浆中内源性带负电荷的脂质分子就可以取代内体脂质结构内携带的核酸结构（如siRNA，带负电荷），特别是多泡体、循环内体及晚期内体阶段形成腔内小泡阶段，内体磷脂双层膜出现单层与双层脂层间的重排与转换，导致膜脂层结构不完整，此时内体中所荷载的 siRNA释放（漏）到胞浆中，参与到胞浆中的RISC实现RNA干扰。4）早期及晚期内体细胞外排siRNA的数量占全部内吞数量的30% 40%，溶~
酶体降解的siRNA数量可占全部内吞数量的40% 60%，释放进入胞浆内发挥RNAi的siRNA数~
量仅占溶酶体全部摄入的5% 10%。5）不同受体介导内吞后内体的细胞内转运过程类似，但~
早期循环内体介导的外排数量与晚期内体介导的Long-loop途径循环外排至细胞膜外的数量差异很大。早期内体快速外排致内体释放有限数量的siRNA，产生有限的生理活性；晚期内体介导的Long-loop途径循环外排，可释放更多的 siRNA，产生更高的基因沉默活性。不同受体介导内吞所形成的内体外排上的差异，是评价这些受体可否作为药物递送靶点的重要指标之一。6）可优先选择内吞后大多数形成晚期内体的受体作为递药靶点，或在制剂中加入破坏脂质双层的其它分子，或者抑制内体的早期循环迫使其进入细胞内下游的转运过程，以便更多的siRNA分子在细胞内的转运过程中被释放出来。

[0032] 内体的成熟与形成及胞内转运，对细胞活性至关重要。多种细胞因子的严格和协调作用调控内体成熟及转运的各个阶段，确保了内体的各种功能。内体系统是一个复杂的膜融合后形成的腔室，不同阶段的内体相互交换膜组成成分及所含物质。内体的成熟对细2+
胞的完整性和功能是必不可少的，受到从小GTP酶和调节脂类到pH和Ca 强度、从支架蛋白和转运链接因子到细胞骨架和内质网（ER）等多种因素的调控。目前研究发现了多种细胞因子及因素在不同阶段参与了内体的成熟和胞内转运循环（Nat Biotechnol. 2017; 35 (3): 230-237.）。

[0033] 目前内体在细胞内循环的确切机制尚未清楚，不同受体内吞后形成不同特性的内体，在胞内采取不同的循环方式，如快速循环为主、或长循环为主，或二种循环兼具，这取决于受体种类。只有充分了解内体的成熟和转运过程、及参与这些过程的调控因素，才能有针对性的寻找合适的方法来增加内体内药物的释放。

[0034] 在本发明的实施中，利用siRNA分子特异性沉默PD-L1表达的特性，制备了一种双价精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸寡肽（biRGD）-siPD-L1共价偶联物。在体外，biRGD-siPD-L1以αvβ3受体依赖的方式特异性地进入U87胶质瘤细胞并沉默了PD-L1 mRNA的表达。在本发明实施例中，利用biRGD-siPD-L1为模型分子，筛选得到了增加其基因沉默活性效率关键的内体循环调控靶点的细胞因子。

[0035] 目前采用的大多数给药系统给予siRNA分子进入细胞内体后，虽然siRNA分子总逃逸量<0.01%,但内体中siRNA的释放伴随着内体在胞内成熟、转运、外排及降解的全过程，仅是释放量多少有差异。在本发明的实施例中，利用RNAi理论，设计并筛选得到了特异性沉默多个内体转运调控细胞因子表达的siRNA分子，这些细胞因子对内体循环转运起关键调节作用。这些细胞因子及其siRNA分子分别为EHD3及siEHD3、AAK1L及siAAK1L、VPS8及siVPS8、VPS3及siVPS3、RAB4及siRAB4、RAB5及siRAB5、RAB7及siRAB7、RAB11及siRAB11、NPC1及siNPC1、PRKD1及siPRKD1。

[0036] 本发明意外地发现，细胞转染siAAK1L、siEHD3、siRAB5、siRAB7、及siNPC1后，可增加biRGD-siPD-L1对PD-L1蛋白表达的沉默效率。细胞因子AAK1L、EHD3、RAB5、RAB7、及NPC1分别调控内体早期快速循环、早期内体的成熟、多泡体（MVB）向晚期内体转运、及促进晚期内体外排循环等功能。特异性沉默这些细胞因子基因的表达，抑制了这些细胞因子的功能，从而抑制了内体在胞内的成熟及转运过程，减缓了内体循环外排出细胞及被降解的过程，内体在细胞内停滞的时间更长，增加了siRNA分子从内体逃逸出来进入胞浆中的机会，有更多的siRNA分子从内体中释放出来进入基因沉默发合体，增加了外源性siRNA分子的沉默效率。

[0037] 本发明发现说明，AAK1L、EHD3、RAB5、RAB7、及NPC1等细胞因子是调控内体释放更多内容物的靶点。抑制AAK1L、EHD3、RAB5、RAB7、及NPC1等细胞因子的功能，可促进siRNA的基因沉默效率。本发明采用RNAi理论技术抑制AAK1L、EHD3、RAB5、RAB7、及NPC1等细胞因子基因的表达，从而抑制这些细胞因子的功能，达到增加外源性siRNA分子基因沉默效率的目的。另外的其它抑制AAK1L、EHD3、RAB5、RAB7、及NPC1等细胞因子功能的方法，如单链核苷酸分子或化合物分子、或抑制这些细胞因子基因转录及翻译的方法，也是本发明保护的范围。抑制调控内体循环细胞因子的功能，有可能成为增加siRNA从内体释放最有效的方法，推进siRNA分子药物的临床转化。

[0038] siRNA分子能通过RNA干扰原理特异性沉默靶基因的表达，抑制血管增生，具有治疗因基因突变或过表达引起的疾病，单独或联合其它药物使用，治疗多种肿瘤（如脑胶质瘤、肺癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、肠癌等各种实体瘤）、血管增生性疾病（如老年黄斑病变）、疤痕、手术后粘连等多种疾病。

[0039] 有益效果：

[0040] 本发明筛选的siRNA分子得到了高沉默活性的分子基本序列结构，通过优化结构降低了免疫原性，对骨架结构进行硫代磷酸酯修饰以易于穿过细胞膜进入细胞内及易于从内体逃逸，优化结构中的核苷酸进行2’-甲氧基及2’-氟修饰，能提高血清稳定性，制备肿瘤组织靶向的双价cyclo(RGDfK)寡肽-及能被多种组织细胞摄取的胆固醇-siRNA偶联物（简称biRGD-siRNA，及Chol-siRNA)给药系统，提供了组织细胞良好的靶向性及易于穿过细胞膜进入胞内，提高转染效率，提供了阻止细胞内体循环增加内体逃逸能力，更多siRNA分子能够进入基因沉默复合体（RISC），增加siRNA分子从内体中释放，提高了siRNA分子在体内应用时的沉默效率。且用于合成药物能够提高多种肿瘤疾病的治愈能力。

[0041] 附表说明：

[0042] 附表1.具有对称结构且具有基因沉默活性的siRNA分子序列。

[0043] 附表2.具有不对称结构siRNA分子序列及其基因沉默活性。

[0044] 附表3.siRNA分子序列及其稳定性修饰。

[0045] 附表4.内体成熟与转运过程的调控因素。

[0046] 附表5.沉默内体循环相关细胞因子的siRNA分子序列及沉默效率。

[0047] 附表6.抑制内体转运相关细胞因子功能后目标基因沉默水平。

附图说明

[0048] 附图1. 筛选得到的能特异性沉默VEGFR2（图中A）、EGFR（图中B）、及PIK3CB（图中C） mRNA表达的siRNA分子的沉默效率对比图。（*P＜0.05，与Control比较；#P＜0.05，与siNC比较）。

[0049] 附图2. 附表3中不对称的siRNA分子及其修饰结构在基因水平上的沉默效率（*P＜0.05，与Control比较；#P＜0.05，与siNC比较）。

[0050] 附图3. 附表3中不对称的siRNA分子及其修饰结构在蛋白水平上的沉默效率（*P＜0.05，与Control比较；#P＜0.05，与siNC比较）。

[0051] 附图4.biRGD-siRNA结构示意图。

[0052] 附图5.Chol-siRNA结构示意图。

[0053] 附图6. 组织靶向性分子修饰的 siRNA分子在蛋白水平上的沉默效率（*P＜0.05，与Control比较；#P＜0.05，与siNC比较）。

[0054] 附图7.RNA干扰VEGFR2后对原代HUVECs小管形成的影响（100X）。

具体实施方式

[0055] 下述实施例中使用的实验方法如无特别说明，均为本专业领域熟知的方法。

[0056] 实施例1，siRNA制备：

[0057] 本发明参考Elbashir及Reynolds等人提供的方法（Elbashir SM, et al. Methods.2002;26:199-213.及Reynolds A, et al.Nature Biotechnology. 2004; 22: 326 - 330）,设计合成了多个候选siRNA分子序列。使用Blast比较分析得出本发明设计的siRNA序列与靶基因以外的其它基因没有同源性。

[0058] 本发明选择制备siRNA的靶基因为血管内皮细胞生长因子受体2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2，VEGFR2），磷酸肌醇3激酶催化β亚基（Phosphoinositide 3-Kinase Catalytic Beta Polypeptide , PIK3CB），及表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）。这些细胞因子与细胞生长及生存密切相关。VEGFR2在新生血管内皮细胞表面高水平表达，血管生成贯穿恶性肿瘤发生的全过程，影响肿瘤的发展和浸润转移；抑制血管生成可有效控制肿瘤的生长 (Ferrara N, et al. Nat Rev Drug Discov.2016;15(6):385-403)。肿瘤组织中PIK3CB高水平表达，如结直肠癌、恶性胶质瘤，从而激活了细胞生长必需的PI3K/AKT信号通路，抑制PIK3CB的表达可抑制肿瘤的生长（Fruman DA and Rommel C. Nature Reviews Drug Discovery. 2014;13(2):140-156.)。EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。任何细胞生长都需要激活表皮细胞生长因子受体介导的信号通路，肿瘤细胞高水平表达EGFR，所以抑制EGFR的功能是治疗肿瘤的重要靶点(Recondo G, et al. Nat Rev Clin Oncol. 2018 Nov;15(11):694-708.)。

[0059] 所述siRNA分子具有以下特征，反义链为21个核苷酸，其中19个核苷酸与细胞内靶mRNA序列互补，反义链的3’端用磷酸二酯键连接两个悬突的脱氧胸腺嘧啶（dT）；正义链含有21个核苷酸，其中连续的19个核苷酸与反义链互补，确保与反义链形成稳定的对称互补双链，正义链3’端用磷酸二酯键连接两个悬突的脱氧胸腺嘧啶（dT）。委托专业机构合成得到siRNA分子结构后，将U87MG细胞用培养基DMEM稀释传代，培养基含10%牛血清。Lipo2000转染各组终浓度为100nM的siRNA。另外，采用OPTI-MEM培养基给药，设定为空白对照组（未处理组）；含转染试剂培养细胞6小时后恢复全培养基培养48h后，收集细胞，提取细胞总RNA、逆转录合成cDNA，进行qPCR检测沉默效率，以人的beta-actin基因为内参基因，利用Real-time PCR试剂盒SYBR Premix(2X)(BIO-RAD 750000131)进行实时荧光定量PCR反应。每个样品用3个复孔重复实验，其中Ct的误差控制在±0.5 得到如图1所示的各样品细胞中相应mRNA表达水平，siRNA序列见表1。

[0060] 所述siRNA分子还具有如下特征：反义链的长度可为18-29个核苷酸，如长度为18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29个核苷酸，其中至少有19个连续核苷酸长度的片段与细胞内靶RNA序列互补，以便实现RNAi效应。正义链的长度为15-20个核苷酸，其中有15，16，
17，18，19，20个核苷酸与反义链互补，确保与反义链形成足够稳定的双链结构，可与反义链形成一种不对称siRNA分子结构，可有效避免免疫原性。该siRNA分子结构的特征为：1)正义链的长度为15-20个核苷酸；2）反义链的长度为18-29个核苷酸，其中与细胞内靶RNA的互补序列长度为18-27个核苷酸；3）正义链与反义链间具有15、或16、或17、或18、或19个核苷酸序列互补；4）反义链的3’端可以悬突连接1-10个脱氧胸腺嘧啶（dT）。

[0061] 在本实施中以特异性沉默程序性死亡受体-配体1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）的siRNA序列（专利申请号：201810012799.4）为模型siRNA分子，其中正义链：5'-GUAGUAGAUGUUACAAUUU-3'，反义链：5'-AAAUUGUAACAUCUACUACmn-3'。委托专业机构合成得到了具有以上所述特征的多种siRNA分子结构后，转染细胞测试基因沉默效率。将U87MG细胞用10%胎牛血清的DMEM培养基组成完全培养基进行培养。Lipo2000转染各组终浓度为100nM的siRNA。另外，采用OPTI-MEM培养基给药，设定为空白对照组（未处理组）；含转染试剂培养细胞6小时后更换完全培养基培养48h后，用0.25%胰酶消化收集细胞于1.5ml 的EP 管中，PBS 洗三遍（800rpm 离心3min），弃上清，将各组细胞分别收集至洁净的1.5 ml EP管中，PBS洗涤，取细胞沉淀物，每100 μl PBS溶液含5 μl PD-L1抗体（Ebioscience，12-5983），混匀，于冰上避光孵育25-30 min。反应结束后，离心去上清液，用PBS分别洗涤2次后，将细胞滤过细胞筛网，转移至流式细胞术专用管中，加入400 μl PBS溶液震荡重悬细胞，上细胞流式仪进行检测。经抗体孵育，应用流式细胞术检测细胞表面PD-L1蛋白水平。选用one-way ANOVA统计分析方法，首先采用Levene法进行方差齐性检验，方差齐（P＞0.05）。
流式细胞术结果显示：与Control组及siNC阴性对照组相比，所述各siRNA给药组细胞表面PD-L1受体蛋白表达量显著降低，不同siRNA结构及基因沉默的具体结果见附表2，说明所述结构特征的siRNA同样具有基因沉默活性。

[0062] 实施例2 ，对siRNA分子结构的稳定性修饰，增加其基因沉默活性：

[0063] siRNA类分子具核酸类结构性质，作为药物分子在体内使用时，会被体液中的及细胞内核苷酶降解，对siRNA核苷酸的每个碱基进行稳定性修饰，可有效防止体内核苷酶的降解，延长体内作用时间。但对核苷酸的修饰有可能降低整个siRNA分子的基因沉默活性，增加临床使用剂量，产生新的不良反应，不利于临床转化。本发明发现的修饰规律，具有如下特征：1）双链中，除正义链3’末端碱基外，所有核苷酸中戊糖结构上2’-OH位均被2’-氟（2’-F）或2’-甲氧基（2’-OMe）取代。2）正义链及反义链间具有15、或16、或17、或18、或19个核苷酸序列互补。3）反义链的长度可为18-29个核苷酸，其中与细胞内靶RNA的互补序列长度为18-27个核苷酸。4）反义链的3’端的核苷酸数起可通过磷酸二酯键或硫代磷酸酯键连接1-
10个胸腺嘧啶脱氧核苷酸（dT），所用dT可用2’-甲氧基或2’-氟修饰，或不修饰。5）正义链3’端起始的第1位核苷酸不修饰，随后第2位核苷酸开始偶数位核苷酸用2’-甲氧基与奇数位核苷酸用2’-氟修饰。6）反义链5’端起始后奇数位核苷酸用2’-甲氧基修饰，偶数位核苷酸用2’-氟修饰。但从反义链3’端数起前3个核苷酸都用2’-甲氧基修饰，或反义链3’端部分不与正义链互补的单链中的每个核苷酸可随机用2’-甲氧基或2’-氟修饰。7）反义链5’端进行磷酸化修饰，反义链3’端起始后至少含有2个硫代磷酸酯键修饰核苷酸骨架，对siRNA分子骨架修饰更多的硫代磷酸酯（phosphorothioate），增加整个siRNA分子的脂溶性，从而增加siRNA分子穿过细胞膜及逃逸出内体膜的机会。本发明提供的这种修饰方式，因双链结构的总长度少于21个核苷酸，不仅可有效避免细胞内应用产生免疫原性，还意外地发现可增加siRNA分子的基因沉默效率，这可能是本发明提供的对核苷酸进行稳定性结构修饰的方法，减少了核酸酶对siRNA分子的降解，没有破坏siRNA分子的A-型螺旋结构，因而提高了siRNA分子的沉默效率；骨架用硫代磷酸酯修饰增加了siRNA逃逸出内体的机会，从而增加了基因沉默效率。附表3提供了本实施例中稳定性修饰前后的siRNA序列及修饰位点，获得siRNA分子后用上述方法转染U87细胞后，用Real-Time PCR方法或流式细胞式分别检测mRNA或蛋白质水平沉默效率，结果见附图2及附图 3 ，由结果可知siRNA经修饰后结构的基因沉默效率高于修饰前siRNA结构。

[0064] 实施例3 ，组织靶向性分子修饰siRNA分子，增加其基因沉默活性：

[0065] siRNA分子具核酸类分子结构特点，即使经所述的修饰方式修饰后的结构，不能主动进入细胞内发挥基因沉默活性，必需借助给药载体辅助给药经受体介导或细胞膜融合方式才能进入细胞内发挥生物活性。本发明提供组织靶向性结构分子在正义链的一端或两端修饰siRNA分子，可增强siRNA分子结构的基因沉默效率，具有如下性质：1) biRGD-siRNA可靶向整合素αvβ3受体高水平表达的新生血管内皮细胞膜及部分肿瘤细胞膜，将所携带的所述siRNA通过受体介导的方式内吞进入细胞内，发挥siRNA的基因沉默活性。2）胆固醇为细胞膜结构成分，Chol-siRNA可增强所述siRNA分子的脂溶性，修饰后siRNA分子可经细胞膜融合的方式，增加更多的siRNA分子进入细胞内，增强siRNA分子的基因沉默活性。在本发明中提供一种biRGD-siRNA修饰结构见附图3，具体合成工艺路线见本发明前期研究基础（发明专利申请号：201710491426.5）及一种新的Chol-siRNA修饰结构见附图4，可委托专业公司合成。

[0066] 模型siRNA分子及其修饰结构见附表3。委托专业公司合成获得各种结构分子后，培养U87细胞，不加任何转染试剂，在培养基直接加入终浓度为400 nM的表5所示各种siRNA结构，在500µl OPTI中孵育转染培养20小时后，直接加入10% FBS继续培养72小后，用0.25%胰酶消化收集细胞于1.5ml 的EP 管中，PBS 洗三遍（800rpm 离心3min），弃上清，将各组细胞分别收集至洁净的1.5 ml EP管中，PBS洗涤，取细胞沉淀物，加入已稀释的抗体溶液（每100 μl PBS溶液含5 μl PD-L1抗体），混匀，于冰上避光孵育25-30 min。反应结束后，离心去上清液，1 ml PBS分别洗涤2次后，将细胞滤过细胞筛网，转移至流式细胞术专用管中，加入200 μl PBS溶液震荡重悬细胞，上细胞流式仪进行检测。经抗体孵育，应用流式检测细胞表面PD-L1蛋白表达量。选用one-way ANOVA统计分析方法，首先采用Levene法进行方差齐性检验，方差齐（P＞0.05）。流式细胞术结果显示：与Control组及siNC阴性对照组相比，所述各siRNA给药组中，仅经组织靶向性分子修饰后siRNA分子大幅增加了基因沉默活性，具体结果见附图5，说明所述结构特征可增加siRNA的基因沉默活性。

[0067] 实施例4 ，抑制内体循环，增加siRNA分子的基因沉默效率：

[0068] 目前采用的大多数给药系统给予siRNA分子进入细胞后，siRNA分子从内体中仅逃逸<0.01%的分子参与基因沉默过程,这是siRNA分子生物活性低下的最大限速瓶颈。内体中siRNA的释放伴随着内体在胞内成熟、转运、外排及降解的全过程，多种细胞因子参与了此过程，见附表4。我们假设抑制这些细胞因子的功能，从而抑制细胞内体（endosome）在胞内的成熟及循环，可使类似αvβ3受体等形成的内体在细胞内停留更长时间，使得所述siRNA分子有更多的机会从内体中逃逸进入胞浆中，参与基因沉默过程从而增强所述siRNA分子的基因沉默效率。

[0069] 在本发明的实施例中，利用RNAi理论，根据上述的方法设计并筛选得到了特异性沉默参与内体转运调控细胞因子表达的siRNA分子，从而达到抑制这些细胞因子功能、实现增强疾病治疗用siRNA基因沉默效率的目的。这些细胞因子及其siRNA分子分别为EHD3及siEHD3、AAK1L及siAAK1L、VPS8及siVPS8、VPS3及siVPS3、RAB4及siRAB4、RAB5及siRAB5、RAB7及siRAB7、RAB11及siRAB11、NPC1及siNPC1、PRKD1及siPRKD1。其中筛选到的有基因沉默活性的siRNA序列见附表5。

[0070] 在本实施中，利用siRNA分子特异性沉默PD-L1 mRNA表达的机制，制备了一种双价精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸寡肽（biRGD）-siPD-L1共价偶联物。其中siPD-L1正义链序列为：5’-GUAGAUGUUACAAUUU-3’,反义链序列为：5’-P-AAAUUGUAACAUCUACUACAAdTdT-3’。利用实施例2所述方法进行稳定性修饰。在体外，biRGD-siPD-L1以αvβ3受体依赖的方式特异性地进入胶质瘤细胞U87并沉默PD-L1的表达。在本实施例中，利用biRGD-siPD-L1为模型分子，筛选得到了增加其基因沉默效率的关键内体循环调控靶点的细胞因子。

[0071] 实验分组：

[0072] 1、空白对照组1：空白细胞，自始至终全培养基正常培养，确保真实的正常细胞中PD-L1的表达水平。

[0073] 2、空白对照组2：空白细胞，正常培养基培养（6小时+12小时）18小时后，（与其它各组细胞加入biRGD-PD-L1（16/23）的同一个时间点）加入biRGD-PD-L1（16/23）（400nM），48小时后流式检查biRGD-PD-L1在没有任何干预的前提下自身的沉默效率。

[0074] 3、空白细胞+脂质体转染siNC（100nM），转染培养6小时，用胰酶消化后，所有细胞一分为二。

[0075] siNC组1：全培养基培养12小时，再用全培养基培养48小时，流式测定PD-L1的表达水平。

[0076] siNC组2：全培养基培养12小时，加入biRGD-PD-L1（16/23）(400nM)后再用全培养基培养48小时，流式测定PD-L1的表达水平。

[0077] 4、空白细胞+脂质体转染siAAK1L（100nM），转染培养6小时后，用胰酶消化后，所有细胞一分为二。

[0078] siAAK1L组1：全培养基培养12小时，再用全培养基培养48小时，流式测定PD-L1的表达水平。

[0079] siAAK1L组2：全培养基培养12小时，加入biRGD-PD-L1（16/23）(400nM)后再用全培养基培养48小时，流式测定PD-L1的表达水平。

[0080] 5、其它各细胞因子组转染及加样同siAAK1L组1/2。

[0081] 实验方法：

[0082] 按常规方法培养U87-luc细胞，培养基为DMEM+10%FBS，将上述siRNA用脂质体分别转染U87-luc细胞（按说明书进行），siRNA终浓度为100nM；转染后6小时换成全培养基（DMEM+10%FBS），继续培养12小时后，换成OPTI-MEM培养基并加入终浓度为400nM的biRGD-siPD-L1-16/23模型分子，加药后24h加入全培养基，继续孵育培养24小时后，收集细胞，Anti-Human CD274抗体孵育后通过流式细胞术检测其荧光强度，用未孵育抗体的空白对照组进行对比分析，计算得到biRGD-siPD-L1-16/23的沉默效率。

[0083] 实验结果：

[0084] 本发明意外地发现，细胞转染siAAK1L、siRAB7、siNPC1、siRAB5及siEHD3后，可增加biRGD-siPD-L1对靶基因PD-L1蛋白水平的沉默水平，增加的沉默效率占单纯biRGD-siPD-L1沉默PD-L1蛋白表达效率分别达到60.91%、53.68%、49.94%、22.91%及22.79%，具体结果见下附表6。细胞因子AAK1L、EHD3、RAB5、RAB7、及NPC1分别调控内体早期快速循环、早期内体的成熟、多泡体（MVB）向晚期内体转运、及促进晚期内体外排循环等功能，特异性沉默这些细胞因子基因的表达，抑制这些细胞因子的功能，从而抑制了内体在胞内的成熟及转运过程，减缓了内体循环外排出细胞及被降解的过程，内体在细胞内停滞的时间更长，增加了siRNA分子从内体中逃逸出来进入胞浆中的机会，有更多的siRNA分子从内体中释放出来进入基因沉默发合体，增加了外源性性siRNA分子的沉默效率。

[0085] 本发明发现说明，AAK1L、EHD3、RAB5、RAB7、及NPC1等细胞因子是调控内体释放更多内容物的靶点。抑制AAK1L、EHD3、RAB5、RAB7、及NPC1等细胞因子的功能，可促进内体释放更多的siRNA分子进入胞浆内发挥siRNA分子的基因沉默效率。本发明采用RNAi理论技术抑制AAK1L、EHD3、RAB5、RAB7、及NPC1等细胞因子基因的表达，从而抑制这些细胞因子的功能，达到增加外源性siRNA分子基因沉默效率的目的。另外的其它抑制AAK1L、EHD3、RAB5、RAB7、及NPC1等细胞因子功能的方法，如单链核苷酸分子及化合物分子、或抑制这些细胞因子基因转录及翻译的方法，同样可增加内体中荷载其它分子的释放，也是本发明保护的范围。抑制调控内体循环细胞因子的功能，可成为增加siRNA从内体释放的有效方法之一，推进siRNA分子药物的临床转化。

[0086] 实施例5 ，本发明的siRNA分子的应用：

[0087] 小干扰RNA分子（siRNA）可有效沉默靶基因的表达，本实施例用本发明所述技术方案得到的siRNA分子结构可有效抑制新生血管的生成及抑制肿瘤的生长。利用本发明技术方案，siRNA分子具有本发明所述结构特征，不仅具有本实施例方案表现的治疗疾病的应用前景，还具有单独或联合其它药物用药后治疗因基因突变或过表达引起的疾病的应用前景。治疗疾病时的给药方案不限于系统途径给药，还可以局部组织给药、经皮肤外用给药、腔内给药、眼内给药等，具有类似的生物活性。

[0088] 体外抑制血管生成：

[0089] 人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在体外培养后可形成“血管横切面”或“管状”形状，其细胞膜高水平表达人血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2），抑制VEGFR2的表达及功能可降低HUVEC“管状”形状生成。在本实施例中发现，体外转染本发明所述特异性沉默VEGFR2的siRNA后，可有效降低HUVEC“管状”形状生成，在临床上具有抑制血管生成治疗因血管增生而引起疾病的应用前景。

[0090] 方案如下：将HUVEC细胞接种于6孔板中培养至50%-60%密度，按照lipo 3000试剂说明书操作，lipo 3000转染siVEGFR2-5（siHVR2-5）、siVEGFR2-8（siHVR2-8）、siVEGFR2-11（siHVR2-11）、siVEGFR2-12（siHVR2-12）及siNC ，使细胞转染培养基中siRNA的终浓度为100 nM；空白对照组细胞同样采用无血清培养基培养。6小时后恢复全培养基，继续培养48小时后，胰酶消化细胞，用基础培养基重悬细胞，调整细胞数接种于预先接种基质胶的96孔板中。37度培养6小时后，荧光显微镜下观察细胞小管形成情况并拍照，Image J软件计算视野中血管管腔总分支长度，血管生长情况见附图6。

[0091] 如附图6所示，siVEGFR2转染原代HUVECs后，可明显抑制细胞的小管形成，control及siNC组可形成完整的管腔结构，而siVEGFR2干扰后的细胞只能零散分布，无法形成完整的管腔结构，表明RNA干扰VEGFR2基因后可有效抑制原代HUVECs的血管生成功能。新生血管是肿瘤的标志之一，丰富的新生血管为肿瘤的生长提供良好的生存环境，而阻断肿瘤部位的新生血管，使肿瘤饥饿从而起到抑制肿瘤的作用。通过RNA干扰VEGFR2基因可有效抑制血管生成，可为肿瘤治疗提供有效途径及其它血管增生引起的疾病的应用前景。说明本发明提供的siRNA具有很好地生物学功能。

[0092] 附表1.具有对称结构且具有基因沉默活性的siRNA分子序列：

[0093] 。

[0094] 附表2.具有不对称结构siRNA分子序列及其基因沉默活性：

[0095]

[0096] 附表3. siRNA分子序列及其稳定性修饰：

[0097]

[0098] 附表4. 内体成熟与转运过程的调控因素：

[0099] 。

[0100] 附表5. 沉默内体循环相关细胞因子的siRNA分子序列及沉默效率：

[0101] 。

[0102] 附表6. 抑制内体转运相关细胞因子功能后目标基因沉默水平：

[0103] 。

[0104] 附表6（续）. 抑制内体转运相关细胞因子功能后目标基因沉默水平：

[0105] 。