LINC01992在乳腺癌诊疗中的应用

摘要

本发明公开了LINC01992在乳腺癌诊疗中的应用，本发明通过高通量测序技术首先发现了LINC01992在乳腺癌中表达上调，即通过检测LINC01992的表达水平可以判断受试者是否患有乳腺癌。本发明同时公开了LINC01992在构建预测乳腺癌的计算模型中的应用，本发明还公开了LINC01992在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

权利要求

1.检测LINC01992的试剂在制备诊断乳腺癌的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括通过反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片技术检测LINC01992表达水平的试剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过反转录PCR检测LINC01992表达水平的试剂至少包括一对特异性扩增LINC01992的引物，通过实时定量PCR检测LINC01992表达水平的试剂至少包括一对特异性扩增LINC01992的引物，通过原位杂交检测LINC01992表达水平的试剂包括特异性识别LINC01992的探针，通过芯片技术检测LINC01992表达水平的试剂包括特异性识别LINC01992的探针。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、试剂盒。

5.LINC01992在构建预测乳腺癌的计算模型中的应用。

6.LINC01992的抑制剂在制备治疗乳腺癌的药物中的应用，其特征在于，所述抑制剂为siRNA。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.5～8所示。

说明书

LINC01992在乳腺癌诊疗中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及LINC01992在乳腺癌诊疗中的应用。

背景技术

[0002] 乳腺癌是女性最为常见的肿瘤之一。美国2012年全球肿瘤的统计数据显示，美国女性乳腺癌的发病率及死亡率分别为第一和第二位，每年约有246660例新增乳腺癌患者，死亡率仅次于呼吸道肿瘤(Torre,L.A.,et al.,Global cancer statistics,2012.CA Cancer J Clin,2015.65(2):p87-108.)。中国虽然是乳腺癌发病率较低的国家之一，但近几年乳腺癌发病率及死亡率仍占女性恶性肿瘤的首位(Chen,W.,et al.,Cancer statistics in China,2015.CA Cancer J Clin,2016.66(2):p115-32.)。乳腺癌主要以手术、放疗、化疗、内分泌和靶向治疗等单一或组合的治疗方式为主。虽然综合治疗降低了总死亡率，但乳腺癌作为一种高度异质性肿瘤，死亡率一直居高不下。同一临床分期的乳腺癌患者即使在接受相同治疗方案的情况下，对治疗的敏感性及疗效仍存在较大的个体差异。多数晚期乳腺癌患者虽然接受联合化疗，但只有约50％的患者获益，而另一半患者则只承受了化疗药物的毒副作用。因此，在乳腺癌现有的分子分型的基础上进一步细化分型以指导精准治疗极为重要。目前乳腺癌分子分型有Luminal A型、Luminal B型、Her-2过表达型及三阴性等四种类型(Perou,C.M.,et al.,Molecular portraits of human breast tumours.Nature.2000.406(6797):p.747-52.)不同分子分型乳腺癌患者之间存在较大的预后及疗效差异(Stathopoulos,G.P.,et al.,The role of Ki-67in the proliferation and prognosis of breast cancer molecular classification subtypes.Anticancer Drugs,2014.25(8):p.950-7.)。其中Luminal型乳腺癌患者的预后优于其他亚型。虽然现有的分子分型对患者的治疗及预后评估提供了较好的依据，但对于其中部分高异质性的乳腺癌患者仍不能解决治疗上的困境。

[0003] 探寻三阴性乳腺癌的潜在治疗靶点一直是乳腺癌研究领域的热点之一。研究发现，三阴性乳腺癌患者中因某些分子标记物的不同可导致预后存在差异。CK5/6,EGFR等分子标记物可用来对三阴性乳腺癌进行进一步的亚组分型(Nielsen,T.O.,et aL,Immunohistochemical and clinical characterization of the basal-like subtype of invasive breast carcinoma.Clin Cancer Res,2004.10(16):p.5367-74.)。不同分子分型的乳腺癌中，LuminalA型公认的预后相对较好的类型，但其中仍有部分患者预后较差，因此我们有必要对Luminal A型乳腺癌进行进一步的亚组分型。以期找出Luminal A型乳腺癌患者中引起预后不良的异质性因子，从而能够更加精准的进行靶向治疗。

发明内容

[0004] 为了弥补现有技术的不足，本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量测序的方法，检测乳腺癌标本中lncRNA在肿瘤组织和正常组织的表达，发现其中具有明显表达差异的lncRNA，探讨其与乳腺癌的发生之间的关系，从而为乳腺癌的诊断及靶向治疗寻找更好的途径和方法。

[0005] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0006] 本发明提供了检测LINC01992的试剂在制备诊断乳腺癌的产品中的应用。

[0007] 本发明包括任何本领域可用的检测内在基因LINC01992表达的方法。“检测表达”是指确定内在基因的RNA转录物或其表达产物的量或存在。检测本公开的内在基因表达，即基因表达概况分析的方法包括基于多核苷酸杂交分析的方法、基于多核苷酸测序的方法。这些方法通常检测本文所述的内在基因的表达产物(例如lncRNA)。

[0008] 进一步，所述试剂包括通过反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片技术检测LINC01992表达水平的试剂。

[0009] 进一步，通过反转录PCR检测LINC01992表达水平的试剂至少包括一对特异性扩增LINC01992的引物，通过实时定量PCR检测LINC01992表达水平的试剂至少包括一对特异性扩增LINC01992的引物，通过原位杂交检测LINC01992表达水平的试剂包括特异性识别LINC01992的探针，通过芯片技术检测LINC01992表达水平的试剂包括特异性识别LINC01992的探针。

[0010] 进一步，通过实时定量PCR检测LINC01992表达水平的特异性扩增LINC01992的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

[0011] 进一步，所述产品包括芯片、试剂盒。所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的特异性识别LINC01992的寡核苷酸探针，所述试剂盒包括特异性扩增LINC01992的引物、特异性识别LINC01992的寡核苷酸探针或芯片。

[0012] 特异性识别LINC01992的寡核苷酸探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

[0013] 所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

[0014] 进一步，所述乳腺癌为Luminal A型乳腺癌。

[0015] 许多表达检测方法使用分离的RNA。起始材料典型地是从生物样品，例如分别从肿瘤或肿瘤细胞系，以及相应的正常组织或细胞系分离的总RNA。如果RNA的来源是原发性肿瘤，则可以从冷冻的或保存的石蜡包埋并固定的(例如福尔马林固定的)组织样品(例如病理学家指导的组织核心样品)中提取RNA(例如mRNA)。

[0016] RNA提取的一般方法是本领域熟知的。特别地，可以使用来自商业制造商，例如TIANGEN的纯化试剂盒、缓冲剂套组和蛋白酶进行RNA分离，按照制造商的说明进行。其它可商购的RNA分离试剂盒包括MASTERPURETM Complete DNA和RNA纯化试剂盒(Epicentre,Madison,Wis.)和Paraffin Block RNA分离试剂盒(Ambion,Austin,TX)。例如，可以使用RNA Stat-60(Tel-Test,Friendswood,TX)从组织样品中分离总RNA。例如，可以使用高纯FFPE RNA Microkit,货号04823125001(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)从FFPE中分离总RNA。例如，可以通过氯化铯密度梯度离心分离从肿瘤制备的RNA。此外，可以通过使用本领域技术人员熟知的技术容易地处理大量组织样品。

[0017] 本发明提供了一种诊断乳腺癌的产品，所述产品包括检测LINC01992表达水平的试剂。

[0018] 进一步，所述产品包括芯片或试剂盒，芯片中检测LINC01992表达水平的试剂包括特异性识别LINC01992基因的探针；试剂盒中检测LINC01992表达水平的试剂包括特异性扩增LINC01992基因的引物或特异性识别LINC01992基因的探针。

[0019] 作为一种实施方案，试剂盒包含一组寡核苷酸引物，所述引物足以检测和/或定量本发明所述的内在基因。寡核苷酸引物可以以冻干或重构的形式提供，或者可以作为一组核苷酸序列提供。在一个实施方案中，以微孔板(microplate)的形式提供引物，其中每一个引物组占用微孔板中的一个孔(或多个孔，如在重复的情况下)。微孔板可以进一步包含足以检测如下所述的一个或多个看家基因的引物。试剂盒可以进一步包含足以扩增本发明所述的基因的表达产物的试剂和说明。

[0020] 为了便于快速访问，例如为进行比较、检查、恢复、和/或修改，分子特征/表达概况典型地记录在数据库中。最典型地，数据库是可由计算机设备访问的关系数据库，虽然可以使用其它形式，例如作为照片、模拟或数字成像读数、电子表格等的表达概况的手动访问索引文件。无论最初记录的表达模式本质上是模拟的或数字的，表达模式、表达概况(集合的表达模式)和分子特征(相关表达模式)以数字形式储存并通过数据库访问。典型地，数据库在中央设备编辑并维持，可以在本地和/或远程访问。

[0021] 进一步，特异性扩增LINC01992基因的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

[0022] 本发明提供了LINC01992在构建预测乳腺癌的计算模型中的应用。

[0023] 进一步，所述乳腺癌为Luminal A型乳腺癌。

[0024] 本发明提供了LINC01992在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

[0025] 进一步，所述药物包括LINC01992的抑制剂，所述抑制剂以LINC01992其为靶序列、且能够抑制LINC01992表达水平的试剂，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物等。

[0026] 作为本发明的一种优选方式，所述抑制剂是一种LINC01992特异性的小干扰RNA分子。如本文所用，所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子，能够以同源互补序列的mRNA为靶目标降解特定的mRNA，这个过程就是RNA干扰(RNA interference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式，它含有一个正义链和一个反义链，这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此，举例来讲，互补的正义链和反义链是化学合成的，其后可通过退火杂交，产生合成的双链RNA复合物。

[0027] 进一步，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.5～8所示。

[0028] 本发明提供了一种治疗乳腺癌的药物，所述药物包括LINC01992的抑制剂。所述抑制剂以LINC01992其为靶序列、且能够抑制LINC01992表达水平的试剂，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物等。

[0029] 进一步，所述抑制剂为siRNA。

[0030] 进一步，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.5～8所示。

[0031] 本发明所述的药物还包括药学上可接受的载体，包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。

[0032] 在本发明中，术语“LINC01992”位于17号染色体上，基因ID为105371708，包括LINC01992基因及其的同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的LINC01992，以及源自细胞中加工的任何形式的LINC01992。该术语涵盖LINC01992的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。该术语涵盖例如LINC01992基因，人LINC01992的基因序列(NR_146896.1)，以及来自任何其它脊椎动物来源。

[0033] 在本发明的一个实施方案中，通过评价一个或多个主体样品中本发明所述的内在基因的表达模式或表达概况来评估乳腺癌亚型。为了讨论的目的，术语主体，或主体样品，指个体，不管其健康和/或疾病状态。主体可以是受试者、研究参与者、对照主体、筛选主体、或任何由其获得样品的并在本发明的背景下被评估的其他类别的个体。相应地，主体可以被诊断为患有乳腺癌，可以呈现出乳腺癌的一种或几种症状，或者对于乳腺癌的诱发因素，例如家族(遗传)或医疗史(医疗)因素，可以正在接受乳腺癌的治疗或疗法，等等。或者，就任何上述因素或标准而言，主体可以是健康的。应当理解本文使用的术语“健康”是相对于乳腺癌状态而言的，因为术语“健康”不能定义为相应于任何绝对的评价或状态。因此，对于任何特定疾病或疾病标准来说，被定义为健康的个体可以实际上被诊断为患有任何其它一种或多种疾病，或者表现出任何其它一种或多种疾病标准，包括一种或多种除乳腺癌以外的癌症。但是，健康对照优选没有任何癌症。

[0034] 在特定的实施方案中，预测乳腺癌内在亚型的方法包括收集包含癌细胞或组织的生物样品，例如乳腺组织样品或原发乳腺肿瘤组织样品。“生物样品”意指任何在其中可以检测内在基因表达的细胞、组织、或体液的取样。这种生物样品的实例包括，但不限于活组织检查和涂片。可用于本发明的体液包括血液、淋巴液、尿液、唾液、乳头抽吸液、妇科液体、或任何其它身体分泌液或其衍生物。血液可以包括全血、血浆、血清或任何血液衍生物。在一些实施方案中，生物样品包括乳腺细胞，特别是来自活组织检查的乳腺组织，例如乳腺肿瘤组织样品。可以通过多种技术从主体获得生物样品，包括，例如通过刮擦或擦抹一个区域、通过使用针抽吸细胞或体液、或者通过移除组织样品(即活组织检查)。收集各种生物样品的方法是本领域熟知的。在一些实施方案中，通过，例如，细针抽吸活检，穿刺活检，或切除活检获得乳腺组织样品。可以对细胞或组织应用固定剂和染色液以保存样本并便于检查。生物样品，特别是乳腺组织样品，可以转移至载玻片以进行放大观察。在一个实施方案中，生物样品是福尔马林固定、石蜡包埋的乳腺组织样品，特别是原发乳腺肿瘤样品。在不同的实施方案中，从病理学家指导的组织核心样品获得组织样品。

[0035] 本发明的优点和有益效果：

[0036] 本发明首次发现了LINC01992基因的表达水平与乳腺癌相关，通过检测受试者样本中LINC01992的表达水平，可以判断受试者是否患有乳腺癌，以及患乳腺癌的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

[0037] 本发明发现了一种与乳腺癌相关的LINC01992基因分子标记物，采用分子标记物进行诊断，相比传统诊断手段，更及时、更灵敏、更特异。

附图说明

[0038] 图1是利用QPCR检测LINC01992基因在乳腺癌组织中的表达情况图。

[0039] 图2是利用QPCR检测siRNA沉默LINC01992的情况图。

[0040] 图3是利用CCK检测LINC01992对MCF-7细胞的增殖影响图。

[0041] 图4是利用Transwell小室检测LINC01992对MCF-7细胞迁移侵袭能力的影响图，其中图A是细胞迁移，图B是细胞侵袭。

[0042] 具体的实施方式

[0043] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0044] 实施例1筛选与乳腺癌相关的基因标志物

[0045] 1、样品收集

[0046] 分别收集4例Luminal A型乳腺癌的癌组织及相对应的正常组织样本(距离肿瘤边缘5公分)，进行高通量测序，所有患者术前未进行化疗、放疗以及内分泌治疗，所有患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意，病人信息如表1所示。

[0047] 表1样本信息

[0048]

[0049] 2、RNA样品的制备及质量分析

[0050] 使用Takara RNA提取试剂盒(Code NO.9767)提取组织中的RNA，步骤如下：

[0051] 1)将新鲜的或超低温冻存的动物组织样品迅速转移至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状。将研磨成粉末状的样品加入到含有裂解Buffer RL的1.5ml灭菌离心管中，用移液器反复吹打直至裂解液中无明显沉淀。

[0052] 2)将裂解液在12,000rpm，4℃离心5min。

[0053] 3)小心吸取上清液到新的1.5ml RNase Free Tube中。

[0054] 4)加入与液体等体积的70％乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀。

[0055] 5)立即将混合液全部转入到RNA Spin Column中。

[0056] 6)12,000rpm，离心1min，弃滤液。将RNA Spin Column放回到2ml收集管中。

[0057] 7)将500μl的Buffer RWA加入至RNA Spin Column中，12,000rpm离心30s，弃滤液。

[0058] 8)将600μl的Buffer RWB加入至RNA Spin Column中，12,000rpm离心30s，弃滤液。

[0059] 9)重复步骤8)。

[0060] 10)将RNA Spin Column重新安置于2ml收集管上，12,000rpm离心2min。

[0061] 11)将RNA Spin Column安置于1.5ml的无RNA酶收集管上，在RNA Spin Column膜中央处加入50～200μl的RNase Free dH2O或0.1％DEPC处理水，室温静置5min。

[0062] 12)12,000rpm离心2min洗脱RNA。

[0063] 13)检测RNA浓度，鉴定RNA的产量和纯度。

[0064] 3、cDNA文库的构建及测序

[0065] 1)总RNA DNase I消化：利用DNase I消化Total RNA样品中存在的DNA片段，磁珠纯化回收反应产物，最后溶解于DEPC水；

[0066] 2)去除rRNA：取消化好的Total RNA样品，使用Epicentre的Ribo-Zero试剂盒去除rRNA，去除之后进行Agilent 2100检测，验证rRNA去除效果；

[0067] 3)RNA打断：取上一步样品，加入打断Buffer，置于PCR仪中进行热打断，打断到140-160nt；

[0068] 4)反转录一链的合成：向打断后的样品中加入适量引物，充分混匀后在Thermomixer适温反应一定时间，使之打开二级结构并与引物结合，再加入提前配制的一链合成反应体系Mix，在PCR仪上按相应程序合成一链cDNA；

[0069] 5)反转录二链的合成：配制二链合成反应体系，在Thermomixer上适温反应一定时间，合成带有dUTP的二链cDNA，反应产物用磁珠进行纯化回收；

[0070] 6)末端修复：配制末端修复反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，对反转录得到的cDNA双链的粘性末端进行修复，末端修复产物用磁珠进行纯化回收，最后将样品溶于EB Solution；

[0071] 7)cDNA 3’末端加“A”：配制加“A”反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使末端修复的产物cDNA的3’末端加上A碱基；

[0072] 8)cDNA5’adapter的连接：配制接头连接反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使接头与A碱基连接，产物用磁珠进行纯化回收；

[0073] 9)UNG消化cDNA二链：配制UNG消化反应体系，通过UNG酶消化掉双链DNA中的二链，并用磁珠对产物进行纯化回收；

[0074] 10)PCR反应及产物回收：配制PCR反应体系，选择适当的PCR反应程序，对上步骤得到的产物进行扩增，对PCR产物进行磁珠纯化回收，回收产物溶于EB溶液中，贴上标签。

[0075] 11)文库质量检测：使用Agilent 2100Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System对文库质量进行检测；

[0076] 12)上机测序：检测合格的文库，加入NaOH变性成单链，按照预期上机数据量，稀释至一定的上机浓度。变性稀释后的文库加入到FlowCell内，与FlowCell上的接头杂交，在cBot上完成桥式PCR扩增，最后使用Illumina Hiseq x-ten平台进行测序。

[0077] 4、生物信息学分析

[0078] 1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads；

[0079] 2)hisat2比对到参考基因组上。参考基因组来自于Ensembl数据库，基因组版本GRCh38，基因注释信息为Ensemble 92；

[0080] 3)stringtie定量lncRNA的表达量并标准化输出；

[0081] 4)edgeR包比较对照组跟疾病组lncRNA的表达差异，差异变动lncRNA的筛选标准是|log2FC|>1且pvalue<0.05。

[0082] 5、结果

[0083] 测序数据如表2所示，生物信息学分析发现，LINC01992在乳腺癌患者中表达显著上调，提示LINC01992可能作为检测靶标应用于乳腺癌的早期诊断。

[0084] 表2测序数据

[0085]

[0086] 实施例2 QPCR测序验证LINC01992基因的差异表达

[0087] 1、按照实施例1的收集方式收集的25例Luminal A型乳腺癌患者癌组织样本和正常组织样本对LINC01992基因差异表达进行大样本QPCR验证。

[0088] 2、RNA提取

[0089] Takara RNA提取试剂盒(Code NO.9767)提取组织中的RNA，具体步骤参见实施例1。

[0090] 3、QPCR

[0091] 根据LINC01992和GADPH的基因序列设计引物，引物序列如表3所示。

[0092] 表3扩增引物

[0093]

[0094] 使用TaKaRa One Step TB GreenTM Prime ScriptTM RT-PCR试剂盒(Code No.RR066A)进行PCR反应，反应体系和反应条件如表4所示。在Thermal CyclerTime System扩增仪上进行PCR扩增，反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和溶解曲线，ΔΔCT法进行相对定量。

[0095] 表4 QPCR反应体系和反应条件

[0096]

[0097] 4、结果

[0098] QPCR结果如图1所示，与正常组织相比，LINC01992在乳腺癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同高通量测序结果一致，其中，所有的样本中共有27例样本中的LINC01992的表达上调，27例上调样本中乳腺癌组织样本占24例，正常组织样本占3例，而23例样本中LINC01992则无显著变化，23例样本中，乳腺癌组织样本占1例，正常组织样本占22例，提示可通过检测LINC01992的水平判断受试者是否患有乳腺癌，当LINC01992的水平显著增加时，受试者患有乳腺癌或者存在患有乳腺癌的风险，通过LINC01992与乳腺癌之间的关系可以设计靶向LINC01992的shRNA、siRNA从而治疗乳腺癌。

[0099] 实施例3 LINC01992在乳腺癌细胞系中的表达情况

[0100] 1、细胞培养

[0101] 培养Luminal A型乳腺癌的MCF-7细胞系，于5％CO2，37℃的恒温培养箱中进行培养，所有细胞培养基中加10％胎牛血清以及1％P/S。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶进行常规消化，按1:3的比例将细胞进行传代。

[0102] 2、siRNA序列

[0103] 本申请所用的siRNA-NC、siRNA-LINC01992购自上海吉码制药技术有限公司，沉默LINC01992的序列siRNA-1和siRNA-2所示：

[0104] siRNA-1的序列：

[0105] 正义链为5’-UACCAUAUCUUAUACUCUGAG-3’(SEQ ID NO.5)

[0106] 反义链为5’-CAGAGUAUAAGAUAUGGUAUA-3’(SEQ ID NO.6)

[0107] siRNA-2的序列：

[0108] 正义链为5’-UUUGUUGAUCAUGUUUCUGGG-3’(SEQ ID NO.7)

[0109] 反义链为5’-CAGAAACAUGAUCAACAAAGA-3’(SEQ ID NO.8)

[0110] 3、转染

[0111] 使用Invitrogen公司的LipofectaminTM2000试剂进行细胞转染，将实验分为三组：对照组(MCF-7)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA-1、siRNA-2)，其中阴性对照组siRNA与LINC01992基因的序列无同源性。

[0112] 细胞转染前准备取培养箱中提前种植在6孔板中的细胞，用无血清的OPTI-MEM转染液冲洗转染细胞两次后，每孔中加入1500μl OPTI-MEM转染液，6孔板放回细胞培养箱中继续培养，转染时培养基内含有血清。将使用无血清的OPTI-MEM稀释的siRNA与LipofectamineTM试剂混匀后孵育15min，将孵育好的转染复合物加入细胞中于培养箱中进行培养，6h后弃掉转染液，细胞放回到培养箱内继续培养。

[0113] 4、QPCR检测LINC01992的表达水平

[0114] 1)RNA的提取

[0115] 使用Takara RNA提取试剂盒(Code NO.9767)提取培养细胞中的总RNA。

[0116] 2)QPCR检测步骤同实施例2

[0117] 5、结果

[0118] siRNA-1和siRNA-2小分子对LINC01992都有较好的沉默效果，其中siRNA-1的沉默效果最为显著(P<0.05)(图2)，因此选择siRNA-1作为沉默序列应用于后续的功能验证，本实验中所有细胞实验均重复3次。

[0119] 实施例4 CCK-8法检测LINC01992基因对乳腺癌细胞增殖的影响

[0120] 用siRNA-1转染的乳腺癌细胞作为实验组，siRNA-NC转染的细胞作为对照组，加入到96孔板中，每孔加入的细胞数量为3000个，每组设置5个复孔。分别用于24h、48h、72h、96h检测时间点检测。每隔24h细胞孔中加入10μl的CCK-8检测液，将96孔板继续放入细胞培养箱中孵育4h左右，用酶标仪检测各孔在450nm波长处的吸光度值并记录数据，连续测到96h。根据检测的OD值的平均值，绘制生长曲线。

[0121] 生长曲线结果显示，实验组在转染siRNA-1后，细胞的增殖能力明显低于对照组(图3)，说明LINC01992影响乳腺癌细胞的增殖。

[0122] 实施例5 Transwell小室检测LINC01992对细胞迁移及侵袭的影响

[0123] 1、Transwell小室制备

[0124] 无菌条件下Matrigel冰浴融化后按1:8比例稀释Matrigel胶，在Transwell上室内部缓慢加入上室底部，铺胶后迅速移入37℃的细胞培养箱中温育至其凝固成胶状。

[0125] 2、迁移实验中，上室加入数量为5×104的100μl细胞悬液，下室加入600μl含10％胎牛血清培养基，每组设置3个复孔；侵袭实验中，向铺有Matrigel胶的上室中加入数量为1×105的100μl细胞悬液，下室加入600μl含10％胎牛血清培养基，每组设置3个复孔；Transewll小室放入细胞培养箱内继续培养24h。

[0126] 3、染色

[0127] 取出Transwell用PBS洗2遍，使用多聚甲醛进行固定，加入结晶紫染色，室温染色20min，用PBS漂洗2遍，放入荧光显微镜下观察并计数。

[0128] 4、结果

[0129] Transwell实验结果显示，转染siRNA-1组的迁移(图4A)、侵袭(图4B)细胞数显著降低，说明细胞的迁移、侵袭能力较对照组受到明显的抑制(P<0.05)，LINC01992与乳腺癌细胞的迁移、侵袭有关。

[0130] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。