基于草地贪夜蛾全基因组序列开发的SSR引物组及其应用

摘要

本发明公开了一种基于草地贪夜蛾全基因组序列开发的SSR引物组及其应用。该SSR引物组包括424对引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～848所示。本发明还提供了一种基于草地贪夜蛾全基因组序列开发的SSR核心引物组，包括30对核心引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.789～848所示。本发明中的SSR引物对草地贪夜蛾全基因组覆盖，分布均匀、多态性丰富、扩增稳定、扩增条带易于鉴定，结合接头荧光标记、毛细管电泳分离和激光诱导荧光检测技术实现了草地贪夜蛾田间群体的高通量准确鉴定和筛选，可用草地贪夜蛾指纹图谱数据库构建、区域种群监测、入侵虫源追踪、遗传多样性评价等领域。

权利要求

1.一种基于草地贪夜蛾全基因组序列开发的SSR引物组，其特征在于：该SSR引物组包括424对引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～848所示。

2.一种基于草地贪夜蛾全基因组序列开发的SSR核心引物组，其特征在于：该SSR核心引物组包括30对核心引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.789～848所示。

3.根据权利要求1所述的基于草地贪夜蛾全基因组序列开发的SSR引物组或权利要求2所述的基于草地贪夜蛾全基因组序列开发的SSR核心引物组，其特征在于：在所述SSR引物组或所述SSR核心引物组的每个正向引物的5’末端添加M13通用接头序列，或在每个正向引物的5’末端添加带荧光标记的M13通用接头序列；

所述的M13通用接头序列的核苷酸序列SEQ ID No.849所示。

4.权利要求1所述的基于草地贪夜蛾全基因组序列开发的SSR引物组或权利要求2所述的基于草地贪夜蛾全基因组序列开发的SSR核心引物组在草地贪夜蛾遗传多样性分析，种群鉴定指纹图谱数据库构建，区域种群监测，和/或入侵虫源追踪方面的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，通过如下步骤实现：(1)DNA提取：提取草地贪夜蛾的基因组DNA作为PCR扩增模板；

(2)采用权利要求1所述的SSR引物组或权利要求2所述的SSR核心引物组进行PCR扩增，得到扩增产物；

(3)将扩增产物进行毛细管电泳和激光诱导荧光检测；

(4)根据电泳结果进行草地贪夜蛾遗传多样性分析，种群鉴定指纹图谱数据库构建，区域种群监测，和/或入侵虫源追踪。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

步骤(2)中所述的SSR引物组或SSR核心引物组中在每个正向引物5’末端添加带荧光标记的M13通用接头序列；

所述的M13通用接头序列的核苷酸序列SEQ ID No.849所示；

所述的荧光标记为采用荧光基团HEX和FAM进行标记。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

步骤(3)中所述的进行毛细管电泳和激光诱导荧光检测为在CEQ8000遗传分析系统中进行；

步骤(3)中所述的毛细管电泳分离的条件为：温度50℃；进样2.0KV，30s；电泳4.8KV，时间65min。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

步骤(4)中所述的遗传多样性分析包括等位基因数，多样性指数，多态性信息量，种群间的遗传相似系数和聚类分析。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：

步骤(4)中所述的遗传多样性分析包括采用PowerMarker V3.25计算引物的等位基因数、多样性指数、多态性信息量，利用NTSYS-peversion-2.02c软件计算种群间的遗传相似系数，用GeneAIEx软件计算Nei’s遗传距离，用Phylip软件的UPGMA方法根据Nei’s遗传距离矩阵绘系统发育树。

10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

步骤(1)中所述的DNA提取为采用微量样品基因组DNA提取试剂盒进行提取；

步骤(1)中所述的草地贪夜蛾为草地贪夜蛾的幼虫；

步骤(2)中所述的PCR扩增的体系为25μL扩增体系：5U/μL TaKaRa Taq 0.125μL，10×PCR Buffer Mg2+Plus 2.5μL，各2.5mM的dNTP Mixture 2μL，10μM的上游和下游引物各0.4μL，模板1μL，加ddH2O至25μL；

步骤(2)中所述的PCR扩增的反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性10S，55℃退火

30S，72℃延伸30S，35个循环；72℃延伸5min。

说明书

基于草地贪夜蛾全基因组序列开发的SSR引物组及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及一种基于草地贪夜蛾全基因组序列开发的SSR引物组及其应用。

背景技术

[0002] 草地贪夜蛾是联合国粮农组织全球预警的跨国界迁飞性重大害虫。该虫原发于美洲大陆，2016年传入非洲并爆发成灾。2018年入侵亚洲的印度、越南、缅甸等国家，2019年1月入侵我国云南省，并在全国自南向北迅速扩散，威胁农业生产。草地贪夜蛾作为新入侵的重大害虫，具有适生性广、迁飞能力强、繁殖倍数高、暴食危害重、防控难度等特点[1-3]。捋清草地贪夜蛾入侵的路径，准确掌握该虫发生危害动态规律，形成适合我国虫源的分子指纹数据库，是科学制定草地贪夜蛾防控技术、保障农业生产安全和农产品质量安全的前提基础。

[0003] 不同的草地贪夜蛾群体通常对特定作物具有取食趋性。田间草地贪夜蛾主要分为玉米型(Corn-Strain)和水稻型(Rice-strain)两个亚群体。玉米型主要在玉米、高粱、棉花上发现，而水稻型的取食性相对较为广谱，主要取食水稻、苜蓿、牧草、小米等作物。除了取食偏好外，两个品系的草地贪夜蛾在生理特征、交配行为和性外激素的组成方面有很大的不同。但是，由于两个寄主型形态学和行为方面的相似性，田间难以被区分。分子标记是以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传差异的直接反映。分子标记检测技术具有测试周期短、不受环境影响和季节限制、供选择的标记数量多、可以高通量测试分析等优势。

[0004] 草地贪夜蛾亚群体的分类主要根据田间采集的幼虫寄主范围，结合分子标记的分化进行界定。基于线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因(CO I)的分子标记不仅能够区分玉米型和水稻型两个亚群体的，而且具备鉴别其亚型的能力，是目前最常用的有效分子条形码[5-7]。另外，有研究表明，根据Z染色体上编码磷酸丙糖异构酶(Tpi)基因开发的分子标记，能够更好鉴定到草地贪夜蛾雌性“水稻型”和雄性“玉米型”的杂交型。鉴于目前鉴定到的我国草地贪夜蛾具有“水稻型”细胞质和“玉米型”细胞核的特点，两种标记有机结合虽然能够提高鉴定的准确率，但是仍然无法全面了解草地贪夜蛾的群体多样性、群体遗传结构以及虫源动态。

[0005] 微卫星标记SSR(Simple Sequence Repeats)，是以1～6个核苷酸为单位，呈串联重复的DNA序列，广泛分布于真核生物基因组中。与其他分子标记相比，SSR标记具有共显性、多态性高、重复性好、操作简单等有点。广泛用于生物多样性研究、品系分类、遗传图谱构建、分子标记辅助选择和比较基因组研究等领域[10]。Arias等(2011)基于来自三个地理群体的15个个体，利用焦磷酸测序法开发了192个SSR标记用于美国草地贪夜蛾的群体遗传结构分析。Pavinato等(2013)利用基因组富集的方法，开发了6个SSR标记用于巴西草地贪夜蛾的群体遗传结构分析。Arias等(2019)采用9个SSR标记，对北美的草地贪夜蛾遗传分析表明，该地区草地贪夜蛾经历了虫口的扩张，虽然基因流与氟苯二胺和氟苯脲敏感性之间不存在相关性，但是发现具有较高LC50的群体扩散到其他的地区并保持较高的抗性基因频率[11-13]SSR标记虽然对分析草地贪夜蛾的遗传分布和监测起了很好的作用，但是相比其他物种，现有草地贪夜蛾的SSR标记数量少，对我国草地贪夜蛾种群针对性不高，不能满足当前对该害虫的研究和监测需要。大量开发覆盖全基因组的SSR标记是对草地贪夜蛾开展深入研究和防控的重要工作之一。

[0006] Gouin等[14]公布并分析了来自实验室和田间自然群体的草地贪夜蛾全基因组序列。2019年5月，深圳华大生命科学研究院和云南农业大学共同牵头，联合中国科学院动物研究所、广东省农科院、青岛农业大学等多个单位共同成立研究小组，对入侵中国的草地贪夜蛾进行全基因组测序研究，公布了草地贪夜蛾的高质量染色体水平的基因组。

[0007] 现有的草地贪夜蛾SSR标记数量少，存在覆盖率低的问题，因此，提供一套具有扩增稳定、电泳条带清晰、多态性丰富的优点的SSR标记具有重要意义。

发明内容

[0008] 本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于草地贪夜蛾全基因组序列开发的SSR引物组。这些引物组具有扩增稳定、电泳条带清晰、多态性丰富的优点，克服了原有草地贪夜蛾SSR标记数量少，覆盖率低的问题，可有效用于草地贪夜蛾遗传多样性、种群监测鉴定、DNA指纹图谱构建等研究。

[0009] 本发明的另一目的在于提供所述基于草地贪夜蛾全基因组序列开发的SSR引物组的应用，结合接头荧光标记、毛细管电泳分离和激光诱导荧光检测技术实现了草地贪夜蛾田间群体的高通量准确鉴定和筛选。该方法可用于在草地贪夜蛾遗传多样性和种群鉴定中，具有可靠、迅速的特点，能准确区分草地贪夜蛾种群间差异并实现高通量的群体筛选，最大限度准确地反映草地贪夜蛾不同地理种群间的亲缘关系。

[0010] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于草地贪夜蛾全基因组序列开发的SSR引物组，该SSR引物组包括424对引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～848所示。

[0011] 一种基于草地贪夜蛾全基因组序列开发的SSR核心引物组，该SSR核心引物组包括30对核心引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.789～848所示。

[0012] 本发明可在SSR引物组或SSR核心引物组的每个正向引物的5’末端添加M13通用接头序列，或是在每个正向引物的5’末端添加带荧光标记的M13通用接头序列，从而能够利用带荧光标记的通用型M13引物进行毛细管电泳，实现了简便、可靠及高通量的检测。

[0013] 所述的M13通用接头序列的核苷酸序列如下所示(SEQ  ID No.849)：5’-TGTAAAACGACGGCC AGT-3’。

[0014] 所述的荧光标记为采用荧光基团HEX和FAM进行标记。

[0015] 所述的基于草地贪夜蛾全基因组序列开发的SSR引物组或所述的基于草地贪夜蛾全基因组序列开发的SSR核心引物组在草地贪夜蛾遗传多样性分析，种群鉴定指纹图谱数据库构建，区域种群监测，和/或入侵虫源追踪方面的应用。

[0016] 所述的基于草地贪夜蛾全基因组序列开发的SSR引物组或所述的基于草地贪夜蛾全基因组序列开发的SSR核心引物组在草地贪夜蛾遗传多样性分析，种群鉴定指纹图谱数据库构建、区域种群监测或入侵虫源追踪方面的应用，优选为通过如下步骤实现：

[0017] (1)DNA提取：提取草地贪夜蛾的基因组DNA作为PCR扩增模板；

[0018] (2)采用上述SSR引物组或SSR核心引物组进行PCR扩增，得到扩增产物；

[0019] (3)将扩增产物进行毛细管电泳和激光诱导荧光检测；

[0020] (4)根据电泳结果进行草地贪夜蛾遗传多样性分析，种群鉴定指纹图谱数据库构建，区域种群监测，和/或入侵虫源追踪。

[0021] 步骤(1)中所述的DNA提取优选为采用微量样品基因组DNA提取试剂盒进行提取。

[0022] 步骤(1)中所述的草地贪夜蛾优选为草地贪夜蛾的幼虫：小于3龄的幼虫整头虫提取，大于等于3龄的幼虫取头胸部提取。

[0023] 步骤(1)中所述的基因组DNA的浓度优选为10ng/μL。

[0024] 步骤(2)中所述的SSR引物组或SSR核心引物组中在每个正向引物5’末端添加了带荧光标记的M13通用接头序列。

[0025] 所述的M13通用接头序列的核苷酸序列如下所示(SEQ  ID No.849)：5’-TGTAAAACGACGGCC AGT-3’。

[0026] 所述的荧光标记为采用荧光基团HEX(5-六氯荧光素氨基磷酸酯)和FAM(羧基荧光素)进行标记。

[0027] 步骤(2)中所述的PCR扩增的体系为25μL扩增体系：TaKaRa Taq(5U/μL)0.125μL,2+
10×PCR Buffer(Mg Plus)2.5μL,dNTP Mixture(各2.5mM)2μL，上游和下游引物(10μM)各
0.4μL，模板1μL，加ddH2O至25μL。

[0028] 步骤(2)中所述的PCR扩增的反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性10S，55℃退火30S，72℃延伸30S，35个循环；72℃延伸5min。

[0029] 步骤(3)中所述的进行毛细管电泳和激光诱导荧光检测为在CEQ8000遗传分析系统(Beckman Coulter,USA)中进行。

[0030] 步骤(3)中所述的毛细管电泳分离的条件优选为：温度50℃；进样2.0KV，30s；电泳4.8KV，时间65min。

[0031] 步骤(4)中所述的遗传多样性分析包括等位基因数(Na)，多样性指数(He)，多态性信息量(PIC)，种群间的遗传相似系数和聚类分析等；优选为采用PowerMarker V3.25计算引物的等位基因数(Na)、多样性指数(He)、多态性信息量(PIC)，利用NTSYS-peversion-2.02c软件计算种群间的遗传相似系数，用GeneAIEx软件计算Nei’s遗传距离，用Phylip软件的UPGMA方法根据Nei’s遗传距离矩阵绘系统发育树。

[0032] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

[0033] 1、本发明的424对SSR引物对草地贪夜蛾全基因组覆盖，分布均匀、多态性丰富、扩增稳定、扩增条带易于鉴定，结合接头荧光标记、毛细管电泳分离和激光诱导荧光检测技术实现了草地贪夜蛾田间群体的高通量准确鉴定和筛选，可用草地贪夜蛾指纹图谱数据库构建、区域种群监测、入侵虫源追踪、遗传多样性评价等领域，为草地贪夜蛾的早期预警预报，合理的防控方案制定提供依据。

[0034] 2、本发明通过PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳确定其扩增带型清晰、多态性高、重复稳定性好后，在引物中在每个正向引物5’末端添加了M13序列，利用带荧光标记的通用型M13引物进行毛细管电泳，实现了简便、可靠及高通量的检测。

附图说明

[0035] 图1是草地贪夜蛾全基因SSR序列分布的特征图；其中，A为6638个SSR序列分布特征图；B为424个SSR序列分布特征图。

[0036] 图2是为2对引物(SF01AF+SF01AR和SF02AF+SF02AR)在5份草地贪夜蛾样品中检测到的多态性。

[0037] 图3是UPGMA聚类分析结果图(图中的数字表示Nei’s标准遗传距离)。

[0038] 图4是基于SSR标记的主坐标分析PCoA图(图中：区域1为湖南张家界个体为主；区域2为广东省个体为主；区域3为广西南宁个体为主)。

具体实施方式

[0039] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。

[0040] 实施例1：覆盖草地贪夜蛾全基因组的SSR序列的鉴定和标记设计

[0041] 1.草地贪夜蛾全基因组序列的获取

[0042] 从https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term＝Spodoptera+frugiperda+(NCBI)下载草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda Sf9,GCA_002213285.1)序列。利用MISA(MIcroSAtellite identification tool,http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)软件，设置参数为：3～20核苷酸，重复次数≥6次，复合SSR的两个SSR间的最大距离100bp。对下载的草地贪夜蛾基因组的fasta序列进行SSR位点搜索。输出以SSR为中心，侧翼各200-bp的序列用于设计引物。

[0043] 2.草地贪夜蛾全基因组SSR引物设计

[0044] 根据下载的SSR序列，利用Primer3(v.0.4.0)软件设计引物。设置参数：Product size range:100～300bp；Numbers to return:3；Max 3’stability:2kcal/mol；Max mispriming:8；Primer Tm:50～65bp；Maximum Tm difference:5℃。在上述参数下，共获得分布于2396个Scaffold的6638个SSR标记，平均每个Scaffold具有2.7个SSR标记，49.42％为4-bp的重复，32.21％为3-bp的重复，15.64％为7-bp的重复，1.79％为5-bp的重复，0.62％为6-bp的重复，0.32％为大于或等于8-bp的重复。进一步筛选每个scaffold中最大的SSR，得到1379个SSR标记。去除重复的标记序列之后，最终得到424个覆盖草地贪夜蛾全基因组的SSR标记，49.06％为4-bp的重复，37.74％为3-bp的重复，5.19％为5-bp的重复，6-bp和大于或等于8-bp的重复均为3.54％，0.94％为7-bp的重复。424对引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～848所示。该424个SSR由广州天一辉远生物科技有限公司合成(图1)。

[0045] 实施例2：草地贪夜蛾SSR标记多态性和稳定性的鉴定

[0046] 1、草地贪夜蛾基因组DNA的提取

[0047] (1)材料：从2019年5-6月，采集广东、湖南、广西、云南、贵州等5省10个地点的草地贪夜蛾幼虫(见表1)，用于引物的评价和遗传多样性分析。

[0048] 表1本发明中用于草地贪夜蛾遗传多样性分析的材料信息

[0049]

[0050] (2)CTAB法提取基因组DNA

[0051] 1)样品处理：采用微量样品基因组DNA提取试剂盒(DP316，天根，中国)提取DNA。小于3龄的幼虫整头虫提取，大于等于3龄的幼虫取头胸部提取；虫体放入含有1.5mL DNA抽提液的2ml离心管内，立即加入180μl缓冲液GA，加入钢珠，放入样品研磨机(Bullet美国)振荡处理；

[0052] 2)加入20μl Proteinase K溶液，涡旋混匀10sec；

[0053] 3)在56℃孵育直到样本充分降解消化，需要时间大约30min到1h，期间每15min需要涡旋混匀；

[0054] 4)加入200μl的缓冲液GB和1μl Carrier RNA储存液，浓度为1μg/μl(Carrier RNA储存液)，充分颠倒混匀，70℃放置10min，期间每3min涡旋混匀10sec，溶液应变清亮，短暂离心以去除管盖内壁的液滴；

[0055] 5)加入200μl的乙醇(96～100％，v/v)。如果室温超过25℃，请将乙醇置冰上预冷。轻轻颠倒混匀样品，室温放置5min，简短离心以去除管盖内壁的液滴；

[0056] 6)取上一步所得溶液全部转入吸附柱CR2中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中；

[0057] 7)向吸附柱CR2中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中；

[0058] 8)向吸附柱CR2中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃废液，将吸附柱CR2放回收集管中；

[0059] 9)重复操作步骤8；

[0060] 10)12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR2置于室温放置2′5min，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

[0061] 11)将吸附柱CR2转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20～50μl洗脱缓冲液TB，室温放置2～5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中；

[0062] 12)DNA使用NanoDrop分光光度计(2000，赛默飞世尔)测定浓度，稀释到10ng/μL的浓度后，用作PCR扩增模板。

[0063] 2、草地贪夜蛾基因组SSR引物的扩增与筛选

[0064] 选择广州花都(GZHD)采集的5个样品，用于检测草地贪夜蛾基因组SSR标记的扩增情况及多态性。采用实施例1中合成的424对引物，分别以5份样品的基因组DNA进行扩增，根据扩增的结果，确定可稳定扩增、带型清晰且多态性丰富的引物对。具体过程如下：

[0065] (1)PCR扩增

[0066] PCR体系包括TaKaRa Taq(5U/μL)0.125μL,10×PCR Buffer(Mg2+Plus)2.5μL,dNTP Mixture(各2.5mM)2μL，上游和下游引物(10μM)各0.4μL，模板1μL，加ddH2O至25μL；

[0067] PCR反应程序为94℃预变性2min；94℃变性10S，55℃退火30S，72℃延伸30S，35个循环；72℃延伸5min。

[0068] (2)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

[0069] 1)清洗玻璃板：用自来水沾上洗涤灵把玻璃板反复擦洗干净，用双蒸水擦洗两遍，再用95％酒精擦洗两遍，干燥；在长板和凹槽上涂上0.5ml琼脂糖凝胶0.5％(v/v)。操作过程中防止两块玻璃板相互污染；

[0070] 2)制备变性胶：按照常规成份配制变性聚丙烯酰胺凝胶。

[0071] 3)灌胶：灌胶过程中防止出现气泡，待胶流到下部，在上部轻轻的插上梳子，使其聚合至少1小时以上；

[0072] 4)预电泳：1×TBE缓冲液600ml加入正极槽(底槽)中，600ml预热至65℃，加入负极槽(上槽)，拔出梳子，90W恒功率预电泳10～20分钟(视室温情况而定)；

[0073] 5)变性：20ul PCR样品加上6X Loading buffer，混匀后，在PCR仪上运行变性程序：95℃变性5分钟，4℃冷却10分钟；

[0074] 6)电泳：用移液器吹吸加样槽，清除气泡，插入样品梳子，每个加样孔点入5ul样品；80W恒功率电泳至Loading buffer带(二甲苯青)至胶板的另一前沿(约40分钟)；电泳结束后，小心分开两块玻璃板，胶会紧贴在涂Binding silane的玻璃板上；

[0075] 7)银染：采用王凤格等(2004)的快速银染法；

[0076] 8)固定：10％(v/v)冰醋酸固定液，轻轻晃动3分钟；

[0077] 9)漂洗：用双蒸水快速漂洗一次，不超过10秒；

[0078] 10)染色：0.2％(w/v)的硝酸银溶液中染色5min；

[0079] 11)漂洗：双蒸水快速漂洗，时间不超过10秒；

[0080] 12)显影：3％(w/v)NaOH+0.5％(v/v)甲醛显影，轻轻晃动至带纹出现；

[0081] 13)定影：10％(v/v)冰醋酸溶液中定影5分钟。(v/v是指体积比)

[0082] 3、424对引物对5头草地贪夜蛾样品(SF7#，SF8#，SF9#，SF10#和SF11#)的筛选显示，所设计的424对引物均能在草地贪夜蛾基因组DNA中有效扩增。其中60％的引物对能够扩增出2个以上的等位基因，20％的引物能够扩增出3个以上等位基因，10％的引物扩增出的条带显示出丰富的多态性(图2，以引物SF01AF+SF01AR(SEQ ID No.1～2)和SF02AF+SF02AR(SEQ ID No.3～4)为例。说明根据草地贪夜蛾全基因组开发的SSR标记是有效的。从424对引物中优选了30对能够扩增出3个以上等位引物的引物作为核心引物(SEQ ID No.789～848)，用于草地贪夜蛾的种群遗传多样性分析。

[0083] 实施例3：草地贪夜蛾SSR标记在种群遗传多样性分析的应用

[0084] 1、毛细管电泳

[0085] 根据实施例2步骤2的筛选结果，在30对核心引物(SEQ ID No.789～848)对应的正向引物5’端添加M13通用接头序列(5’-TGTAAAACGACGGCC AGT-3’)，并合成带两种带荧光基团(HEX和FAM)的M13接头引物(5’-TGTAAAACGACGGCC AGT-3’)(均由广州天一辉远生物科技有限公司)，对实施例2步骤1的42份样品(表1)进行毛细管电泳分离和激光诱导荧光检测。

[0086] PCR产物在CEQ8000遗传分析系统(Beckman Coulter,USA)上进行SSR多态性分析。该系统采用荧光标记、毛细管电泳分离和激光诱导荧光检测技术。将上述步骤2中的PCR产物稀释15倍，吸取稀释后的PCR产物0.5μl作为分析样本加入样品板，每孔加入15μl的SLS(上样缓冲液，甲酰胺)和0.15μl分子量内标-400(internal standard 400)。样品板样品孔内加入半滴矿物油以防止在CEQ8000上运行反应物蒸发，缓冲液板中对应孔内加入3/4体积的电泳缓冲液(Beckman Coulter,USA))。选择HUM-STR方法(毛细管温度50℃；进样2.0KV，
30s；电泳4.8KV，65min)进行电泳分析。

[0087] 通过检测荧光标记，所得数据被自动收集，利用CEQ片段分析软件(Beckman Coulter，USA)自动统计分析数据，并将有效峰转化为“0、1”原始距阵。每个SSR位点的多态性信息量(Polymorphic Information Content，简称PIC)按Senior MS等提供的公式计算，即PIC＝1-∑fi2，其中fi为i位点的基因频率。用GeneAIEx软件计算Nei’s遗传距离，使用Phylip软件的UPGMA方法根据Nei’s遗传距离矩阵绘系统发育树。

[0088] 分析结果显示，被检测的群体两两之间的遗传相似度(I)范围为0.670～0.895之间，均大于0.6，表明各种群之间遗传相似性较高。Nei’s标准遗传距离(D)分析表明，广东东莞群体和广西南宁群体之间的遗传距离最大为0.400，广东花都群体和湖南张家界群体之间的遗传距离最小为0.111。其中，广东花都群体与其他地理群体的遗传距离范围为0.111～0.185之间，均相对低于其他各群体间遗传距离(表2)。UPGMA聚类分析显示5个群体聚合成为一个大的分支，广东花都群体与湖南张家界群体形成一个最近的分支(图3)。

[0089] PCoA分析表明，5个群体在二维平面上主要分为3个区域(图4)。第一个区域以湖南张家界群体为主，第2个区域以广东省的3个地区群体为主，混杂了湖南和广西的个体，第3个区域为广西南宁群体的3个特殊个体(SF039，SF034和SF05)。从PCoA分析图可以看出，总体而言，湖南张家界群体和广西南宁群体含有的特异遗传个体较多，且后者的分布区域较为分散。

[0090] 表2草地贪夜蛾不同地理种群的Nei’s遗传距离(D)和遗传相似度(I)

[0091]

[0092] 注：表中***对角线以上为遗传相似度(I)，对角线以下为Nei’s标准遗传距离(D)[0093] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

[0094] 参考文献

[0095] [1]Todd E L,Poole R W.Keys and Illustrations for the Armyworm Moths of the Noctuid Genus Spodoptera Guenee from the Western Hemisphere[J].Annals of the Entomological Society of America.1980,73(6):722-738.

[0096] [2]联合国粮食及农业组织.秋粘虫[Z].2018.http://www.fao.org/fall-armyworm/zh/.

[0097] [3]Uzayisenga B,Waweru B,Kajuga J,et al.First Record of the Fall Armyworm,Spodoptera frugiperda(Lepidoptera:Noctuidae),in Rwanda[J].African Entomology.2018,26(1):244-246.

[0098] [4]魏启文.草地贪夜蛾入侵中国21个省份，如何快速监测识别仍是防控痛点[Z].2019.

[0099] [5]Hajibabaei M,Janzen D H,Burns J M,et al.DNA barcodes distinguish species of tropical Lepidoptera[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.2006,103(4):968-971.

[0100] [6]Nagoshi R N,Goergen G,Tounou K A,et al.Analysis of strain distribution,migratory potential,and invasion history of fall armyworm populations in northern Sub-Saharan Africa:[J].Sci Rep.2018,8(1):3710.[0101] [7]张磊，靳明辉，张丹丹，等.入侵云南草地贪夜蛾的分子鉴定[J].植物保护.2019,45(02):19-24.

[0102] [8]陈冬平,陈志廷,徐汉虹等.不同分子标记对入侵广州草地贪夜蛾的寄主型鉴别能力比较[J/OL].华南农业大学：1-5[2019-07-28].http://kns.cnki.net/kcms/detail/44.1110.S.20190617.1027.002.html.

[0103] [9]徐丽娜,胡本进,苏贤岩等.入侵安徽省草地贪夜蛾的遗传分析[J/OL].植物保护:1-9[2019-07-28].https://doi.org/10.16688/j.zwbh.2019348.

[0104] [10]Ellegren H.Microsatellites:simple sequences with complex evolution[J].Nature Reviews Genetics.2004,5(6):435-445.

[0105] [11]Arias R S,Blanco C A,Portilla M,et al.First Microsatellites From Spodoptera frugiperda(Lepidoptera:Noctuidae)and Their Potential Use for Population Genetics[J].Annals of the Entomological Society of America.2011,104(3):576-587.

[0106] [12]Pavinato V A C,Martinelli S,de Lima P F,et al.Methodology Microsatellite markers for genetic studies of the fall armyworm,Spodoptera frugiperda[J].Genetics&Molecular Research.2013,12(1):370-380.

[0107] [13]Arias O C E C.Population genetic structure and demographic history of Spodoptera frugiperda(Lepidoptera:Noctuidae):implications for insect resistance management programs.[2019-03-13].https://doi.org/10.1002/ps.5407.

[0108] [14]Gouin A,Bretaudeau A,Nam K,Gimenez S,Aury JM,Duvic B,Hilliou F,Durand N,Montagne N,Darboux I et al.Two genomes of highly polyphagous lepidopteran pests(Spodoptera frugiperda,Noctuidae)with different host-plant ranges.Sci Rep 2017,7(1):11816.