阿氏芽孢杆菌、其代谢产物及其应用

摘要

本发明公开了一株阿氏芽孢杆菌、其代谢产物及其应用，旨在解决现有技术中植物枯萎病防治不尽如人意的技术问题。本发明阿氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai CGMCC NO.18285能够有效抑制小孢根霉，可以用来防治和治疗由小孢根霉引起的植物病害，从而达到避免或减少农药施用的目的，确保农业可持续性发展，具有广阔的应用前景；本发明阿氏芽孢杆菌CGMCC NO.18285能够代谢分泌大量的挥发性物质5‑甲基‑2‑己酮，本发明首次研究发现5‑甲基‑2‑己酮具有良好的抑制小孢根霉的作用。

权利要求

1.一株阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai），其保藏编号为CGMCC NO. 18285。

2.一种植物枯萎病生防制剂，含阿氏芽孢杆菌CGMCC NO. 18285、其液体发酵物中的至少一种。

3.权利要求2所述植物枯萎病生防制剂的制备方法，包括如下步骤：将阿氏芽孢杆菌CGMCC NO. 18285在固体培养基上划线，30～32℃、避光培养70～72h，挑取单菌落接种到液体培养基中，30～32℃、150～180r/min、避光培养70～72h，得液体发酵物，再按常规步骤制得生防制剂。

4.权利要求1所述阿氏芽孢杆菌CGMCC NO. 18285在防治植物枯萎病中的应用。

5.权利要求1所述阿氏芽孢杆菌CGMCC NO. 18285在制备5‑甲基‑2‑己酮中的应用。

说明书

阿氏芽孢杆菌、其代谢产物及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物防治技术领域，具体涉及阿氏芽孢杆菌、其代谢产物及其应用。

背景技术

[0002] 水稻是我国主要粮食作物，占全国粮食产量的60%，保证水稻产量安全对我国农业生产有着重要的意义。而由根霉引起的水稻幼苗枯萎病是亚洲广泛存在的一种植物病害，
该病害严重威胁着作物产量。因此解决该病害对于保障我国粮食产量安全有着极其重要的
意义。

[0003] 目前，对枯萎病的防治方法主要是采用化学农药防治、农业轮作防治以及利用抗病品种等多种方法来防治和控制枯萎病。

[0004] 化学防治具有高效、速效的优势，是采用控制植物枯萎病的常用防治方法。但是，许多化学农药容易诱导非靶标生物产生抗性、潜在毒性，具有高毒性，残留量高，对食品安
全、环境污染、臭氧层有较大的隐患。

[0005] 农业防治是通过轮作的方法改良土壤环境以减少病原菌、靠增施有机肥料，提高土壤肥力、靠通过施加碱性肥料，调节土壤pH值等方法防治。但受限于有限的种植面积和温
室建设的高成本投资，农户受环境和经济利益的影响，很难接受土地空闲，或者与经济价值
和收益不高的作物相轮作，因此靠农业防治枯萎病尚未很好地实施。

[0006] 抗性品种的栽种理论上认为是防治枯萎病病害比较有效而且可广泛使用的防治措施，然而当前在实际的农业生产中有效的抗性品种资源也极其有限，远不能满足农业生
产之需要。

[0007] 而生物农药以其高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性和原料易得等特性被人们认为是未来化学农药的理想替代药剂。因此，利用生物农药防治作物枯萎病的前景
客观上是可期的。

[0008] 因此，当前亟需筛选研发新的抑制病原菌的微生物，用于植物病害防治，以减少农药使用，促进农业可持续发展。

发明内容

[0009] 本发明要解决的技术问题是提供一株抑制根霉生长的阿氏芽孢杆菌、其代谢产物及其应用，以期解决现有技术中植物枯萎病防治（如在环境友好性、防治效果等方面）不尽
如人意的技术问题。

[0010] 为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

[0011] 研究筛选出了一株能够有效抑制根霉生长的阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）EZ‑62，该菌株保藏于2019年7月23日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会
普通微生物中心（CGMCC），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌株保藏编号为CGMCC 
NO. 18285。

[0012] 利用上述阿氏芽孢杆菌CGMCC NO. 18285、其代谢产物或其液体发酵物能够进一步制备得到植物枯萎病生防制剂；并且研究发现该菌株能够分泌大量的抑菌活性物质，如
5‑甲基‑2‑己酮（5‑methyl‑2‑Hexanone）等。

[0013] 利用如下方法可制备得到一种植物枯萎病生防制剂：

[0014] 将阿氏芽孢杆菌CGMCC NO.18285在固体培养基上划线，30～32℃、避光培养70～72h，挑取单菌落接种到液体培养基中，30～32℃、150～180r/min、避光培养70～72h，再按
常规步骤制得生防制剂。

[0015] 将阿氏芽孢杆菌CGMCC NO.18285在防治植物枯萎病中应用。

[0016] 利用阿氏芽孢杆菌CGMCC NO.18285制备抑菌活性物质5‑甲基‑2‑己酮（5‑methyl‑2‑Hexanone）。

[0017] 与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：

[0018] 1.本发明阿氏芽孢杆菌CGMCC NO.18285能够有效抑制小孢根霉，可以用来防治和治疗由小孢根霉类引起的植物病害，从而达到避免或减少农药施用的目的，确保农业健康
可持续性发展，具有广阔的应用前景。

[0019] 2.本发明阿氏芽孢杆菌CGMCC NO.18285能够代谢分泌大量的挥发性物质，如5‑methyl‑2‑Hexanone（5‑甲基‑2‑己酮）等；本发明首次研究发现5‑甲基‑2‑己酮类物质具有
良好的抑制小孢根霉的作用效果。

附图说明

[0020] 图1为24h时阿氏芽孢杆菌抑制小孢根霉的效果对比照片。

[0021] 图2为48h时阿氏芽孢杆菌抑制小孢根霉的效果对比照片。

[0022] 图3为本发明阿氏芽孢杆菌产挥发性有机化合物的色谱图。

[0023] 图4为不同菌株培养相同时间释放5‑methyl‑2‑Hexanone的色谱峰面积对比图，其中，62为本发明阿氏芽孢杆菌，2‑18为短小芽孢杆菌，2‑60为马阔里类芽孢杆菌，这两个菌
株均由王恩召在中国农业科学院温室的健康水稻盆栽筛选所得。

[0024] 图5为纯品5‑methyl‑2‑Hexanone抑制小孢根霉的效果对比照片，其中，试验组滴加纯品5‑methyl‑2‑Hexanone，对照组滴加灭菌水。

具体实施方式

[0025] 下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

[0026] 在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂或产品如无特别说明，均为市售常规试剂或产品；所涉及的试验方法，如无特别说明，
均为常规方法。

[0027] 实施例1：生防菌株的筛选和鉴定

[0028] （1）筛选

[0029] 于2018年12月在中国农业科学院温室由王恩召采集盆栽实验中健康水稻根际土壤，即从水稻去掉根部表面约5cm的覆土，按S形，随机采集水稻根系结合的松散土体。

[0030] 对照组为无菌水，试验组为梯度稀释的土壤样品悬液。

[0031] 试验组的具体操作方法为：

[0032] 利用梯度稀释涂布法将逐级稀释的土壤样品的悬液涂布到牛肉膏蛋白胨平板上，挑取单菌落到液体牛肉膏蛋白胨培养基中获得菌液，取各菌液均匀涂布在牛肉膏蛋白胨培
养基上培养24 h，将接菌的平板对扣在中心接种10 uL小孢根霉菌液（小孢根霉由土壤与植
物互作团队成员刘雄舵于2018年12月在中国农业科学院温室盆栽实验健康水稻根际土壤
中分离所得）的PDA平板上培养，32℃、黑暗条件下培养48 h，分别在24 h、48 h统计抑菌率，
筛选具有抑菌效果的菌株。

[0033] 上述培养基的原料配方为：

[0034] 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，琼脂18 g，去离子水1 L，pH 7.2～7.4；

[0035] 液体牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，去离子水1 L，pH 7.2～7.4；

[0036] PDA培养基：土豆200 g，葡萄糖20 g，自来水1 L，pH自然。

[0037] 抑菌率=(空白培养基对扣的小孢根霉菌落尺寸‑该菌对扣的小孢根霉菌落尺寸)/空白培养基对扣的小孢根霉菌落尺寸*100%

[0038] 如图1和图2所示：

[0039] 筛选到一株菌株（命名为EZ‑62），在24 h、48 h对小孢根霉的抑菌率分别达到29.375%和23.125%。

[0040] （2）鉴定

[0041] a. 按革兰氏染色的方法对筛选出的菌株进行染色，显示该菌株为阳性菌。

[0042] b. 在LB固体培养基上培养筛选出的菌株，参照《常见细菌系统鉴定手册》观察其菌落特征和颜色等生理生化特点，显示：

[0043] 该菌呈乳白色，在平板上凸起生长，边缘整齐，菌体湿润光滑。

[0044] c. 采用细菌通用引物GM3F、GE4F进行PCR扩增，扩增出1200 bp的产物，测序，通过BLAST对测序结果进行序列比对，与GenBank中的序列进行同源性比较，结果显示与阿氏芽
孢杆菌（Bacillus aryabhattai）存在99 %的同源性。

[0045] 综合染色、生理生化特点和16s rDNA比对结果，该菌株为阿氏芽孢杆菌，于2019年7月23日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心（CGMCC），其保藏编号为
CGMCC NO. 18285。

[0046] 实施例2：阿氏芽孢杆菌抑菌代谢产物的鉴定

[0047] 挥发性有机物是以碳为基本元素的固体或液体，能够在20℃和0.01 kPa环境下快速地挥发，进入气相状态。基于本发明人前期长期积累的研究经验，研究证实了此类微生物
能产生大量种类丰富、功能多样的挥发性有机化合物，这些物质主要作用有：作为群落间和
群落内的信号物质；细胞与细胞间的信号物质；可能的碳释放通道；生长促进和生长抑制因
子。若作为抑制因子起作用，互相作用中被抑制的是植物病原微生物，那么释放挥发性有机
化合物的微生物就具有应用于植物病害生物防治的潜力。

[0048] （1）挥发性有机物的收集

[0049] 取5 mL牛肉膏蛋白胨培养基于20 mL顶空瓶中，加入0.1 g琼脂，用牛皮纸封上瓶口，121℃、30 min灭菌，灭菌完将瓶子倾斜30°角冷却凝固，取100uL预先准备好的菌液加入
瓶中，摇晃瓶体使菌液均匀分布在培养基斜面上，盖上牛皮纸，黑暗条件、30℃恒温培养
48h，去掉牛皮纸，用带有聚四氟乙烯隔垫的中空螺旋盖封口，同时设置只加培养基、不接菌
的顶空瓶作为空白对照，每个处理四个重复。

[0050] 培养5 d之后，采用 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取纤维（购于 Supelco 公司）进行萃取，萃取头装配SPME手动萃取手柄上（Supelco，Bellefonte，PA，USA），在使用前先进行
老化，老化按厂家说明书进行，之后在30℃恒温条件下萃取12 h。

[0051] （2）挥发性有机物的分析

[0052] 萃取完成后立即采用7890A‑5975C气相色谱‑质谱分析仪（Agilent Technologies，USA）进行检测分析。

[0053] 色谱条件：进样口温度250℃，进样时间2.7 min；不分流模式，载气为99.999%的高纯氦气，柱流速为1 mL/min；

[0054] 柱箱升温程序：初始温度50℃，保持2 min，以8 ℃/min的速度升温至180℃，再以10℃/min的速度升温至240℃，保持6 min。

[0055] 质谱条件：离子化方式为EI，70eV；离子源温度为230℃，四级杆温度150℃，传输线温度250℃；扫描模式为全扫描，扫描范围35～450 amu。

[0056] 测得的mVOCs质谱在NIST/EPA/NIH数据库中进行比对鉴定，该菌能产生多种挥发性有机化合物，其中5‑甲基‑2‑己酮（5‑methyl‑2‑Hexanone）的释放量相对比较多，如图3所
示。

[0057] 本发明此次试验研究共检测了9株阿氏芽孢杆菌株的VOCs，其中有3株代谢产生5‑甲基‑2‑己酮，其中本发明阿氏芽孢杆菌CGMCC NO.18285（EZ‑62）的释放量远高于其它两个
菌株，如图4所示。

[0058] （3）部分抑菌活性物质抑菌效果鉴定

[0059] 在PDA培养基中加入一个灭过菌的2 ml离心管盖子，盖子里加入100uL的5‑甲基‑2‑己酮（5‑methyl‑2‑Hexanone）为试验组，对照组盖子里加入100 uL灭菌水，培养基中央加
入10 uL小孢根霉菌液，32℃、黑暗条件下培养，观察小孢根霉生长状况，结果如图5所示。

[0060] 结果表明，阿氏芽孢杆菌CGMCC NO.18285能有效抑制小孢根霉的生长，并且能产生多种挥发性有机化合物，其中本发明首次研究发现5‑methyl‑2‑Hexanone(5‑甲基‑2‑己
酮)对小孢根霉致死。

[0061] 上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明；但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体成分或参
数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。