一种芪葛颗粒成分检测方法及其指纹图谱构建方法

摘要

本发明涉及分析化学技术领域，特别涉及一种芪葛颗粒成分检测方法及其指纹图谱构建方法。该检测方法包括：取芪葛颗粒供试品和标准品进行HPLC检测，HPLC检测的色谱条件为：采用C18色谱柱，以含有缓冲溶液的水相为流动相A、乙腈为流动相B，梯度洗脱；根据HPLC检测结果，获得芪葛颗粒成分及其含量。本发明检测方法测得的图谱能较全面的反映芪葛颗粒中的化学成分，且各色谱峰分离较好，基线平稳，峰型好，重复性较好，该方法具有良好的线性关系、精密度、稳定性、回收率，能够准确检测芪葛颗粒的成分含量，获得的对照指纹图谱能够客观评估样品的质量。

权利要求

1.一种芪葛颗粒检测方法，芪葛颗粒由黄芪、葛根、白芍、川芎、桂枝、姜黄、威灵仙和菊花八味药组成；其特征在于，包括如下步骤：取芪葛颗粒供试品和对照品进行HPLC检测，所述HPLC检测的色谱条件为：采用C18色谱柱，以0.2％甲酸为流动相A、乙腈为流动相B，梯度洗脱程序为：0～35min，5％～12％B；35～50min，12％～30％B；50～55min，30％～75％B；55～

60min，75％B；流速为1.0mL/min；柱温为30℃；进样量10μL；双波长检测，检测波长分别为

250nm、325nm；

根据HPLC检测结果，获得芪葛颗粒的成分信息，或成分及其含量信息。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述C18色谱柱为Kramosil C18色谱柱、Agilent Zorbax SB‑C18色谱柱、Phenomenex Gemini C18色谱柱、Thermo syncronis C18色谱柱、Agilent 5TC‑C18色谱柱、Kromasil 100‑5C18色谱柱、Waters symmetry C18色谱柱或Phenomenex Luna C18色谱柱。

3.一种芪葛颗粒检测方法，芪葛颗粒由黄芪、葛根、白芍、川芎、桂枝、姜黄、威灵仙和菊花八味药组成；其特征在于，包括如下步骤：取芪葛颗粒供试品和对照品进行HPLC检测，所述HPLC检测的色谱条件为：采用C18色谱柱，以0.2％甲酸为流动相A、乙腈为流动相B，梯度洗脱程序为：0～12min，5％～10％B；12～20min，10％～14％B；20～30min，14％～20％B；30～

40min，20％～30％B，40～46min，30％～48％B，46～47min，48％～70％B，47～55min，70％～90％B，55～70min，90％B；流速为1.0mL/min；柱温为30℃；进样量10μL；双波长检测，检测波长分别为250nm、325nm；

根据HPLC检测结果，获得芪葛颗粒的成分信息，或成分及其含量信息。

4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述C18色谱柱为Kramosil C18色谱柱、Agilent Zorbax SB‑C18色谱柱、Phenomenex Gemini C18色谱柱、Thermo syncronis C18色谱柱、Agilent 5TC‑C18色谱柱、Kromasil 100‑5C18色谱柱、Waters symmetry C18色谱柱或Phenomenex Luna C18色谱柱。

5.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述对照品选自葛根素、大豆苷、芒柄花素、黄芪甲苷、芍药苷、藁本内酯、阿魏酸、绿原酸、1,3‑二咖啡酰基奎宁酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、3'‑羟基葛根素、3'‑甲氧基葛根素、新绿原酸、隐绿原酸、1,5‑二咖啡酰基奎宁酸、葛根素芹糖苷、大豆苷元、染料木苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、芹菜素‑7‑O‑β‑D‑吡喃葡萄苷、金合欢素、洋川芎内酯A、异阿魏酸、木犀草苷、芹菜素或欧当归内酯A中的一种或多种。

6.一种芪葛颗粒指纹图谱构建方法，芪葛颗粒由黄芪、葛根、白芍、川芎、桂枝、姜黄、威灵仙和菊花八味药组成；其特征在于，

供试品溶液的制备：取芪葛颗粒，研细，用甲醇配制20mg/ml的供试品；

对照品溶液的制备：精密称取葛根素、大豆苷、芒柄花素、黄芪甲苷、芍药苷、藁本内酯、阿魏酸、绿原酸、1,3‑二咖啡酰基奎宁酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、3'‑羟基葛根素、3'‑甲氧基葛根素、新绿原酸、隐绿原酸、1,5‑二咖啡酰基奎宁酸、葛根素芹糖苷、大豆苷‑1

元、染料木苷、芍药内酯苷，加入50％甲醇制成含各成分浓度为20～25μg·mL 的单标或混标溶液；

HPLC检测的色谱条件为：采用C18色谱柱，以0.2％甲酸为流动相A、乙腈为流动相B，梯度洗脱程序为：0～35min，5％～12％B；35～50min，12％～30％B；50～55min，30％～75％B；55～60min，75％B；流速为1.0mL/min；柱温为30℃；进样量10μL；双波长检测，检测波长分别为

250nm、325nm；

根据HPLC检测结果，获得芪葛颗粒指纹图谱。

7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述C18色谱柱为Kramosil C18色谱柱、Agilent Zorbax SB‑C18色谱柱、Phenomenex Gemini C18色谱柱、Thermo syncronis C18色谱柱、Agilent 5TC‑C18色谱柱、Kromasil 100‑5C18色谱柱、Waters symmetry C18色谱柱或Phenomenex Luna C18色谱柱。

8.一种芪葛颗粒指纹图谱构建方法，芪葛颗粒由黄芪、葛根、白芍、川芎、桂枝、姜黄、威灵仙和菊花八味药组成；其特征在于，

供试品溶液的制备：取芪葛颗粒，研细，用甲醇配制20mg/ml的供试品；

对照品溶液的制备：精密称取葛根素、大豆苷、芒柄花素、黄芪甲苷、芍药苷、藁本内酯、阿魏酸、绿原酸、1,3‑二咖啡酰基奎宁酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、3'‑羟基葛根素、3'‑甲氧基葛根素、新绿原酸、隐绿原酸、1,5‑二咖啡酰基奎宁酸、葛根素芹糖苷、大豆苷元、染料木苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、芹菜素‑7‑O‑β‑D‑吡喃葡萄苷、金合欢素、洋川芎内酯A、异阿魏酸、木犀草苷、芹菜素和欧当归内酯A，加入50％甲醇制成含各成分浓度为20‑1

～25μg·mL 的单标或混标溶液；

HPLC检测的色谱条件为：采用C18色谱柱，以0.2％甲酸为流动相A、乙腈为流动相B，梯度洗脱程序为：0～12min，5％～10％B；12～20min，10％～14％B；20～30min，14％～20％B；30～40min，20％～30％B，40～46min，30％～48％B，46～47min，48％～70％B，47～55min，

70％～90％B，55～70min，90％B；流速为1.0mL/min；柱温为30℃；进样量10μL；双波长检测，检测波长分别为250nm、325nm；

根据HPLC检测结果，获得芪葛颗粒指纹图谱。

9.如权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述C18色谱柱为Kramosil C18色谱柱、Agilent Zorbax SB‑C18色谱柱、Phenomenex Gemini C18色谱柱、Thermo syncronis C18色谱柱、Agilent 5TC‑C18色谱柱、Kromasil 100‑5C18色谱柱、Waters symmetry C18色谱柱或Phenomenex Luna C18色谱柱。

说明书

一种芪葛颗粒成分检测方法及其指纹图谱构建方法

技术领域

[0001] 本发明涉及分析化学技术领域，特别涉及一种芪葛颗粒成分检测方法及其指纹图谱构建方法。

背景技术

[0002] 芪葛颗粒由黄芪、葛根、白芍、川芎、桂枝、姜黄、威灵仙和菊花八味药组成，具有疏风散热、温经活血、宣痹通络的功效，用于神经根型颈椎病风寒阻络证引起的颈项强痛、肩
背疼痛、颈项活动不利、肢体麻木、畏寒肢冷、四肢拘急。

[0003] 随着我国中药制剂的快速发展，中药制剂的质量管理问题也受到了人们的广泛关注，其质量的优劣会直接影响到医疗质量和患者生命安危。为了更好地对药品质量进行控
制，保证其临床疗效，需建立全面评价该制剂质量的方法。

[0004] 芪葛颗粒为复方制剂，化学成分复杂。中药化学成分解析是中药药效物质阐明及质量控制的关键问题之一，目前针对芪葛颗粒全面的化学成分解析还未见报道，因此提供
一种芪葛颗粒的质量控制方法具有重要的现实意义。

发明内容

[0005] 本发明提供一种芪葛颗粒成分检测方法及其指纹图谱构建方法。该检测方法测得的图谱能较全面的反映芪葛颗粒中的化学成分，且各色谱峰分离较好，基线平稳，峰型好，
重复性较好，该方法具有良好的线性关系、精密度、稳定性、回收率，能够准确检测该颗粒的
成分含量，获得的对照指纹图谱能够客观评估样品的质量。

[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0007] 本发明提供一种芪葛颗粒有效成分检测方法，其特征在于，包括如下步骤：取芪葛颗粒，研细，用甲醇配制20mg/ml的供试品；取芪葛颗粒供试品和对照品进行HPLC检测，所述
HPLC检测的色谱条件为：采用C18色谱柱，以含有缓冲溶液的水相为流动相A、乙腈为流动相
B，梯度洗脱程序为：0～35min，5％～12％B；35～50min，12％～30％B；50～55min，30％～
75％B；55～60min，75％B；流速为0.8～1.5mL/min；柱温为25～40℃；进样量10μL；双波长检
测，检测波长分别为250nm、325nm；根据HPLC检测结果，获得芪葛颗粒的成分信息，或成分及
其含量信息。

[0008] 本发明提供一种芪葛颗粒有效成分检测方法，其特征在于，包括如下步骤：取芪葛颗粒，研细，用甲醇配制20mg/ml的供试品；取芪葛颗粒供试品和对照品进行HPLC检测，所述
HPLC检测的色谱条件为：采用C18色谱柱，以含有缓冲溶液的水相为流动相A、乙腈为流动相
B，所述梯度洗脱程序为：0～12min，5％～10％B；12～20min，10％～14％B；20～30min，14％
～20％B；30～40min，20％～30％B；40～46min，30％～48％B；46～47min，48％～70％B；47
～55min，70％～90％B；55～70min，90％B；柱温为25～40℃；进样量10μL；双波长检测，检测
波长分别为250nm、325nm；根据HPLC检测结果，获得芪葛颗粒的成分信息，或成分及其含量
信息。

[0009] 在本发明一个优选实施方案中，上述检测方法中，所述HPLC检测的流速为1.0mL/min，柱温为30℃；所述甲醇为50％甲醇。

[0010] 在本发明一个优选实施方案中，上述检测方法中，所述缓冲溶液选自弱酸及其盐、弱碱及其盐、多元弱酸及其盐中的一种或多种；优选三氟乙酸、甲酸、甲酸铵、乙酸、乙酸钠、
乙酸铵、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、柠檬酸、柠檬酸钠、甘氨酸、盐酸、邻苯二甲
酸中的一种或多种；更优选0.2％甲酸。

[0011] 在本发明一个优选实施方案中，上述检测方法中，所述C18色谱柱为Kramosil C18色谱柱、Agilent Zorbax SB‑C18色谱柱、Phenomenex Gemini C18色谱柱、Thermo 
syncronis C18色谱柱、Agilent 5TC‑C18色谱柱、Kromasil 100‑5C18色谱柱、Waters 
symmetry C18色谱柱或Phenomenex Luna C18色谱柱。

[0012] 在本发明一个优选实施方案中，上述检测方法中，所述对照品为葛根素、大豆苷、芒柄花素、黄芪甲苷、芍药苷、藁本内酯、阿魏酸、绿原酸、1,3‑二咖啡酰基奎宁酸、异绿原酸
A、异绿原酸B、异绿原酸C、3'‑羟基葛根素、3'‑甲氧基葛根素、新绿原酸、隐绿原酸、1,5‑二
咖啡酰基奎宁酸、葛根素芹糖苷、大豆苷元、染料木苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、芹菜素‑
7‑O‑β‑D‑吡喃葡萄苷、金合欢素、洋川芎内酯A、异阿魏酸、木犀草苷、芹菜素或欧当归内酯A
中的一种或多种。利用上述检测条件建立一种或多种对照品的标准曲线，根据供试品检测
结果计算有效成分的含量。

[0013] 在本发明一个优选实施方案中，建立芪葛颗粒指纹图谱后，按相同的方法测定待测芪葛颗粒样品的指纹图谱，然后将其与上述芪葛颗粒的图谱经国家药典委员会提供的中
药色谱指纹图谱相似度评价系统软件计算比较，相似度不低于0.90。

[0014] 本发明还提供一种芪葛颗粒指纹图谱构建方法，其特征在于，

[0015] 供试品溶液的制备：取芪葛颗粒，研细，用甲醇配制20mg/ml的供试品；

[0016] 对照品溶液的制备：精密称取葛根素、大豆苷、芒柄花素、黄芪甲苷、芍药苷、藁本内酯、阿魏酸、绿原酸、1,3‑二咖啡酰基奎宁酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、3'‑羟基
葛根素、3'‑甲氧基葛根素、新绿原酸、隐绿原酸、1,5‑二咖啡酰基奎宁酸、葛根素芹糖苷、大
豆苷元、染料木苷、芍药内酯苷苯甲酰芍药苷、芹菜素‑7‑O‑β‑D‑吡喃葡萄苷、金合欢素、洋
川芎内酯A、异阿魏酸、木犀草苷、芹菜素和欧当归内酯A，加入50％甲醇制成含各成分浓度
‑1
为20～25μg·mL 的单标或混标溶液。

[0017] HPLC检测的色谱条件为：采用C18色谱柱，以含有缓冲溶液的水相为流动相A、乙腈为流动相B，梯度洗脱程序为：0～35min，5％～12％B；35～50min，12％～30％B；50～55min，
30％～75％B；55～60min，75％B；流速为0.8～1.5mL/min；柱温为25～40℃；进样量10μL；双
波长检测，检测波长分别为250nm、325nm；

[0018] 根据HPLC检测结果，获得芪葛颗粒指纹图谱。

[0019] 优选地，上述梯度洗脱程序也可以替换为：0～12min，5％～10％B；12～20min，10％～14％B；20～30min，14％～20％B；30～40min，20％～30％B；40～46min，30％～48％
B；46～47min，48％～70％B；47～55min，70％～90％B；55～70min，90％B。

[0020] 在本发明一个优选实施方案中，所述HPLC检测的流速为1.0mL/min，柱温为30℃；所述甲醇为50％甲醇；所述流动相为0.2％甲酸水溶液。

[0021] 在本发明一个优选实施方案中，所述流缓冲溶液选自弱酸及其盐、弱碱及其盐、多元弱酸及其盐中的一种或多种；优选三氟乙酸、甲酸、甲酸铵、乙酸、乙酸钠、乙酸铵、磷酸氢
二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、柠檬酸、柠檬酸钠、甘氨酸、盐酸、邻苯二甲酸中的一种或多
种；更优选0.2％甲酸。

[0022] 在本发明一个优选实施方案中，所述C18色谱柱为Kramosil C18色谱柱、Agilent Zorbax SB‑C18色谱柱、Phenomenex Gemini C18色谱柱、Thermo syncronis C18色谱柱、
Agilent 5TC‑C18色谱柱、Kromasil 100‑5C18色谱柱、Waters symmetry C18色谱柱或
Phenomenex Luna C18色谱柱。

[0023] 本发明检测方法测得的图谱能较全面的反映芪葛颗粒中的化学成分，且各色谱峰分离较好，基线平稳，峰型好，重复性较好，该方法具有良好的线性关系、精密度、稳定性、回
收率，能够准确检测芪葛颗粒的成分含量，获得的指纹图谱能够客观评估样品的质量。本发
明至多能检识到82个化合物，能鉴定和推测出78个化合物，包括黄酮及其苷类、皂苷类、有
机酸类、内酯及其二聚体类等，其中29个化合物经对照品验证。该结果为阐明芪葛颗粒的药
效物质基础奠定了基础，并为质量控制提供参考。

附图说明

[0024] 图1是芪葛颗粒样品在1.1检测条件下的正负离子模式的总离子流图(A为负离子模式，B为正离子模式)。

[0025] 图2是不同梯度洗脱的HPLC图。

[0026] 图3是不同柱温的HPLC图。

[0027] 图4是不同流速的HPLC图。

[0028] 图5是芪葛颗粒样品在2.1检测条件下的正负离子模式的总离子流图(A为负离子模式，B为正离子模式)。

具体实施方式

[0029] 本发明公开了一种芪葛颗粒成分检测方法及其指纹图谱构建方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动
对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用
已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对
本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0030] 如无特别说明，本发明提供的芪葛颗粒成分检测方法及其指纹图谱构建方法中所用药品、试剂、仪器均可由市场购得：

[0031] 仪器与试药

[0032] Agilent 1290超高效液相色谱仪，DAD检测器，美国Agilent公司；

[0033] Agilent 6538Q‑TOF质谱仪，美国Agilent公司；

[0034] Mettler Toledo XP6电分析天平，瑞士梅特勒公司；

[0035] Sartorius BSA224S电子分析天平，德国SARTORIUS公司；

[0036] HH数显恒温水浴锅，常州国宇仪器制造有限公司；

[0037] TG16MW台式高速离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；

[0038] Milli‑Q Academic纯水机，美国密理博公司；

[0039] 对照品阿魏酸、异阿魏酸、绿原酸、1，3‑二咖啡酰基奎宁酸、葛根素、大豆苷、木犀草苷、芒柄花素、芹菜素、芍药苷、黄芪甲苷、藁本内酯、欧当归内酯A对照品由中国食品药品
检定研究院提供；新绿原酸、1，5‑二咖啡酰基奎宁酸、3'‑羟基葛根素、3'‑甲氧基葛根素、葛
根素芹糖苷、洋川芎内酯A对照品由成都普菲德生物技术有限公司提供；大豆苷元、染料木
苷对照品由中国药品生物制品鉴定所提供；芍药内酯苷对照品由四川省维克奇生物科技有
限公司提供；芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、隐绿原酸、芹
菜素‑7‑O‑β‑D‑吡喃葡萄苷、金合欢素对照品由成都曼思特生物科技有限公司提供。

[0040] 甲醇、甲酸均为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

[0041] 药品来源：本发明所用芪葛颗粒由江苏康缘药业股份有限公司生产。

[0042] 实施例1

[0043] 1、方法与结果

[0044] 1.1检测条件

[0045] (1)色谱条件Kramosil C18色谱柱(4.6×150mm，3.5μm)，流动相为0.2％甲酸水(A)‑乙腈(B)，梯度洗脱(0～35min，5％～12％B；35～50min，12％～30％B；50～55min，30％
‑1
～75％B；55～60min，75％B)。流速1.0mL·min ，柱温30℃，进样量10μL，双波长检测，检测
波长分别为250nm、325nm。

[0046] (2)质谱条件电喷雾离子源(ESI)，正负离子模式，扫描范围m/z 100～3000；干燥‑1
气温度350℃；干燥气体积流量10L·min ；雾化气压力40psig；毛细管电压4000V；碎片电压
135V；锥孔电压65V；MS/MS分析中的碰撞能根据不同化合物的需要在10～55eV设定。

[0047] 1.2对照品溶液配制

[0048] 分别取葛根素、大豆苷、芒柄花素、黄芪甲苷、芍药苷、藁本内酯、阿魏酸、绿原酸、1,3‑二咖啡酰基奎宁酸、异绿原酸A、异绿原酸C、3'‑羟基葛根素、3'‑甲氧基葛根素、新绿原
酸、隐绿原酸、1,5‑二咖啡酰基奎宁酸、葛根素芹糖苷、大豆苷元、染料木苷、芍药内酯苷和
‑1
异绿原酸B，精密称定，加50％甲醇制成含各成分20～25μg·mL 的单标溶液。

[0049] 1.3供试品溶液制备

[0050] 取本品5袋，研细，取约1g，精密称定，置于平底烧瓶中，精密加入50％甲醇50mL，称‑1
重，加热回流30min，放冷，再次称重，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，12 000r·min  离
心5min，上清液过0.22μm滤膜，取续滤液，即得。

[0051] 1.4化合物的鉴定与解析

[0052] 采用UPLC‑Q‑TQF‑MS，按“1.1”项下条件检测供试品溶液和对照品溶液，并对芪葛颗粒中化学成分进行分析，得到的正负离子模式的总离子流图(TIC)，具体参见说明书附图
1(A为正离子模式；B为负离子模式)。

[0053] 通过各单味药对处方中的各个质谱峰进行归属，结合对照品、一级质谱提供的准分子离子峰及保留时间，二级质谱提供的碎片离子信息及相关文献对目标化合物进行鉴
定，共鉴定出44个化合物，其中，2，3，5，6，7，9，10，12，14，16‑21，23，28，32‑36，38为黄酮及
其苷类化合物；1，4，11，15，24，26，27，30为有机酸类化合物；39‑44为川芎内酯类化合物；8，
13，37为皂苷类化合物，具体结果见表1。

[0054] 表1芪葛颗粒中化合物的RRLC/Q‑TOF/MS/MS分析

[0055]

[0056]

[0057]

[0058]

[0059]

[0060]

[0061] 注:*通过对照品比对确认的成分。

[0062] 按以上条件建立芪葛颗粒图谱后，按相同的方法测定待测芪葛颗粒样品的图谱，然后将其与上述芪葛颗粒的图谱经国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价
系统软件计算比较，相似度不低于0.90。

[0063] 精密吸取同一对照品溶液以及样品溶液，按本发明的检测条件连续进样，计算相对保留时间及相对峰面积，RSD＜0.5％，指纹图谱相似度大于0.9，表明本方法精密度良好，
分别于0h、2h、6h、10h、14h、18h和24h按本发明条件检测，对照品溶液以及样品溶液室温24
小时内稳定性良好，同样方法制备不同批次溶液，检测结果表明该方法重复性良好，具有良
好的回收率。根据不同对照品，按本发明的方法建立的条件检测，获得相应曲线，建立了相
应的含量检测方法。

[0064] 1.5实验结果

[0065] 本实验采用RRLC/Q‑TOF‑MS/MS技术对芪葛颗粒的化学成分进行了研究，鉴定和推测出芪葛颗粒中化学成分44个，其中来自葛根、黄芪、菊花的黄酮3个及其苷类21个，来自菊
花、川芎的有机酸类8个，来自川芎的内酯及其二聚体类6个，来自黄芪、白芍的皂苷类3个，
同时采用对照品确定了其中21个成分；本发明运用RRLC/Q‑TOF‑MS/MS技术，结合单味药材
对各个质谱峰进行了归属，并通过一级质谱获得的准分子离子峰，对芪葛颗粒的化学成分
进行了全面系统地解析，并研究总结了黄酮类、黄酮苷类、自菊花和川芎的有机酸类、川芎
苯酞及其二聚体类和皂苷类化合物在质谱中的裂解规律，分析芪葛颗粒中的化学成分，为
芪葛颗粒的质量控制和药效物质基础的深入研究提供了理论依据。该方法具有良好的线性
关系、精密度、稳定性、回收率，能够准确检测芪葛颗粒的成分含量，获得的对照指纹图谱能
够客观评估样品的质量。

[0066] 实施例2

[0067] 色谱条件筛选

[0068] (1)流动相的选择：

[0069] 以乙腈‑0.2％甲酸为流动相，通过对不同洗脱程序进行考察(洗脱程序见表1～3)，结果表明：洗脱程序1色谱图中的4和5两个色谱峰分离不够理想，洗脱程序3色谱图中的
20号色谱峰峰形较差且包含有杂质峰，故优选择洗脱程序2作为流动相，结果见图2。

[0070] 表1

[0071]

[0072] 表2

[0073]

[0074]

[0075] 表3

[0076]

[0077] (2)柱温的选择：

[0078] 固定流速为1ml/min时，考察柱温35℃、30℃、25℃条件下的色谱行为，结果如图3所示。结果显示，35℃条件下，色谱图中的5和6号峰、13和14号峰分离不够理想，25℃条件
下，4和5号峰、6和7号峰分离不够理想且28～34min内的色谱峰峰形较差，故优选择柱温为
30℃

[0079] (3)流速的选择：

[0080] 固定柱温为30℃时，考察流速0.9ml/min、1ml/min、1.1ml/min条件下的色谱行为，结果如图4所示。结果显示，流速为1.1ml/min时，色谱图中的13和14号峰分离不够理想、25
和26号峰峰形较差，流速为0.9ml/min时，色谱图中的4和5号峰分离不够理想、25和26号峰
峰形较差，故优选择流速为1ml/min。

[0081] (4)精密度：同一供试品溶液连续进样6次，相对保留时间和相对峰面积结果如表所示，两者RSD均小于1％，表明仪器精密度良好。

[0082]

[0083]

[0084]

[0085]

[0086] (5)重复性：制备6份供试品溶液进样分析，相对保留时间和相对峰面积结果如表所示，两者RSD均小于1％，表明该方法重复性良好。

[0087]

[0088]

[0089]

[0090]

[0091] (6)稳定性：同一供试品溶液分别于0、3、6、9、12、15、18、21、24小时进样，相对保留时间和相对峰面积结果如表所示，两者RSD均小于2％，表明供试品溶液在室温24h内稳定性
良好。

[0092]

[0093]

[0094]

[0095]

[0096] 2、方法与结果

[0097] 2.1检测条件

[0098] (1)色谱条件Kramosil C18色谱柱(4.6×150mm，3.5μm)，流动相为0.2％甲酸(A)‑乙腈(B)，梯度洗脱(0～12min，5％～10％B；12～20min，10％～14％B；20～30min，14％～
20％B；30～40min，20％～30％B，40～46min，30％～48％B，46～47min，48％～70％B，47～
‑1
55min，70％～90％B，55～70min，90％B)。流速1.0mL·min ，柱温30℃，进样量10μL，双波长
检测，检测波长分别为250nm、325nm。

[0099] (2)质谱条件电喷雾离子源(ESI)，正负离子模式，扫描范围m/z 100～3000；干燥‑1
气温度350℃；干燥气体积流量10L·min ；雾化气压力40psig；毛细管电压4000V；碎片电压
135V；锥孔电压65V；MS/MS分析中的碰撞能根据不同化合物的需要在10～55eV设定。

[0100] 2.2对照品溶液配制

[0101] 分别取葛根素、大豆苷、芒柄花素、黄芪甲苷、芍药苷、藁本内酯、阿魏酸、绿原酸、1,3‑二咖啡酰基奎宁酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、3'‑羟基葛根素、3'‑甲氧基葛
根素、新绿原酸、隐绿原酸、1,5‑二咖啡酰基奎宁酸、葛根素芹糖苷、大豆苷元、染料木苷、芍
药内酯苷、苯甲酰芍药苷、芹菜素‑7‑O‑β‑D‑吡喃葡萄苷、金合欢素、洋川芎内酯A、异阿魏
‑1
酸、、木犀草苷、芹菜素和欧当归内酯A，精密称定，加50％甲醇制成含各成分20～25μg·mL
的单标或混标溶液。

[0102] 2.3供试品溶液制备

[0103] 取本品5袋，研细，取约1g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入50％甲醇50mL，称‑1
重，超声处理15min，放冷，再次称重，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，12 000r·min  离
心5min，上清液过0.22μm滤膜，取续滤液，即得。

[0104] 2.4化合物的鉴定与解析

[0105] 采用UPLC‑Q‑TQF‑MS，按“2.1”项下条件检测供试品溶液和对照品溶液，并对芪葛颗粒中化学成分进行分析，得到的正负离子模式的总离子流图(TIC)，具体参见说明书附图
5(A为负离子模式；B为正离子模式)。

[0106] 通过一级质谱提供的准分子离子峰，结合对照品比对、二级质谱提供的碎片离子信息及相关文献对目标化合物进行鉴定，共检识到82个化合物，鉴定或推测出78个化合物，
包括：黄酮类及其苷类46个，有机酸类11个，内酯及其二聚体类11个，皂苷类10个，具体结果
见表2。

[0107] 表2、芪葛颗粒中化合物的RRLC/Q‑TOF‑MS/MS分析

[0108]

[0109]

[0110]

[0111]

[0112]

[0113]

[0114]

[0115]

[0116]

[0117]

[0118]

[0119]

[0120]

[0121]

[0122]

[0123]

[0124] 注:*通过对照品比对确认的成分，Glu代表葡萄糖，Ap代表芹菜糖，Xyl代表木糖，CQA代表单咖啡酰基奎宁酸，DCQA代表二咖啡酰基奎宁酸，CA代表咖啡酸，QA代表奎宁酸。

[0125] 按以上条件建立芪葛颗粒图谱后，按相同的方法测定待测芪葛颗粒样品的图谱，然后将其与上述芪葛颗粒的图谱经国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价
系统软件计算比较，相似度不低于0.90。

[0126] 精密吸取同一对照品溶液以及样品溶液，按本发明的检测条件连续进样，计算相对保留时间及相对峰面积，RSD＜0.5％，指纹图谱相似度大于0.9，表明本方法精密度良好，
分别于0h、2h、6h、10h、14h、18h和24h按本发明条件检测，对照品溶液以及样品溶液室温24
小时内稳定性良好，同样方法制备不同批次溶液，检测结果表明该方法重复性良好，具有良
好的回收率。根据不同对照品，按本发明的方法建立的条件检测，获得相应曲线，建立了相
应的含量检测方法。

[0127] 2.5实验结果

[0128] 本实验采用RRLC/Q‑TOF‑MS/MS技术对芪葛颗粒的化学成分进行了研究，共检识到芪葛颗粒中化学成分82个，鉴定和推测出78个化合物，包括：黄酮类及其苷类46个，有机酸
类11个，内酯及其二聚体类11个，皂苷类10个，同时采用对照品确定了其中29个成分；本发
明运用RRLC/Q‑TOF‑MS/MS技术，通过一级质谱获得的准分子离子峰，结合对照品比对、二级
碎片离子信息和相关文献等对芪葛颗粒的化学成分进行了全面系统地解析，并研究总结了
黄酮类及其苷类、有机酸类、内酯及其二聚体类和皂苷类化合物在质谱中的裂解规律，分析
芪葛颗粒中的化学成分，为芪葛颗粒的质量控制和药效物质基础的深入研究提供了理论依
据。该方法具有良好的线性关系、精密度、稳定性、回收率，能够准确检测芪葛颗粒的成分含
量，获得的对照指纹图谱能够客观评估样品的质量。