一种南极磷虾抗氧化寡肽及其制备方法

摘要

本发明提出了一种南极磷虾抗氧化寡肽的制备方法，以南极磷虾为原料，通过脱脂、酶解、超滤、阳离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到抗氧化寡肽。本发明制备的高活性抗氧化肽对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用，并能显著提高HUVEC细胞内SOD和GSH‑Px的活力，降低胞内NO和MDA的含量。

权利要求

1.一种南极磷虾抗氧化寡肽，其特征在于，所述寡肽的氨基酸序列如SEQ ID. 1所示。

2.一种如权利要求1所述南极磷虾抗氧化寡肽在制备抗氧化相关疾病的药物或者保健食品中的应用。

说明书

一种南极磷虾抗氧化寡肽及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种南极磷虾抗氧化寡肽及其制备方法。

背景技术

[0002] 抗氧化剂是能帮助捕获并中和自由基从而祛除自由基对人体损害的一类物质，其能防止或延缓食品氧化，提高食品的稳定性和延长贮存期的食品添加剂。目前，化学合成抗
氧化剂，如丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、没食子酸丙酯、叔丁基对苯二酚等广泛地应
用到食品工业中。但是，化学合成抗氧化剂不同程度上损伤人体的肝脏、肾脏等器官，部分
国家和地区已经明确限量或禁止使用。

[0003] 本发明以南极磷虾为原料，利用酶解技术制备南极磷虾抗氧化寡肽的工艺研究处于空白阶段，而以南极磷虾酶解产物为材料制备高活性抗氧化肽及其应用更是未见报道。

发明内容

[0004] 本发明提供一种南极磷虾抗氧化寡肽及其制备方法，其目的在于，提供一种南极磷虾抗氧化寡肽，通过脱脂、酶解、超滤、阳离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相
色谱分离纯化得到抗氧化寡肽，该抗氧化寡肽对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自
由基具有良好的清除作用，并能显著提高HUVEC细胞内SOD和GSH‑Px的活力，降低胞内NO和
MDA的含量。

[0005] 本发明提供一种南极磷虾抗氧化寡肽，所述寡肽的氨基酸序列如SEQ ID.1所示。

[0006] 本发明进一步保护一种上述一种南极磷虾抗氧化寡肽的制备方法，以南极磷虾为原料，通过脱脂、酶解、超滤、阳离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯
化得到抗氧化寡肽。

[0007] 作为本发明进一步的改进，所述脱脂的方法为将南极磷虾壳洗净，粉碎，研细，采用低温连续相变技术提取虾油，得到的萃取残渣干燥，过筛后即为脱脂南极磷虾粉。

[0008] 作为本发明进一步的改进，所述低温连续相变技术的具体方法为：将南极磷虾壳粉装入低温连续相变萃取釜中密封，设定相关萃取参数进行低温连续相变萃取操作，所述
萃取温度为37℃，萃取压力为1.2MPa，萃取时间为50min，解析温度为60℃。

[0009] 作为本发明进一步的改进，所述酶解为多级酶解，方法为将脱脂南极磷虾粉加水复溶，第一次调节pH值，加入碱性蛋白酶在第一温度下酶解第一时间段后，第二次调节pH
值，加入中性蛋白酶在第二温度下酶解第二时间段后，第三次调节pH值，加入木瓜蛋白酶在
第三温度下酶解第三时间段后灭酶，离心，取上清液，得到酶解液。

[0010] 作为本发明进一步的改进，所述碱性蛋白酶的添加量为1500U/kg，所述第一次调节pH值为7‑8.5，第一温度为55‑70℃，第一时间段为1‑1.5h；所述中性蛋白酶的添加量为
2000U/kg，所述第二次调节pH值为6.8‑7，第二温度为45‑50℃，第二时间段为0.5‑1h；所述
木瓜蛋白酶的添加量为2000U/kg，所述第三次调节pH值为5‑6.5，第三温度为20‑80℃，第三
时间段为1‑2。

[0011] 作为本发明进一步的改进，所述第一次调节pH值用1mol/L的NaOH溶液，所述第二次调节pH值用0.1mol/L的HCl溶液，所述第三次调节pH值用1mol/L的HCl溶液，所述脱脂南
极磷虾粉和水的体积比为1:(10‑50)。

[0012] 作为本发明进一步的改进，所述超滤条件用5000D的陶瓷膜进行第一次超滤，收集滤过液体；再用500D的有机膜进行第二次超滤，收集未滤过液体。

[0013] 作为本发明进一步的改进，所述凝胶层析柱为Sephadex G‑25；所述反相高效液相色谱柱为YWG 18柱；所述阳离子交换树脂为D001。

[0014] 本发明进一步保护一种上述南极磷虾抗氧化寡肽在制备抗氧化相关疾病的药物或者辅助药物、保健食品或食品中的应用。

[0015] 本发明具有如下有益效果：本发明一种具有显著抗氧化作用的南极磷虾抗氧化寡肽及其制备方法和用途，以南极磷虾为原料，通过脱脂、酶解、超滤、大孔树脂纯化、阳离子
交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到抗氧化寡肽Leu‑Lys‑Pro‑
Gly‑Asn，本发明制备的高活性抗氧化肽对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具
有良好的清除作用，并能显著提高HUVEC细胞内SOD和GSH‑Px的活力，降低胞内NO和MDA的含
量。具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点，可以作为药品、保健食品
或食品添加剂等。

附图说明

[0016] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本
发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可
以根据这些附图获得其他的附图。

[0017] 图1为本发明实施例3中阳离子交换树脂柱层析图；

[0018] 图2为本发明实施例3中葡聚糖凝胶层析柱层析图；

[0019] 图3为本发明实施例3中经葡聚糖凝胶层析柱层析后各组分对DPPH·清除能力对比图；

[0020] 图4为本发明实施例3中经葡聚糖凝胶层析柱层析后各组分对HO·的清除能力对比图；

[0021] 图5为本发明实施例3中AK‑2‑1的C18反相高效液相的谱图。

具体实施方式

[0022] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于
本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他
实施例，都属于本发明保护的范围。

[0023] 实施例1

[0024] 一种南极磷虾抗氧化寡肽的制备方法：

[0025] S1.脱脂：以南极磷虾为原料，通过脱脂，脱脂的方法为将南极磷虾壳洗净，粉碎，研细，采用低温连续相变技术提取虾油，得到的萃取残渣干燥，过筛后即为脱脂南极磷虾
粉；

[0026] 低温连续相变技术的具体方法为：将南极磷虾壳粉装入低温连续相变萃取釜中密封，设定相关萃取参数进行低温连续相变萃取操作，所述萃取温度为37℃，萃取压力为
1.2MPa，萃取时间为50min，解析温度为60℃；

[0027] S2.酶解：酶解为多级酶解，方法为将10g脱脂南极磷虾粉加100mL水复溶，用1mol/L的NaOH溶液第一次调节pH值为7，加入碱性蛋白酶(美国GIBCO公司)在55℃下酶解1h后，碱
性蛋白酶的添加量为1500U/kg，用0.1mol/L的HCl溶液第二次调节pH值为6.8，加入中性蛋
白酶(美国GIBCO公司)在45℃下酶解0.5h，中性蛋白酶的添加量为2000U/kg，用1mol/L的
HCl溶液第三次调节pH值为5，加入木瓜蛋白酶(上海晶纯生化科技股份有限公司)在20℃下
酶解1h，木瓜蛋白酶的添加量为2000U/kg，灭酶，离心，取上清液，得到酶解液；

[0028] S3.超滤：超滤条件用5000D的陶瓷膜进行第一次超滤，收集滤过液体；再用500D的有机膜进行第二次超滤，收集未滤过液体；

[0029] S4.阳离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到抗氧化寡肽，得率为85％。所述凝胶层析柱为Sephadex G‑25；所述反相高效液相色谱柱为YWG 18
柱；所述阳离子交换树脂为D001，均购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司。

[0030] 实施例2

[0031] 一种南极磷虾抗氧化寡肽的制备方法：

[0032] S1.脱脂：以南极磷虾为原料，通过脱脂，脱脂的方法为将南极磷虾壳洗净，粉碎，研细，采用低温连续相变技术提取虾油，得到的萃取残渣干燥，过筛后即为脱脂南极磷虾
粉；

[0033] 低温连续相变技术的具体方法为：将南极磷虾壳粉装入低温连续相变萃取釜中密封，设定相关萃取参数进行低温连续相变萃取操作，所述萃取温度为37℃，萃取压力为
1.2MPa，萃取时间为50min，解析温度为60℃；

[0034] S2.酶解：酶解为多级酶解，方法为将10g脱脂南极磷虾粉加500mL水复溶，用1mol/L的NaOH溶液第一次调节pH值为8.5，加入碱性蛋白酶在55‑70℃下酶解1.5h后，碱性蛋白酶
的添加量为1500U/kg，用0.1mol/L的HCl溶液第二次调节pH值为7，加入中性蛋白酶在50℃
下酶解1h，中性蛋白酶的添加量为2000U/kg，用1mol/L的HCl溶液第三次调节pH值为6.5，加
入木瓜蛋白酶在80℃下酶解2h，木瓜蛋白酶的添加量为2000U/kg，灭酶，离心，取上清液，得
到酶解液；

[0035] S3.超滤：超滤条件用5000D的陶瓷膜进行第一次超滤，收集滤过液体；再用500D的有机膜进行第二次超滤，收集未滤过液体；

[0036] S4.阳离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到抗氧化寡肽，得率为88％。所述凝胶层析柱为Sephadex G‑25；所述反相高效液相色谱柱为YWG 18
柱；所述阳离子交换树脂为D001。

[0037] 实施例3

[0038] 一种南极磷虾抗氧化寡肽的制备方法：

[0039] S1.脱脂：以南极磷虾为原料，通过脱脂，脱脂的方法为将南极磷虾壳洗净，粉碎，研细，采用低温连续相变技术提取虾油，得到的萃取残渣干燥，过筛后即为脱脂南极磷虾
粉；

[0040] 低温连续相变技术的具体方法为：将南极磷虾壳粉装入低温连续相变萃取釜中密封，设定相关萃取参数进行低温连续相变萃取操作，所述萃取温度为37℃，萃取压力为
1.2MPa，萃取时间为50min，解析温度为60℃；

[0041] S2.酶解：酶解为多级酶解，方法为将10g脱脂南极磷虾粉加100‑500mL水复溶，用1mol/L的NaOH溶液第一次调节pH值为8，加入碱性蛋白酶在55‑70℃下酶解1.2h后，碱性蛋
白酶的添加量为1500U/kg，用0.1mol/L的HCl溶液第二次调节pH值为6.9，加入中性蛋白酶
在47℃下酶解0.7h，中性蛋白酶的添加量为2000U/kg，用1mol/L的HCl溶液第三次调节pH值
为6，加入木瓜蛋白酶在60℃下酶解1.5h，木瓜蛋白酶的添加量为2000U/kg，灭酶，离心，取
上清液，得到酶解液；

[0042] S3.超滤：超滤条件用5000D的陶瓷膜进行第一次超滤，收集滤过液体；再用500D的有机膜进行第二次超滤，收集未滤过液体；

[0043] S4.阳离子交换树脂层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到抗氧化寡肽，得率为90％。所述凝胶层析柱为Sephadex G‑25；所述反相高效液相色谱柱为YWG 18
柱；所述阳离子交换树脂为D001。

[0044] 抗氧化活性的测定

[0045] (1)DPPH·清除能力测定

[0046] 测定多肽对DPPH自由基的清除率：按照表1添加试剂，混匀后于室温避光反应6分钟，于517nm处测定吸光度值。

[0047] 表1 DPPH自由基清除率的测定

[0048]试剂 对照组(mL) 样品组(mL) 空白组(mL)
多肽液 ‑ 1 1
0.2mMDPPH 0.25 0.25 ‑
双蒸水 1 ‑ ‑
99.5％乙醇 1 1 1.25

[0049] 清除率测定公式如下：

[0050] DPPH·清除率％＝(对照+空白‑样品)/对照×100％

[0051] (2)HO·清除能力测定

[0052] 用水杨酸法测定多肽对羟自由基的清除率：按表2添加试剂，37℃恒温水浴90分钟，于536nm波长处测定吸光度值。

[0053] 表2羟自由基清除率的测定

[0054]试剂 Ap(mL) Ab(mL) As(mL)
0.75mM邻二氮菲 1 1 1
(0.2m/L、pH 7.4)PBS 2 2 2
多肽液 ‑ ‑ 1
双蒸水 1 2 ‑
0.75mM FeSO4 1 1 1
0.12％H2O2 1 ‑ 1

[0055] 清除率测定公式如下：

[0056] HO·清除率％＝(As‑Ap/Ab‑Ap)×100％

[0057] (3)超氧阴离子清除能力测定

[0058] 按照表3添加试剂，在25℃水浴5min，于560nm测吸光度

[0059] 表3超氧阴离子清除率的测定

[0060]试剂 Ac(mL) As(mL)
2.52mM NBT 2 2
624uM NADH 2 2
多肽液 2 ‑
双蒸水 ‑ 2
120uMPMS 2 2

[0061] 清除率测定公式如下：

[0062] 超氧阴离子清除率％＝(Ac‑As)/Ac×100％

[0063] 阳离子交换树脂层析：将S3得到的未滤过液体通过玻璃棒引流缓缓倒入层析柱(柱体积约200mL)。待其上层沉降完成，用双蒸水清洗层析柱，清洗4～5个柱体积，以充分洗
去残留乙醇。再用Tris‑HCl缓冲溶液(0.05mol/L，pH 8.4)平衡至pH恒定。将以上实验所得
到的最优活性组分配置成50mg/mL的溶液，并将溶液组分以12000r/min离心20min，后取其
上清过0.45um微滤膜，以充分除去不溶性杂质。取6mL左右样品并通过恒流泵恒流上样。最
后依次按照Tris‑HCl缓冲液、Tris‑HCl(含0.1mol/L NaCl)缓冲液、Tris‑HCl(含0.25mol/L 
NaCl)缓冲液、Tris‑HCl(含0.5mol/L NaCl)缓冲液、Tris‑HCl(含1mol/L NaCl)缓冲液逐级
洗脱。每个浓度洗脱体积为400mL，洗脱流速为3mL/min，并在280nm紫外波长下收集出峰组
分。

[0064] 结果如图1。从图1中可以看出，样品经Tris‑HCl缓冲液、Tris‑HCl(含0.1mol/L NaCl)缓冲液、Tris‑HCl(含0.25mol/L NaCl)缓冲液分步洗脱出3个峰，分别命名为AK‑1、
AK‑2、AK‑3，将所得到的单峰组分进行旋蒸浓缩后，进行下一步实验。

[0065] 凝胶柱层析：

[0066] 将适量葡聚糖凝胶Sephadex G‑25干粉用超纯水隔夜溶胀，去除上浮颗粒，用抽滤装置对其进行脱气泡处理，并将胶液调至适宜浓度以方便倒出。将层析柱(2.6cm×90cm)垂
直固定在铁架台上。进行检漏后，加入1/3柱体积的双蒸水，以玻璃棒引流，先快后慢倒入凝
胶，使其自然沉降，待其完全沉降，开启恒流泵过夜，用流水压实胶柱体。

[0067] 取适量过阳离子交换树脂层析柱所得的组分，以0.6mL/min流速进行脱盐及分离，并在280nm紫外波长下收集出峰组分。

[0068] 将过阳离子交换树脂层析柱得到的AK‑1、AK‑2、AK‑3进行脱盐处理，并在280nm波长下检测出峰。从图2可以看出AK‑1、AK‑2、AK‑3经葡聚糖凝胶G‑25分别纯化得到AK‑1‑1、
AK‑1‑2、AK‑2‑1、AK‑2‑2、AK‑3‑1和AK‑3‑2六个组份。将分离得到的六个组份进行活性测定。

[0069] 将上述六个组分冻干后，将其分别配制成1.0mg/mL的样品溶液，测定其对DPPH·的清除能力。结果如图3所示：在1.0mg/mL的浓度下，AK‑2‑1组分的DPPH·清除率最好，为
48.19±2.5％，但其与AK‑3‑1组分活性(44.58±2.6％)差异不明显(P<0.05)。

[0070] 将上述六个组分冻干后，将其分别配制成1.0mg/mL的样品溶液，测定其对HO·的清除能力。结果如图4所示：在1.0mg/mL的浓度下，AK‑2‑1组分的H O·清除率最好，为40.52
±2.0％，其与AK‑3‑1组分活性(35.32±2.8％)有显著性差异(P<0.05)。结合对DPPH·的清
除活性，因此选取AK‑2‑1进行下一步实验。

[0071] 高效液相色谱纯化、制备：

[0072] 将上步经葡聚糖凝胶Sephadex G‑25层析柱后抗氧化活性最好的组分用HPL C进一步分离纯化、制备。并将所得组分委托相关科研检测机构进行氨基酸测序。

[0073] 将组分AK‑2‑1经高效液相分析，收集得到10个组分，经测序得到12条多肽(S1‑S12)：Ala‑Thr‑His(S1，327.34Da)、Ala‑Glu‑Lys(S2，346.38Da)、Leu‑Gln‑Pro(S3，
356.42Da)、Ile‑Glu‑Asn(S4，374.39Da)、Val‑Glu‑Lys(S5，374.44Da)、Ile‑Glu‑Lys‑Gly
(S6，445.52Da)、Ile‑Asp‑Ser‑Gln(S7，461.47Da)Val‑Glu‑Lys‑Thr(S8，475.54Da)、Ile‑
Glu‑Lys‑Thr(S9，489.57Da)、Leu‑Lys‑Pro‑Gly‑Asn(S10，527.62Da)、Val‑Glu‑Lys‑Gly‑
Lys(S11，559.66Da)和Ala‑Glu‑Lys‑Thr‑Arg(S12，603.68Da)。

[0074] AK‑2‑1经C18反相高效液相分析，得到谱图图5。

[0075] 以DPPH·、HO·和O2·‑清除率评价多肽清除自由基活性，通过紫外分光光度法测定各自的EC50值，结果如表4所示。

[0076] 表4多肽的自由基清除活性

[0077]

[0078]

[0079] 注：a‑g间字母相同无显著性(p>0.05)

[0080] 对12个多肽(S1‑S12)进行自由基清除活性分析，EC50越低，其抗氧化能力越强。由表4可知，在羟自由基清除率活性中，S3、S10的EC50值较低分别为0.837±0.03mg/mL，0.715
±0.006mg/mL，且无明显差异；在DPPH自由基清除率活性中，S1、S3、S5、S6、S10的EC50值较低
分别为1.547±0.15mg/mL，1.408±0.04mg/mL，1.372±0.07mg/mL，1.895±0.03mg/mL和
1.181±0.036mg/mL且无明显差异；在超氧阴离子清除率活性中，S3、S6、S8、S10的EC50值较
低分别为1.034±0.05mg/mL，0.758±0.028mg/mL，0.860±0.032mg/mL，和0.763±
0.024mg/mL，且无明显差异。研究认为氨基酸Glu、Tyr、Lys、Leu和Pro有很强的抗氧化活性，
以上活性较好的多肽可能与此有关。依据自由基清除结果来看，S10体外抗氧化能力最强，
即为本发明所制备的南极磷虾抗氧化寡肽。

[0081] 本实验以南极磷虾虾粉为原料，以DPPH·和HO·清除率为抗氧化指标，酶解液经过超滤、阳离子交换树脂层析、Sephadex G‑25凝胶层析和反相高效液相色谱(RP‑HPLC)等
一系列纯化技术制备出具抗氧化活性的12个肽段(S1‑S12)：S1.Ala‑Thr‑His(327.34Da)；
S2.Ala‑Glu‑Lys(346.38Da)；S3.Leu‑Gln‑Pro(356.42Da)；S4.Ile‑Glu‑Asn(374.39Da)；
S5.Val‑Glu‑Lys(374.44Da)；S6.Ile‑Glu‑Lys‑Gly(445.52Da)；S7.Ile‑Asp‑Ser‑Gln
(461.47Da)；S8.Val‑Glu‑Lys‑Thr(475.54Da)；S9.Ile‑Glu‑Lys‑Thr(489.57Da)；S10.Le 
u‑Lys‑Pro‑Gly‑Asn(527.62Da)；S11.Val‑Glu‑Lys‑Gly‑Lys(559.66Da)；S12.Ala‑Glu‑
Lys‑Thr‑Arg(603.68Da)。其中S10为本发明所述南极磷虾抗氧化寡肽，见序列表1，抗氧化
活性最好，其清除DPPH·的EC50分别为：0.837±0.03mg/mL和0.715±0.006mg/mL；清除HO·
‑
的EC50分别为：1.408±0.04mg/mL和1.181±0.036mg/mL；清除O2·的EC50分别为：1.034±
0.05mg/mL和0.763±0.024mg/mL。

[0082] 与现有技术相比，本发明一种具有显著抗氧化作用的南极磷虾抗氧化寡肽及其制备方法和用途，以南极磷虾为原料，通过脱脂、酶解、超滤、大孔树脂纯化、阳离子交换树脂
层析、凝胶柱层析和反相高效液相色谱分离纯化得到抗氧化寡肽Leu‑Lys‑Pro‑Gly‑Asn，本
发明制备的高活性抗氧化肽对DPPH自由基、羟基自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清
除作用，并能显著提高HUVEC细胞内SOD和GSH‑Px的活力，降低胞内NO和MDA的含量。具有安
全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点，可以作为药品、保健食品或食品添加
剂等。

[0083] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

[0084] 序列号

[0085] Leu‑Lys‑Pro‑Gly‑Asn