ANXA1衍生多肽及其应用

摘要

本发明提供了一种抗肿瘤的ANXA1衍生多肽及其应用。通过一系列实验结果证实，ANXA1通过与EphA2结合，保护EphA2不被E3泛素连接酶Cbl泛素化降解，ANXA1的N端20‑30位氨基酸(即EYVQTVKSSKG)和28‑30位氨基酸(即SKG)是ANXA1与EphA2结合的关键区域。为阻断ANXA1与EphA2结合，体外合成ANXA1 N端20‑30位氨基酸多肽，借助穿膜肽TAT进入肿瘤细胞，可明显阻断肿瘤细胞内ANXA1与EphA2的结合，增加Cbl与EphA2的结合，促进EphA2的泛素化降解，抑制肿瘤细胞体外和体内生长，具有显著的抗肿瘤作用。因此，EYVQTVKSSKG多肽可用于制备抗肿瘤药物，具有重要的临床应用价值。

权利要求

1.ANXA1衍生多肽，是来源于ANXA1蛋白N端的第20-30位氨基酸的多肽，多肽序列为EYVQTVKSSKG。

2.一种多肽，其特征在于：其为将权利要求1所述的多肽连接TAT穿膜肽后形成的融合多肽。

3.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于：连接穿膜肽之后，序列为YGRKKRRQRRREYVQTVKSSKG。

4.权利要求1-3任一项所述的多肽在制备抗肿瘤药物中的用途；所述肿瘤类型为鼻咽癌或大肠癌。

5.权利要求1-3任一项中所述的多肽在制备阻断ANXA1结合EphA2制剂中的应用。

6.权利要求1-3任一项中所述的多肽在制备促进EphA2与Cbl结合制剂中的应用。

7.权利要求1-3任一项中所述的多肽在制备促进EphA2泛素化降解制剂中的应用。

说明书

ANXA1衍生多肽及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于抗肿瘤药物研发与治疗技术领域，具体涉及一种抗肿瘤ANXA1衍生多肽及其应用。

背景技术

[0002] 膜联蛋白属于钙依赖的磷脂结合蛋白超家族，广泛存在于哺乳类动物和人体内，几乎所有器官中均有表达。ANXA1(Annexin 1)是该家族第一个被鉴定的成员，具有调控炎症、免疫、细胞增生和凋亡等多种重要的生理功能。人ANXA1蛋白是一个由346个氨基酸组成、分子量为37kD、依赖于钙离子与细胞膜发生可逆性结合的胞浆蛋白质，在许多上皮组织以及炎性细胞中均表达。起始的研究表明，ANXA1具有抗炎和调节免疫的作用。近年的研究发现，ANXA1在许多肿瘤中表达异常，与肿瘤的发生和转移密切相关，是潜在的肿瘤干预靶标。但目前未见以ANXA1为靶点的抗肿瘤药物研究报道。

[0003] EphA2属于受体酪氨酸激酶超家族成员，EphA2在许多肿瘤中高表达，通过配体非依赖方式促进肿瘤生长以及侵袭和转移，增加肿瘤干性特征。高表达的EphA2与肿瘤演进以及患者不良预后密切相关，它已成为研发抗癌药物的靶标。尽管目前有ALW-II-41-27等EphA2抑制剂已进入临床实验，但是其特异性和安全性仍存在较大缺陷。

[0004] ANXA1和EphA2均是潜在的肿瘤干预靶标，但是这两个蛋白之间相互作用及其生物学意义至今未见报道。本发明采用免疫共沉淀-高通量质谱分析技术(靶向蛋白质组学技术)筛选鼻咽癌细胞EphA2的互作蛋白，发现ANXA1是EphA2的互作蛋白，免疫共沉淀实验证实ANXA1是鼻咽癌和大肠癌细胞EphA2的互作蛋白，在HEK293细胞中外源性ANXA1与EphA2也存在相互作用，GST Pull-down实验证实ANXA1与EphA2蛋白可直接相互作用。蛋白质互作是细胞生化反应网络的一个主要组成部分，参与调节细胞各种生理功能，如蛋白质互作通过调控蛋白质修饰、稳定性和亚细胞定位等调控细胞的功能及其信号传导。研究表明，蛋白质互作不仅与肿瘤密切相关，而且是重要的药物靶点，调控蛋白质互作的多肽有望成为新的抗癌药物。因此，基于ANXA1与EphA2是重要的瘤蛋白质以及两者相互作用，阻断ANXA1与EphA2相互作用很可能研发出新的抗肿瘤药物。

发明内容

[0005] 本发明提供了一种抗肿瘤的ANXA1衍生多肽及其应用。本发明是基于我们发现了一种新的机理：ANXA1通过N端20-30位和28-30位氨基酸与EphA2结合，抑制Cbl介导的EphA2泛素化降解，稳定EphA2促进肿瘤发生发展。依据此机理发明一种ANXA1衍生多肽抗肿瘤，ANXA1的N端20-30位氨基酸多肽能阻断ANXA1与EphA2的相互作用，促进EphA2的泛素化降解，靶向下调EphA2的水平，发挥抑制鼻咽癌和大肠癌细胞生长、侵袭和转移的作用。

[0006] 主要发明内容如下：

[0007] 我们采用靶向蛋白质组学技术筛选鼻咽癌细胞EphA2的互作蛋白，发现ANXA1是EphA2的互作蛋白，免疫共沉淀证实ANXA1是鼻咽癌和大肠癌细胞EphA2的互作蛋白，HEK293细胞中外源性ANXA1与EphA2也存在相互作用，GST Pull-down实验证实ANXA1与EphA2蛋白可直接相互作用。见图1。

[0008] 我们发现在鼻咽癌细胞系中ANXA1可以抑制EphA2的泛素化降解，显著增加EphA2的稳定性，延长EphA2的半衰期。见图2。

[0009] 我们发现了ANXA1稳定EphA2的机制：即ANXA1通过与E3泛素连接酶Cbl竞争性结合EphA2，抑制Cbl介导的EphA2泛素化降解，增加EphA2的稳定性。见图3。

[0010] 我们确定了与EphA2相互作用的ANXA1区域：我们构建了多种ANXA1截短或缺失突变体，采用免疫共沉淀方法分析区域截短或缺失的ANXA1与EphA2的相互作用，发现与EphA2相互作用区域位于ANXA1的N端20-30位氨基酸。进一步对ANXA1的N端20-30位氨基酸分别进行20-23，24-27，28-30位氨基酸缺失突变，发现与EphA2相互作用区域主要在ANXA1的N端28-30位氨基酸。见图4。

[0011] 我们确定了缺失N端第28-30位氨基酸的ANXA1对EphA2稳定性的影响：N端28-30位氨基酸缺失的ANXA1不能与EphA2结合，丧失了与Cbl竞争性结合EphA2的能力，不能恢复ANXA1敲低细胞中EphA2的蛋白水平，即不能稳定EphA2。见图5。

[0012] 我们确定了N端第28-30位氨基酸缺失的ANXA1对鼻咽癌细胞致瘤性以及侵袭转移的影响。

[0013] N端第28-30位氨基酸缺失的ANXA1对致瘤性的影响：CCK8、EdU和软琼脂集落形成实验以及裸鼠皮下成瘤实验发现，与野生型ANXA1相比，N端第28-30位氨基酸缺失的ANXA1不能恢复ANXA1敲低的鼻咽癌细胞的生长和致瘤性。见图6。

[0014] N端第28-30位氨基酸缺失的ANXA1对侵袭转移能力的影响：细胞划痕愈合和Transwell侵袭实验以及裸鼠肺转移瘤实验发现，与野生型ANXA1相比，N端第28-30位氨基酸缺失的ANXA1不能恢复ANXA1敲低的鼻咽癌细胞的侵袭和转移能力。见图7。

[0015] 综上所述，本发明发现在鼻咽癌和大肠癌细胞中ANXA1与EphA2结合，抑制EphA2的泛素化降解，稳定EphA2。其中ANXA1的N端第20-30位氨基酸，尤其是第28-30氨基酸为ANXA1与EphA2结合的关键区域。研究结果为ANXA1的N端20-30位氨基酸多肽作为鼻咽癌和大肠癌的治疗性多肽提供了理论和实验依据。

[0016] 本发明发现体外合成的ANXA1的N端20-30位氨基酸多肽能借助穿膜肽TAT进入肿瘤细胞，可明显抑制细胞内ANXA1与EphA2的结合，增加Cbl与EphA2的结合，促进EphA2的泛素化降解，呈剂量依赖性下调EphA2水平，显著抑制鼻咽癌细胞生长、移动和侵袭以及体内致瘤性。见图8。

[0017] 本发明的主要目的是提供一种新的抗肿瘤ANXA1衍生多肽，即ANXA1的N端20-30位氨基酸的多肽或者第28-30位的3个氨基酸的多肽，其抗肿瘤类型包括鼻咽癌和结肠癌。多肽具体如下：EYVQTVKSSKG即Glu-Tyr-Val-Gln-Thr-Val-Lys-Ser-Ser-Lys-Gly，见SEQ ID No.1，SKG，即Ser-Lys-Gly，见SEQ ID No.2。本发明的多肽连接穿膜肽TAT后，进入细胞的能力增强，连接穿膜肽TAT之后的序列如下：YGRKKRRQRRREYVQTVKSSKG，即Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Glu-Tyr-Val-Gln-Thr-Val-Lys-Ser-Ser-Lys-Gly，见SEQ ID No.3。或YGRKKRRQRRRSKG，即：Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Ser-Lys-Gly，见SEQ ID No.4。

[0018] 本发明的多肽还包括在上述多肽序列基础上，通过N末端或C末端的修饰，氨基酸的缺失、替换、环化或手性变换所得到的具有抗肿瘤作用的多肽系列。

[0019] 本发明的次要目的是提供上述多肽的一些应用，具体如下：

[0020] 所述的抗肿瘤多肽在制备抗肿瘤药物中的用途。所述肿瘤类型包括鼻咽癌和大肠癌。

[0021] 所述的多肽在制备阻止ANXA1结合EphA2制剂中的应用。

[0022] 所述的多肽在制备促进EphA2与Cbl结合制剂中的应用。

[0023] 所述的多肽在制备促进EphA2泛素化降解制剂中的应用。

[0024] 本发明通过一系列研究发现，鼻咽癌和大肠癌细胞中ANXA1与EphA2之间存在相互作用，ANXA1通过抑制EphA2泛素化降解而稳定EphA2。其中ANXA1的N端20-30位11个氨基酸以及N端28-30位3个氨基酸是关键的EphA2结合区域。包含这3个氨基酸的ANXA1的N端20-30位氨基酸多肽的稳定性更好。体内和体外实验证实，N端20-30位氨基酸多肽能借助穿膜肽TAT进入肿瘤细胞，可抑制细胞内ANXA1与EphA2的结合，促进EphA2的降解，抑制肿瘤细胞增殖、移动和侵袭以及致瘤性，达到治疗肿瘤的效果。此多肽抗肿瘤作用明显，无明显的毒副作用。

附图说明

[0025] 图1.发现并证实ANXA1与EphA2蛋白相互作用

[0026] A为SDS-PAGE电泳分离EphA2相互作用蛋白；

[0027] B为质谱鉴定ANXA1是EphA2的相互作用蛋白；

[0028] C和D为免疫共沉淀实验证实鼻咽癌和结肠癌细胞系中EphA2与ANXA1相互作用；

[0029] E和F为免疫共沉淀实验证实HEK293细胞中外源性EphA2与ANXA1相互作用；

[0030] G为GST Pull-down实验证实EphA2与ANXA1直接相互作用。

[0031] 其中Input表示总蛋白水平，IP表示免疫共沉淀蛋白水平；Tubulin表示内参；IP：EphA2为加入的抗体为EphA2，用Western blot(WB)检测共沉淀下来ANXA1；IP：ANXA1为加入的抗体为ANXA1,用WB检测共沉淀EphA2；Flag表示Flag标签；GST表示GST标签，GST-EphA2表示连接GST标签的EphA2，His-ANXA1表示连接His标签的ANXA1。

[0032] 图1的结果发现并证实ANXA1与EphA2在鼻咽癌和大肠癌细胞存在相互作用。

[0033] 图2.ANXA1通过泛素蛋白酶体系统调控EphA2的稳定性

[0034] A和B为在鼻咽癌细胞系5-8F和HK1中敲低ANXA1降低EphA2蛋白的稳定性/半衰期；

[0035] C为在鼻咽癌细胞系6-10B中过表达ANXA1增加EphA2稳定性/半衰期；

[0036] D为在ANXA1敲低的5-8F和HK1鼻咽癌细胞系中，蛋白酶体抑制剂MG132能恢复EphA2的蛋白水平；

[0037] E为Western blot(WB)检测ANXA1敲低和过表达对鼻咽癌细胞EphA2蛋白水平的影响，如图所示，ANXA1正向调控EphA2蛋白水平；

[0038] F为免疫共沉淀实验检测ANXA1敲低和过表达对鼻咽癌细胞EphA2泛素化水平的影响，结果显示，ANXA1抑制鼻咽癌细胞EphA2的泛素化；

[0039] G为免疫共沉淀实验确定ANXA1抑制EphA2的K48链多聚泛素化。

[0040] 其中CHX为蛋白质合成抑制剂放线菌酮，MG132为蛋白酶体抑制剂，shCtrl表示shRNA干扰对照，shANXA1表示shRNA干扰ANXA1，ANXA1-OE表示ANXA1过表达，IB：anti-Ub表示泛素化检测抗体；EphA2-(Ub)n表示EphA2多聚泛素化。HA-Ub表示带有HA标签的总泛素化质粒，HA-Ubk48表示带有HA标签的Lys48泛素化质粒，HA-Ubk63表示带有HA标签的Lys63泛素化质粒。

[0041] 图2的结果表明，ANXA1通过抑制EphA2蛋白的泛素化降解，增加EphA2蛋白的稳定性。

[0042] 图3.ANXA1通过与Cbl竞争性结合EphA2调控EphA2的稳定性

[0043] A为免疫共沉淀实验检测ANXA1敲低或过表达对鼻咽癌细胞中EphA2与Cbl结合的影响；

[0044] B为免疫共沉淀实验检测Cbl过表达或siRNA干扰对鼻咽癌细胞中EphA2与ANXA1结合的影响；

[0045] C为Cbl siRNA干扰拮抗ANXA1敲低对鼻咽癌细胞EphA2蛋白表达和泛素化水平的影响；

[0046] D为在HEK293细胞中外源性Cbl呈剂量依赖性促进外源性EphA2降解，而外源性ANXA1拮抗Cbl降解EphA2；

[0047] E为在HEK293细胞中外源性Cbl使外源性EphA2蛋白泛素化，而外源性ANXA1拮抗Cbl泛素化EphA2蛋白；

[0048] 其中Cbl-OE表示Cbl过表达，SiCtrl表示siRNA阴性对照，SiCbl表示siRNA干扰Cbl，EphA2-(Ub)n表示EphA2多聚泛素化。

[0049] 图3的结果表明，ANXA1通过与Cbl竞争性结合EphA2，抑制EphA2蛋白的泛素化降解，增加EphA2蛋白的稳定性。

[0050] 图4.确定与EphA2结合的ANXA1区域

[0051] A为构建的ANXA1截短或缺失突变体的示意图；

[0052] B为免疫共沉淀实验检查N端和C端缺失的ANXA1与EphA2结合，结果显示N端缺失的ANXA1不能与EphA2结合；

[0053] C为免疫共沉淀检查N端1-19、20-40、20-30和31-40位氨基酸缺失的ANXA1与EphA2结合，结果显示N端20-30氨基酸缺失的ANXA1不能与EphA2结合；

[0054] D为免疫共沉淀检查N端20-23、24-27和28-30位氨基酸缺失的ANXA1与EphA2结合，结果显示N端28-30氨基酸缺失的ANXA1不能与EphA2结合；

[0055] E为ANXA1和Cbl与EphA2竞争性结合的结构模拟图。

[0056] 其中ANXA1variants表示ANXA1截短或缺失突变体，Vector表示载体对照，Full length表示野生型ANXA1。

[0057] 图4的结果证实，N端20-30位氨基酸以及28-30位氨基酸是ANXA1与EphA2结合的关键区域。

[0058] 图5.N端28-30位氨基酸缺失的ANXA1丧失了稳定EphA2的功能

[0059] A为WB检测28-30位氨基酸缺失的ANXA1对鼻咽癌细胞EphA2稳定性的影响，结果显示28-30位氨基酸缺失的ANXA1不能稳定鼻咽癌细胞的EphA2；

[0060] B为WB检测28-30位氨基酸缺失的ANXA1对HEK293细胞中外源性EphA2稳定性的影响，结果显示28-30位氨基酸缺失的ANXA1不能稳定外源性EphA2；

[0061] 其中shRes表示敲低内源性ANXA1后再转染ANXA1或28-30位氨基酸缺失的ANXA1质粒；D28-30表示28-30位氨基酸缺失的ANXA1；shCtrl表达shRNA干扰对照。

[0062] 图5结果证实N端28-30位氨基酸缺失的ANXA1不能稳定EphA2。

[0063] 图6.N端28-30位氨基酸缺失的ANXA1抑制鼻咽癌细胞的生长和致瘤性[0064] A,B,C为细胞增殖实验检测28-30位氨基酸缺失的ANXA1对5-8F鼻咽癌细胞生长的影响，结果显示，28-30位氨基酸缺失的ANXA1抑制肿瘤细胞生长。A为CCK8细胞增殖实验；B为EdU细胞增殖实验，左图为实验结果，右图为统计学分析；C为软琼脂集落形成实验，左图为实验结果，右图为统计学分析。

[0065] D为28-30位氨基酸缺失的ANXA1对5-8F鼻咽癌细胞裸鼠皮下成瘤能力的影响。结果显示，28-30位氨基酸缺失的ANXA1抑制鼻咽癌细胞裸鼠皮下成瘤能力。左图为皮下移植瘤，中图和右图分别为皮下移植瘤的生长曲线和皮下移植瘤的平均重量。

[0066] 其中shEphA2-shANXA1表示在5-8F鼻咽癌细胞系中敲低内源性的EphA2和ANXA1；Vector表示载体对照组细胞；shCtrl表示5-8F未处理的对照细胞；Res表示恢复；D 28-30表示28-30位氨基酸缺失的ANXA1。Student-T检验，*P<0.05；***P<0.05；ns:无统计学意义。

[0067] shRes EphA2-ANXA1表示敲低内源性的EphA2和ANXA1后再转染外源性的EphA2和ANXA1进行Rescue；

[0068] shRes EphA2-D28-30表示敲低内源性的EphA2和ANXA1后再转染外源性的EphA2和28-30位氨基酸缺失的ANXA1；

[0069] shResANXA1表示表示敲低内源性的EphA2和ANXA1后再转染外源性的ANXA1；

[0070] shRes EphA2表示表示敲低内源性的EphA2和ANXA1后再转染外源性的EphA2。

[0071] 图6结果证实N端28-30位氨基酸缺失的ANXA1抑制鼻咽癌细胞的生长和致瘤性。

[0072] 图7.N端28-30位氨基酸缺失的ANXA1抑制鼻咽癌细胞的侵袭转移

[0073] A和B为细胞划痕愈合实验和Transwell侵袭实验检测N端28-30位氨基酸缺失的ANXA1对鼻咽癌细胞侵袭能力的影响。结果显示，N端28-30位氨基酸缺失的ANXA1抑制5-8F鼻咽癌细胞侵袭转移；A为细胞划痕愈合实验，左图为实验结果，右为统计学分析；B为Transwell侵袭实验，左图为实验结果，右图为统计学分析。

[0074] C为裸鼠肺转移瘤实验检测N端28-30位氨基酸缺失的ANXA1对鼻咽癌细胞转移能力的影响。结果显示，N端28-30位氨基酸缺失的ANXA1抑制5-8F鼻咽癌细胞的肺转移。左图为裸鼠肺转移瘤，右图为肺转移瘤数目的统计分析。

[0075] 其中shEphA2-shANXA1表示在5-8F鼻咽癌细胞系中敲低EphA2和ANXA1；Vector表示载体对照组细胞；shCtrl表示5-8F未处理的对照细胞；Res表示恢复；D28-30表示28-30位氨基酸缺失的ANXA1。Student-T检验，*P<0.05；***P<0.05；ns:无统计学意义。

[0076] 图7结果证实N端28-30位氨基酸缺失的ANXA1抑制鼻咽癌细胞的侵袭转移。

[0077] 图8.ANXA1N端20-30位氨基酸多肽抑制鼻咽癌细胞的生长、移动和侵袭以及体内致瘤性

[0078] A为连接穿膜肽TAT的ANXA1N端20-30位氨基酸多肽[A1(20-30)]的细胞穿透性检查；上图为A1(20-30)多肽和TAT对照多肽的结构图；下图为多肽细胞穿透性检测，结果显示，A1(20-30)能进入细胞。

[0079] B为ANXA1N端20-30位氨基酸多肽[A1(20-30)]对EphA2表达水平的影响；结果显示，A1(20-30)能显著降低EphA2的表达水平。

[0080] C为免疫共沉淀实验检测A1(20-30)对5-8F鼻咽癌细胞ANXA1和Cbl与EphA2结合的影响。结果显示，A1(20-30)降低ANXA1与EphA2结合，增加Cbl与EphA2结合；

[0081] D为免疫共沉淀实验检测A1(20-30)对鼻咽癌5-8F和HK1细胞EphA2泛素化的影响。结果显示，A1(20-30)增加5-8F和HK-1鼻咽癌细胞EphA2的泛素化水平；

[0082] E为免疫荧光染色检查A1(20-30)对5-8F鼻咽癌细胞EphA2内吞(降解)的影响。结果显示，A1(20-30)A1(20-30)增加鼻咽癌细胞EphA2的内吞(降解)；

[0083] F为CCK8细胞实验检查A1(20-30)对5-8F和HK1鼻咽癌细胞增殖的影响。结果显示，A1(20-30)显著抑制鼻咽癌细胞的增殖；

[0084] G为EdU和软琼脂集落形成实验检测A1(20-30)对5-8F和HK-1鼻咽癌细胞增殖的影响。结果显示，A1(20-30)抑制鼻咽癌细胞恶性增殖。上图为实验结果，下图为统计学分析。Student-T检验，**P<0.01，***P<0.001。

[0085] H为细胞划痕愈合和Transwell侵袭实验检测A1(20-30)对5-8F和HK-1鼻咽癌细胞迁移和侵袭能力的影响。结果显示，A1(20-30)抑制鼻咽癌细胞的迁移和侵袭。上图为实验结果，下图为统计学分析。Student-T检验,**P<0.01，***P<0.001。

[0086] I为A1(20-30)对5-8F和HK-1鼻咽癌细胞裸鼠皮下成瘤力的影响。结果显示，A1(20-30)抑制鼻咽癌细胞的裸鼠皮下成瘤力。左图为小鼠皮下移植瘤，中图为皮下移植瘤生长曲线，右图为皮下移植瘤平均重量。Student-T检验,***P<0.001。

[0087] J为小鼠皮下移植瘤EphA2和ANXA1免疫组化染色。结果显示，A1(20-30)显著降低5-8F和HK-1鼻咽癌细胞的移植瘤组织中EphA2的表达。左图为免疫组化染色，右图为皮下移植瘤平均重量。Student-T检验,***P<0.001，ns，无统计学差异。

[0088] 图8结果证实ANXA1N端20-30位氨基酸多肽具有显著的抗鼻咽癌作用。

具体实施方式

[0089] 以下结合实施例旨进一步说明本发明，而非限制本发明。

[0090] 图1A是EphA2免疫沉淀复合物的SDS-PAGE电泳考染图；采用含10％胎牛血清的1640培养基培养鼻咽癌5-8F细胞，48小时后收集细胞，加入适量NP-40裂解液提取蛋白，取
1.2mg蛋白裂解物加入30μl Protein A/G珠子和2μg EphA2抗体4℃过夜，收集珠子，加入30μl 2×SDS loading buffer，煮沸5min，进行SDS-PAGE电泳，凝胶进行考马斯亮蓝染色。

[0091] 图1B为质谱鉴定ANXA1是EphA2的相互作用蛋白。从图1A考染胶中切取蛋白质条带进行酶解后质谱分析，鉴定EphA2的相互作用蛋白，图1B为ANXA1的质谱鉴定结果。

[0092] 图1C和D为免疫共沉淀实验检测鼻咽癌细胞系6-10B、HK1和5-8F以及结肠癌细胞系SW480和SW620中EphA2与ANXA1的相互作用。IP:EphA2：免疫共沉淀抗体为EphA2，WB检测共沉淀的ANXA1；IP:ANXA1：免疫共沉淀抗体为ANXA1，WB检测共沉淀的EphA2。

[0093] 免疫共沉淀的步骤：采用NP-40裂解液抽提细胞蛋白质，1.2mg细胞蛋白质加入30μl protein A/G珠子和2μg相应抗体4℃孵育12小时后，1000转离心3分钟，去上清。NP-40裂解液洗涤珠子3次，去上清，加入30μl 2×SDS loading buffer，煮沸5min，WB检测互作蛋白。

[0094] 图1E和F是免疫共沉淀实验检测HEK293细胞中外源性EphA2与ANXA1蛋白的相互作用。将EphA2和带有Flag标记的ANXAI表达质粒共转染HEK293细胞，48小时后，采用NP-40裂解液抽提细胞全蛋白，通过免疫共沉淀检查EphA2与ANXA1的相互作用。IP:EphA2：免疫共沉淀抗体为EphA2，WB检测共沉淀的ANXA1；IP:Flag：免疫共沉淀抗体为Flag(ANXA1)，WB检测共沉淀的EphA2。

[0095] 图1G为GST Pull-down实验检查EphA2与ANXA1蛋白的直接相互作用：首先原核表达并纯化GST-EphA2融合蛋白和His-ANXA1融合蛋白。然后进行Pull-down实验，具体实验步骤如下：

[0096] 在1.5ml EP管，分别加入GST-EphA2融合蛋白和对照GST蛋白各5μg以及His-ANXA1融合蛋白5μg，20μl Glutathione Sepharose-4B beads，补充GST-Pull down buffer到总体积500μl，4℃结合过夜，1000转离心3min，去上清。加入500μl GST-Pull down buffer洗涤beads 3次。吸尽Glutathione Sepharose 4B beads上方液体后，加入60μl 1×SDS loading buffer，煮沸10min，采用标签抗体Western blot检测两个蛋白质相互作用。

[0097] 本发明采用靶向蛋白质组学技术筛选鼻咽癌细胞EphA2的互作蛋白，发现ANXA1是EphA2的互作蛋白，免疫共沉淀证实ANXA1是鼻咽癌和结直肠癌细胞EphA2的互作蛋白。

[0098] 图2A和2B为采用shRNA干扰方法建立ANXA1敲低的5-8F和HK1鼻咽癌细胞系，用20μg/ml的蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)处理细胞4h、8h、12h和16h后收集细胞，抽提细胞全蛋白，WB检测EphA2的水平，分析EphA2的半衰期。

[0099] 图2C为在建立ANXA1过表达的6-10B鼻咽癌细胞系，同图2A和2B方法处理细胞，WB检测EphA2蛋白水平，分析EphA2的半衰期。

[0100] 图2D为在ANXA1敲低的鼻咽癌细胞系5-8F和HK1中，加入蛋白酶体抑制剂MG132后，WB检测EphA2蛋白水平的变化。

[0101] 图2E为WB检测在5-8F和HK1鼻咽癌细胞中敲低ANXA1，以及在6-10B细胞中过表达ANXA1对EphA2蛋白水平的影响。

[0102] 图2F为免疫共沉淀实验检测在5-8F和HK1鼻咽癌细胞中敲低ANXA1，以及在6-10B细胞中过表达ANXA1对EphA2泛素化水平的影响。采用RIPA裂解液抽提细胞的全蛋白，EphA2抗体免疫共沉淀，WB检测EphA2多聚泛素化(Ub)水平。

[0103] 图2G为免疫共沉淀实验检测ANXA1影响EphA2泛素化的类型。按照图中所示的质粒共转染HEK293细胞，48小时后，采用NP-40裂解液抽提细胞总蛋白，用EphA2抗体免疫共沉淀，WB检测EphA2多聚泛素化(Ub)水平。

[0104] 1.shRNA干扰方法建立ANXA1敲低的5-8F和HK1鼻咽癌细胞系：采用吉凯基因构建的带有ANXA1干扰序列的慢病毒载体GV112，按照吉凯基因病毒感染说明书进行细胞病毒感染，感染72小时后，用含有适宜浓度嘌呤霉素的培养基继续筛选培养，抗药性克隆经Western blot鉴定，建立ANXA1稳定敲低的细胞株。

[0105] 2.建立ANXA1过表达的6-10B鼻咽癌细胞系：采用吉凯基因构建的带有ANXA1表达序列的慢病毒载体GV358，按照吉凯基因病毒感染说明书进行细胞病毒感染，感染72小时后，用含有适宜浓度嘌呤霉素的培养基继续筛选培养，抗药性克隆经Western blot鉴定，建立ANXA1稳定过表达的细胞株。

[0106] 3.细胞瞬时转染：转染前一天将细胞接种到六孔板，待细胞融合度达到90％左右时，在100μl无血清的DMEM培养基中加入需要转染的质粒各2μg，混合均匀后静置5分钟；在100μl无血清的DMEM培养基中加入Lipofectamine 2000(按照质粒：Lipofectamine 2000为
1：1.5)，轻轻混匀后静置5分钟，然后将含有质粒和Lipofectamine 2000的培基轻轻混合均匀，静置15分钟后加入六孔板中，6-8小时后，更换新鲜的含10％FBS的DMEM培养基继续培养，转染48小时后进行后续实验。

[0107] 本发明发现在鼻咽癌细胞系中ANXA1可以抑制EphA2的泛素化降解，显著维持EphA2的稳定性，延长EphA2的半衰期。

[0108] 图3A为免疫共沉淀实验检测ANXA1敲低和过表达对鼻咽癌细胞中EphA2与Cbl结合的影响。当ANXA1敲低或过表达时，EphA2与Cbl的结合增多或减少。

[0109] 图3B为免疫共沉淀检测Cbl过表达或敲低对鼻咽癌细胞EphA2与ANXA1结合的影响。当Cbl过表达或敲低时，EphA2与ANXA1的结合减少或增多。在5-8F细胞中瞬时转染Cbl表达质粒，在6-10B细胞中瞬时转染Cbl SiRNA干扰质粒，然后进行免疫共沉淀实验。瞬时转染步骤同上。

[0110] 图3C为Cbl siRNA干扰拮抗ANXA1敲低对鼻咽癌细胞EphA2蛋白表达和泛素化水平的影响。采用EphA2抗体进行免疫共沉淀，WB检测EphA2多聚泛素化(Ub)水平。

[0111] 图3D为在HEK293细胞中外源性Cbl呈剂量依赖性促进外源性EphA2降解，而外源性ANXA1拮抗Cbl降解EphA2。

[0112] 图3E为在HEK293细胞中外源性Cbl使外源性EphA2蛋白泛素化，而外源性ANXA1拮抗Cbl泛素化EphA2蛋白。

[0113] 本发明确定了ANXA1稳定EphA2的机制：ANXA1通过与E3泛素连接酶Cbl竞争性结合EphA2，抑制Cbl介导的EphA2泛素化降解，增加EphA2蛋白的稳定性和水平。

[0114] 图4A为构建的ANXA1截短和缺失突变体的示意图。所有变体质粒均从吉凯基因公司订购。

[0115] 图4B为免疫共沉淀实验检查N端和C端缺失的ANXA1与EphA2结合，结果显示，N端缺失的ANXA1不能与EphA2结合。

[0116] 图4C为免疫共沉淀实验检查N端1-19、20-40、20-30和31-40位氨基酸缺失ANXA1与EphA2结合，结果显示，N端20-30缺失的ANXA1不能与EphA2结合。

[0117] 图4D为免疫共沉淀实验检查N端20-23、24-27和28-30位氨基酸缺失的ANXA1与EphA2结合，结果显示，N端28-30缺失的ANXA1不能与EphA2结合。

[0118] 图4E为ANXA1和Cbl与EphA2竞争性结合的模拟图。

[0119] 本发明确定了ANXA1与EphA2相互作用的关键区域：通过构建多种ANXA1截短和缺失突变体，采用免疫共沉淀方法检查突变ANXA1与EphA2的相互作用，发现与EphA2相互作用区域位于ANXA1的N端20-30位11个氨基酸，并进一步将与EphA2相互作用区域缩小在ANXA1的N端28-30位3个氨基酸。

[0120] 图5A为WB检测28-30位氨基酸缺失的ANXA1对鼻咽癌细胞EphA2稳定性的影响。结果显示28-30位氨基酸缺失的ANXA1降低EphA2的稳定性。建立内源性ANXA1敲低的5-8F鼻咽癌细胞系，再分别转染28-30位氨基酸缺失的ANXA1(shResD20-30)和野生型ANXA1(shResANXA1)，用浓度为20μg/ml的蛋白合成抑制剂CHX处理细胞4h、8h、12h和16h后，WB检测EphA2的水平。

[0121] 图5B为WB检测28-30位氨基酸缺失的ANXA1对HEK293细胞中外源性EphA2稳定性的影响。结果显示28-30位氨基酸缺失的ANXA1不能保护外源性EphA2被Cbl降解，EphA2的稳定性显著降低。在过表达EphA2的HEK293细胞系中，分别转染第28-30位氨基酸缺失的ANXA1(D20-30)或野生型ANXA1(ANXA1)和Cbl质粒,WB检测EphA2的水平。

[0122] 本发明发现，缺失N端28-30位3个氨基酸的ANXA1不能与EphA2结合，丧失了与Cbl竞争性结合EphA2的能力，导致EphA2降解增加，EphA2蛋白水平下调。

[0123] 图6A，B和C为28-30位氨基酸缺失的ANXA1对鼻咽癌细胞(5-8F)生长的影响。A为CCK8检测细胞增殖实验；B为EdU检测细胞增殖实验；C为软琼脂集落形成实验；D为28-30位氨基酸缺失的ANXA1对鼻咽癌细胞裸鼠皮下成瘤力的影响，左为平均瘤体积，右为平均瘤重量。Student-T检验,*P<0.05,***P<0.001。

[0124] 1、CCK8实验：采用碧云天生产的CCK8试剂盒进行检测。按每孔1×103个细胞接种到96孔板中生长，每24小时加入10μl CCK-8试剂，37℃孵2小时后，用酶标仪测量OD450吸光值，一共测量6天，实验重复三次，统计分析实验结果。

[0125] 2、EdU实验：采用广州锐博生产的EdU检测试剂盒进行检测。按每孔1×104个细胞接种到96孔板中生长，48小时后，每孔加入50μM EdU，37℃孵育2小时，然后用4％多聚甲醛固定30分钟，200μl浓度为2mg/ml的甘氨酸孵育5分钟，然后用0.5％Triton X-100透化10分钟，用PBS洗5分钟后，用200μl Hoechst 33342(5μg/ml)染色30分钟，避光。荧光显微镜下计数，实验重复三次，统计分析实验结果。

[0126] 3、软琼脂集落形成实验：实验前准备琼脂胶，采用六孔板，在底层铺上1ml含有10％FBS培养基的琼脂胶(琼脂浓度为0.5％)，待琼脂完全凝固后，在上层铺上1ml含有1×
104个细胞和10％FBS培养基的琼脂胶(琼脂浓度为0.36％)，待琼脂凝固后，在上层加入1ml含10％FBS的培养基，每三天更换一次，在37℃、5％CO2培养箱中培养12天左右，当克隆数>
50个时，用显微镜拍照并计数，实验重复三次，统计分析实验结果。

[0127] 4、裸鼠皮下瘤实验：实验动物从中南大学湘雅医学院动物部代采购，动物实验在湘雅医学院动物实验中心进行。购买3-4周龄的雌性裸鼠60只，随机分成六组，每组8只，待六组细胞[5-8F，5-8F敲除ANXA1和EphA2，5-8F敲除ANXA1和EphA2后分别回补EphA2、ANXA1、EphA2-D(28-30)和EphA2-ANXA1]培养好后，在每只裸鼠皮下种植2×106个细胞，每隔一天测量记录瘤体体积，3周后对裸鼠施行安乐死后剥离皮下瘤体，称量瘤体重量，对瘤体积和瘤重量进行统计学分析。

[0128] 本发明确定了N端第28-30位氨基酸缺失的ANXA1对致瘤性的影响。CCK8、EdU和软琼脂集落形成实验以及裸鼠皮下成瘤实验发现，与野生型ANXA1相比，N端28-30位3个氨基酸缺失的ANXA1明显抑制鼻咽癌细胞的生长和致瘤性。

[0129] 图7.N端28-30位氨基酸缺失的ANXA1抑制鼻咽癌细胞的侵袭转移。A为细胞划痕愈合实验，B为Transwell侵袭实验检测；C为裸鼠肺转移瘤实验。Student-T检验,*P<0.05，***P<0.001。

[0130] 1、细胞划痕愈合实验：取6孔板接种细胞，待细胞融合度接近100％时，用吸管尖端拖曳划伤单层细胞划伤，用PBS洗去细胞碎片，每孔加入2ml 1640培养基继续培养，在划伤后0、24、48h在倒置显微镜下观察细胞划痕愈合情况并拍照。实验重复三次，统计分析实验结果。

[0131] 2、Transwell侵袭实验：取一个24孔板和数个直径为8mm的Transwell小室(BD Biosciences生产)，在小室的下层加入含10％FBS的1640培养基，在小室上层加入1×105个细胞(用含0.5％FBS的1640培养基重悬)。48小时后去培养基，用0.5％的结晶紫染色，用显微镜拍照并计数，实验重复三次，统计分析实验结果。

[0132] 3、肺转移瘤实验：实验动物和细胞准备同上，每组每只细胞通过尾静脉注射2×106个相应组别的细胞，7周后，所有裸鼠施行安乐死后，取出肺组织，福尔马林固定，解剖显微镜下计数肺表面转移瘤，组织HE染色，显微镜下计数肺部成瘤数目，实验结果进行统计学分析。

[0133] 本发明发现，与野生型ANXA1相比，N端28-30位3个氨基酸缺失的ANXA1明显抑制肿瘤的移动、侵袭和转移。

[0134] 实施例1：ANXA1的N端20-30位氨基酸多肽抗鼻咽癌作用

[0135] 本发明实施例所采用的目的肽序列为ANXA1的N端20-30位氨基酸序列连接常用穿膜肽TAT的序列：

[0136] Tyr-Gly-Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Glu-Tyr-Val-Gln-Thr-Val-Lys-Ser-Ser-Lys-Gly,单字母序列为YGRKKRRQRRR-EYVQTVKSSKG，纯度为95％以上，水溶性好，由苏州强耀生物公司合成。

[0137] 图8A上为多肽设计图。TAT连接ANXA1的N端20-30位氨基酸序列[A1(20-30)]为目的肽，序列为YGRKKRRQRRREYVQTVKSSKG，纯度96％以上。对照肽TAT序列为YGRKKRRQRRR，纯度96％以上。设计的多肽由苏州强耀生物公司合成。

[0138] 图8A下为多肽细胞穿透性实验：取96孔板，毎孔接种4×104个5-8F鼻咽癌细胞，分别加入浓度为5μM的FITC标记的TAT和A1(20-30)，多肽加入到细胞培养基中1小时后，4％多聚甲醛固定，DAPI染核，荧光显微镜下观察拍照。结果显示，A1(20-30)能进入细胞。

[0139] 图8B为A1(20-30)对鼻咽癌细胞中EphA2水平的影响。取六孔板，接种5-8F鼻咽癌细胞，24小时后分别加入对照肽和A1(20-30)，设置剂量梯度2.5μM、5μM和10μM，24小时后WB检测EphA2水平。结果显示，A1(20-30)呈剂量依赖性下调EphA2蛋白水平。

[0140] 图8C为A1(20-30)抑制鼻咽癌细胞ANXA1与EphA2的结合，增加EphA2与Cbl结合增加。在5-8F和HK1鼻咽癌细胞中分别加入对照肽和A1(20-30)(浓度10μM)，处理24小时后，提取细胞中蛋白，EphA2免疫共沉淀实验，WB检测ANXA1和Cbl的水平。

[0141] 图8D为A1(20-30)增加鼻咽癌细胞EphA2的泛素化降解。在5-8F和HK1鼻咽癌细胞中分别加入对照肽和A1(20-30)(浓度10μM)，处理24小时后，免疫共沉淀实验检测EphA2的泛素化水平。

[0142] 图8E为A1(20-30)增加鼻咽癌细胞EphA2的内吞(降解)。取24孔板内置无菌玻片，接种4×104个5-8F鼻咽癌细胞，分别加入浓度为10μM的对照肽和A1(20-30)，多肽加入到细胞培养基中1小时后，用4％多聚甲醛固定细胞，进行EphA2和Cbl免疫荧光染色，取出玻片固定在载玻片上，用激光共聚焦显微镜观察拍照。

[0143] 图8F为CCK8检查A1(20-30)对鼻咽癌细胞增殖的影响。在5-8F和HK1鼻咽癌细胞中分别加入浓度为10μM的对照肽和A1(20-30)，毎24小时更换新鲜的多肽，采用CCK8试剂盒检查细胞增殖。结果显示，A1(20-30)显著抑制鼻咽癌细胞的增殖。

[0144] 图8G为EdU标记和软琼脂集落形成实验检查A1(20-30)对鼻咽癌细胞增殖的影响。在5-8F和HK1鼻咽癌细胞中分别加入浓度为10μM的对照肽和A1(20-30)，毎24小时更换新鲜的多肽，采用EdU试剂盒和软琼脂集落形成实验检查细胞增殖。结果显示，A1(20-30)显著抑制鼻咽癌细胞的增殖。上图为实验结果，下图为统计学分析。Student-T检验，**P<0.01，***P<
0.001。

[0145] 图8H为A1(20-30)抑制鼻咽癌细胞的移动和侵袭能力。在5-8F和HK1鼻咽癌细胞中分别加入浓度为10μM的对照肽和A1(20-30)，毎24小时更换新鲜的多肽，采用细胞划痕愈合实验和Transwell细胞侵袭实验检查细胞的移动和侵袭。结果显示，A1(20-30)显著抑制细胞的迁移和侵袭能力。上图为实验结果，下图为统计学分析。Student-T检验,**P<0.01，***P<0.001。

[0146] 图8I为A1(20-30)抑制5-8F和HK1鼻咽癌细胞的小鼠皮下移植瘤生长。左图为小鼠皮下移植瘤，中图为皮下移植瘤生长曲线，右图为皮下移植瘤平均重量。Student-T检验,***P<0.001。

[0147] 图8J为小鼠皮下移植瘤EphA2和ANXA1免疫组化染色。结果显示，A1(20-30)显著降低移植瘤组织中EphA2的表达。左图为免疫组化染色，右图为ANXA1和EphA2免疫组化评分的统计学分析。Student-T检验,***P<0.001，ns，无统计学差异。

[0148] 1.小鼠皮下移植瘤多肽实验

[0149] 1)动物、细胞和试剂

[0150] 雌性BALB/c-nu小鼠，SPF级，4周左右，在无菌条件下饲养。人鼻咽癌5-8F和HK1细胞在37℃、5％CO2中培养，培养液为含10％胎牛血清的PRML-1640培养基。多肽由苏州强耀生物公司合成。在无菌操作台中进行溶解配置并分装，储存于-80℃冰箱，溶解后的多肽在一周内用完。

[0151] 2)皮下移植瘤接种

[0152] 收集对数生长期的鼻咽癌细胞，用无血清的PRML-1640培养基调整浓度为1×107个/ml。在雌性BALB/c-nu小鼠皮下注射200μl细胞悬液，即每只小鼠皮下注射2×106个细胞。6天后，将小鼠随机分成两组，分别腹腔注射200μl(终浓度为10mg/kg)A1(20-30)或对照肽，每天注射一次，10天为一周期，每天测量瘤体，治疗后10天取出瘤体，称量瘤体的重量。

[0153] 3)统计分析

[0154] 通过公式体积＝1/2×最短径2×最长径，计算瘤体积。用Student-T检验比较实验组和对照组之间的瘤体积和瘤重，P<0.05为差异具有统计学意义。实验结果表明，A1(20-30)能明显抑制BALB/c-nu小鼠鼻咽癌皮下移植瘤的生长。

[0155] 表1.A1(20-30)多肽和TAT对照肽对5-8F鼻咽癌细胞裸鼠皮下移植瘤生长的影响[0156]

[0157] 表中数据为肿瘤体积(mm3)

[0158] 表2.A1(20-30)多肽和对照肽对HK1鼻咽癌细胞裸鼠皮下移植瘤生长的影响[0159]

[0160] 表中数据为肿瘤体积(mm3)

[0161] 表3.A1(20-30)多肽和对照肽治疗5-8F和HK1鼻咽癌细胞裸鼠皮下移植瘤的瘤重[0162]

[0163] 2.免疫组化染色实验：将从小鼠皮下取出的瘤组织用4％福尔马林固定后，用石蜡包埋，切片。将石蜡切片进行脱蜡水化处理后，将切片浸没在3％过氧化氢中10分钟以阻断内源过氧化物酶活性。为了阻断抗体的非特异性结合，将切片在室温下与10％非免疫山羊血清孵育15分钟。随后，将切片与ANXA1抗体或EphA2抗体一起孵育在4℃下过夜，然后在室温下与生物素二抗一起孵育30分钟，并用DAB(3，3-二氨基联苯胺)染色。最后，用苏木素染核。在阴性对照中，用正常小鼠或兔IgG代替主要抗体。用显微镜观察拍照。阳性反应定义为在细胞质和/或细胞膜上显示褐色信号的阳性反应。染色强度分为无0，弱1，中度2，强3；染色细胞百分比为无染色＝0，染色细胞<30％＝1，染色细胞30～60％＝2，染色细胞>60％＝3。染色评分为染色强度+染色细胞百分比。