一株暹罗芽孢杆菌及其应用

摘要

本发明提供一株暹罗芽孢杆菌及其应用，属于微生物防治技术领域。经研究发现，本发明提供的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)LZ88在烟草赤星病、烟草黑胫病、小麦赤霉病、葡萄炭疽病、黄瓜枯萎病和花生镰刀病等植物病害的生物防治、诱导烟草植株病害抗性等方面具有非常好的效果，为烟草主要病害赤星病等生物防治提供了新的菌种资源，因此具有良好的实际应用之价值。

权利要求

1.暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）LZ88，该菌株已于2019年9月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏号为CGMCC No.18466。

2.含有权利要求1所述暹罗芽孢杆菌LZ88或/和权利要求1所述暹罗芽孢杆菌LZ88的发酵液的微生物菌剂、病原菌抑制剂或病害抑制剂。

3.权利要求2所述病原菌抑制剂的应用，其特征在于：所述应用为对下述全部或部分病原菌具有抑制作用：烟草赤星病菌、烟草黑胫病菌、小麦赤霉病菌、葡萄炭疽病菌、黄瓜枯萎病菌和花生镰刀病菌。

4.权利要求2所述病害抑制剂的应用，其特征在于：所述病害为下述全部或部分病害：烟草赤星病、烟草黑胫病、小麦赤霉病、葡萄炭疽病、黄瓜枯萎病和花生镰刀病。

5.权利要求1所述暹罗芽孢杆菌LZ88或/和权利要求1所述暹罗芽孢杆菌LZ88的发酵液在抑制病原菌或/和在制备病原菌抑制剂中的应用；

所述病原菌为下述全部或部分病原菌：烟草赤星病菌、烟草黑胫病菌、小麦赤霉病菌、葡萄炭疽病菌、黄瓜枯萎病菌和花生镰刀病菌。

6.权利要求1所述暹罗芽孢杆菌LZ88或/和权利要求1所述暹罗芽孢杆菌LZ88的发酵液诱发烟草产生病害抗性中的应用，其特征在于，所述诱发烟草产生病害抗性包括提高烟草中过氧化物酶和多酚氧化酶含量。

7.一种防治烟草赤星病的方法，其特征在于，所述方法包括向烟草植株表面和/或周围土壤中喷施权利要求1所述暹罗芽孢杆菌LZ88、权利要求1所述暹罗芽孢杆菌LZ88的发酵液或/和权利要求2所述微生物菌剂。

说明书

一株暹罗芽孢杆菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物防治技术领域，具体涉及一株暹罗芽孢杆菌及其应用。

背景技术

[0002] 公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技
术。

[0003] 烟草赤星病是一类由链格孢菌(Alternaria Alternata)引起的烟株成熟后期病害。该病1892年首次在美国发现。自报道以来，烟草赤星病的危害日趋严重，在世界各烟区
发生普遍，曾几次给世界烟叶生产造成严重的经济损失。1956年开始在北卡罗莱纳州暴发
流行，造成北卡罗来纳州烟草种植者每年损失390至2100万美元。2000年美国康涅狄格州和
马塞诸塞州均大规模暴发烟草赤星病，使得两州烟草分别减产75％和89％。我国1916年在
北京地区首次发现烟草赤星病，80年代以来，全国各烟区有日益严重的趋势。1992年是特大
的流行年，黄淮烟区损失很大，河南烟区发病面积为70万亩，其中10万亩是毁灭性的，共减
产5000万公斤，产值损失和人民币1亿元左右。现已成为制约我国烟草生产的主要真菌病害
之一。因此，对于烟草赤星病的防治刻不容缓。

[0004] 目前在烟叶实际生产中，培育和选用抗赤星病品种是最经济有效的方法，也是从根本上解决烟草赤星病病害的重要防治措施，然而至今仍未有合适的抗赤星病的优良品
种，在大田中，赤星病的发生还是很普遍。在防治上大多采用化学防治的方法。化学防治虽
为理想的防治手段，但是许多用于控制植物真菌和细菌疾病的化学物质对动物和人类健康
都是有害的。同时化学农药的残留，以及用药单一导致的抗药性增强，化学防治已经不能作
为最合适的手段，因此需要更安全环保的生物防治剂代替这些化学药剂。

[0005] 目前，用于防治烟草赤星病的拮抗菌已有报道，如枯草芽孢杆菌(CN 201110093415.4)、链霉菌(CN 201710280079.1)防卫假单胞菌(CN 201810438730.8)、球孢
白僵菌(CN 201811059565.1)等，然而，由于单一菌株的局限性和致病菌的同步进化等原
因，还需要寻找新的菌株用于烟草赤星病等相关植物病害的防治。

发明内容

[0006] 基于上述现有技术的不足，本发明提供一株具有抑制烟草赤星病等多种病原菌的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)LZ88，经研究发现，其在烟草赤星病等植物病害的生
物防治、诱导烟草植株抗性等方面具有非常好的效果，为烟草主要病害赤星病等生物防治
提供了新的菌种资源，因此具有良好的实际应用之价值。

[0007] 为实现上述技术目的，本发明涉及以下技术方案：

[0008] 本发明的一个方面，提供一株暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)LZ88，该菌株已于2019年9月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北
京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCC No.18466。

[0009] 所述暹罗芽孢杆菌LZ88的代谢物也属于本发明的保护范围。

[0010] 本发明的第二个方面，提供一种微生物菌剂，其含有所述暹罗芽孢杆菌LZ88和/或含暹罗芽孢杆菌LZ88的代谢物。

[0011] 上述微生物菌剂具体可以是病原菌抑制剂或病害抑制剂。

[0012] 上述病原菌抑制剂的活性成分可以是暹罗芽孢杆菌LZ88和/或暹罗芽孢杆菌LZ88的代谢物，上述病原菌抑制剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述病原
菌抑制剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对病原菌的抑制效果确定。

[0013] 上述病害抑制剂的活性成分可以是暹罗芽孢杆菌LZ88和/或暹罗芽孢杆菌LZ88的代谢物，上述病害抑制剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述病害抑制
剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对病害的抑制效果确定。

[0014] 本发明的第三个方面，上述暹罗芽孢杆菌LZ88和/或暹罗芽孢杆菌LZ88的代谢物在如下1)-4)中全部或部分中的应用也是本发明保护的范围：

[0015] 1)在抑制病原菌中的应用；

[0016] 2)在制备病原菌抑制剂中的应用；

[0017] 3)在制备病害抑制剂中的应用；

[0018] 4)在抑制病害中的应用。

[0019] 上文中，所述病原菌可以为下述全部或部分病原菌：烟草赤星病菌(Alteraria alternata)、烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)、小麦赤霉病菌
(FusaHum graminearum Sehw)、葡萄炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz)、
黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum.sp.cucumebrium Owen)和花生镰刀病菌(Fusarium 
roseum Link)。

[0020] 上文中，所述病害可以为下述全部或部分病害：烟草赤星病、烟草黑胫病、小麦赤霉病、葡萄炭疽病、黄瓜枯萎病和花生镰刀病。

[0021] 本发明的第四个方面，上述暹罗芽孢杆菌LZ88和/或暹罗芽孢杆菌LZ88的代谢物在促进植物生长和/或诱发植物产生病害抗性中的应用也属于本发明的保护范围。

[0022] 进一步的，所述诱发植物产生病害抗性包括提高植物(如植物叶片)中过氧化物酶和多酚氧化酶含量。

[0023] 上述应用中，所述植物可为下述任一种植物：

[0024] P1)种子植物；

[0025] P2)双子叶植物；

[0026] P3)茄科植物；

[0027] P4)烟草。

[0028] 本发明的第五个方面，提供一种促进烟草生长的方法，所述方法包括向烟草植株表面和/或周围土壤中喷施上述暹罗芽孢杆菌LZ88、暹罗芽孢杆菌LZ88的代谢物和/或微生
物菌剂。

[0029] 本发明的有益技术效果：

[0030] 本发明首次筛选获得的暹罗芽孢杆菌LZ88对农业生产发生严重的六种植物病原菌具有显著的拮抗作用，抑菌谱广，尤其对烟草赤星病具有较强的防控效果，同时能够诱导
烟草植株产生赤星病病害抗性，促进烟草植株生长，表明该菌株在植物病害的生物防治领
域具有广阔的应用前景。

附图说明

[0031] 构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

[0032] 图1为本发明实施例1中暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)LZ88 16S rDNA基因序列系统发育树。

[0033] 图2为本发明实施例2中暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)LZ88抑菌谱实验，其中，(A)烟草赤星病菌(Alteraria alternata)、(B)烟草黑胫病菌(Phytophthora 
parasitica var.nicotianae)、(C)小麦赤霉病菌(FusaHum graminearum Sehw)、(D)葡萄
炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz)、(E)黄瓜枯萎病菌(Fusarium 
oxysporum.sp.cucumebrium Owen)、(F)花生镰刀病菌(Fusarium roseum Link)。、

[0034] 图3为本发明实施例3中挥发性物质抑菌活性测定图，其中，(A)对照CK；(B)菌株LZ88。

[0035] 图4为本发明实施例4中菌株LZ88无菌滤液可以有效抑制链格孢菌菌丝生长和孢子形成图，其中，(A)在PDA培养基平板上观察链格孢菌的生长状况图；(B)通过显微观察链
格孢菌菌丝生长和孢子形成图；所有实验均进行三次，结果相似获得。

[0036] 图5为本发明实施例5中菌株LZ88发酵液粗提蛋白抑菌作用图。

[0037] 图6为本发明实施例5中不同温度处理后蛋白粗提液抑菌活性图；其中，(A)平板上烟草赤星病菌的生长情况；(B)不同温度处理后粗提液的抑菌率。

[0038] 图7为本发明实施例6中烟叶过氧化物酶(POD)活性变化图。

[0039] 图8为本发明实施例6中烟叶多酚氧化酶(PPO)活性变化图。

[0040] 图9为本发明实施例7中菌株LZ88对烟草赤星病的防治效果图；其中，(A)处理7d后植株发病情况；(B)烟草叶片发病症状。

具体实施方式

[0041] 应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通
常理解的相同含义。

[0042] 需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数
形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或
“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

[0043] 如前所述，虽然用于防治烟草赤星病的拮抗菌已有报道，然而，由于单一菌株的局限性和致病菌的同步进化等原因，还需要寻找新的菌株用于烟草赤星病等相关病害的防
治。

[0044] 有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一株暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)LZ88，该菌株已于2019年9月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微
生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCC No.18466。

[0045] 本发明的又一具体实施方式中，所述暹罗芽孢杆菌LZ88的代谢物也属于本发明的保护范围。

[0046] 本发明的又一具体实施方式中，所述暹罗芽孢杆菌LZ88的代谢物可以从暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)LZ88的发酵液中获得。暹罗芽孢杆菌LZ88的代谢产物具体可按
照如下方法制备：将所述暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)LZ88接种于液体发酵培养基
中进行发酵培养，除去液体培养物(发酵液)中的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)LZ88
即得到暹罗芽孢杆菌LZ88的代谢物。

[0047] 其中，所述液体发酵培养基优选为NB培养基。

[0048] 发酵培养条件具体为：在26～30℃(优选为28℃)培养20～30h(优选为24h)，转速：120-180rpm(优选为150rpm)。

[0049] 所述NB培养基配方为(g/L)为：蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌15min。

[0050] 本发明的又一具体实施方式中，提供一种微生物菌剂，其含有所述暹罗芽孢杆菌LZ88和/或含暹罗芽孢杆菌LZ88的代谢物。

[0051] 本发明的又一具体实施方式中，上述微生物菌剂具体可以是病原菌抑制剂或病害抑制剂。

[0052] 本发明的又一具体实施方式中，上述病原菌抑制剂的活性成分可以是暹罗芽孢杆菌LZ88和/或暹罗芽孢杆菌LZ88的代谢物，上述病原菌抑制剂的活性成分还可含有其他生
物成分或非生物成分，上述病原菌抑制剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对病原菌
的抑制效果确定。

[0053] 本发明的又一具体实施方式中，上述病害抑制剂的活性成分可以是暹罗芽孢杆菌LZ88和/或暹罗芽孢杆菌LZ88的代谢物，上述病害抑制剂的活性成分还可含有其他生物成
分或非生物成分，上述病害抑制剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对病害的抑制效
果确定。

[0054] 本发明的又一具体实施方式中，上述暹罗芽孢杆菌LZ88和/或暹罗芽孢杆菌LZ88的代谢物在如下1)-4)中全部或部分中的应用也是本发明保护的范围：

[0055] 1)在抑制病原菌中的应用；

[0056] 2)在制备病原菌抑制剂中的应用；

[0057] 3)在制备病害抑制剂中的应用；

[0058] 4)在抑制病害中的应用。

[0059] 本发明的又一具体实施方式中，所述病原菌可以为下述全部或部分病原菌：烟草赤星病菌(Alteraria alternata)、烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica 
var.nicotianae)、小麦赤霉病菌(FusaHum graminearum Sehw)、葡萄炭疽病菌
(Colletotrichum  gloeosporioides  Penz)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium 
oxysporum.sp.cucumebrium Owen)和花生镰刀病菌(Fusarium roseum Link)。

[0060] 本发明的又一具体实施方式中，所述病害可以为下述全部或部分病害：烟草赤星病、烟草黑胫病、小麦赤霉病、葡萄炭疽病、黄瓜枯萎病和花生镰刀病。

[0061] 本发明的又一具体实施方式中，所述微生物菌剂中，除所述活性成分外，还含有载体。所述载体可为农药领域常用的且在生物学上是惰性的载体。

[0062] 所述载体可为固体载体或液体载体；

[0063] 所述固体载体可为矿物材料、植物材料或高分子化合物；所述矿物材料可为粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述植物材料可为玉米粉、
豆粉和淀粉中的至少一种；所述高分子化合物可为聚乙烯醇或/和聚二醇；

[0064] 所述液体载体可为有机溶剂、植物油、矿物油或水；所述有机溶剂可为癸烷或/和十二烷。

[0065] 所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

[0066] 根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。

[0067] 本发明的又一具体实施方式中，上述暹罗芽孢杆菌LZ88和/或暹罗芽孢杆菌LZ88的代谢物在促进植物生长和/或诱发植物产生病害抗性中的应用也属于本发明的保护范
围。

[0068] 本发明的又一具体实施方式中，所述诱发植物产生病害抗性包括提高植物(如植物叶片)中过氧化物酶和多酚氧化酶含量。

[0069] 本发明的又一具体实施方式中，上述应用中，所述植物可为下述任一种植物：

[0070] P1)种子植物；

[0071] P2)双子叶植物；

[0072] P3)茄科植物；

[0073] P4)烟草。

[0074] 本发明的又一具体实施方式中，提供一种促进烟草生长的方法，所述方法包括向烟草植株表面和/或周围土壤中喷施上述暹罗芽孢杆菌LZ88、暹罗芽孢杆菌LZ88的代谢物
和/或微生物菌剂。

[0075] 以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

[0076] 实施例1菌株LZ88鉴定

[0077] 以菌株LZ88基因组DNA为模板，利用细菌16S  rDNA通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，SEQ ID NO.1)和1492R(5’-TACGGYTACCTTG TTACGACTT-3’,SEQ 
ID NO.2)扩增16S rDNA序列。扩增体系及程序：25μL的PCR体系中包含5×PCR缓冲液5.0μL，
DNA模板(100ngμL-1)1.0μL，dNTPs(10mM)0.75μL，正向引物(10μM)0.75μL，反向引物(10μM)
0.75μL，MgCl2(25mM)2.5μL，Taq DNA聚合酶(5UμL-1 Promega)0.25μL，其余部分ddH2O补齐。
PCR扩增程序为94℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，30个循环。
最后，72℃延伸10min，4℃保存。反应结束后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。将获得
的片段进行测序分析。利用MEGA7.0软件构建系统进化树。

[0078] 如图1所示，NJ系统发育树显示LZ88与Bacillus siamensis聚在同一分支上，基因序列相似性为99.72％。基于序列相似性和系统发育分析，并结合其生理生化指标，将细菌
分离物LZ88鉴定为Bacillus siamensis。

[0079] 实施例2暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)LZ88抑菌能力测定

[0080] LZ88菌株分离自烟草根际土壤，采用对峙培养法测定其对烟草赤星病的抑菌活性，用灭菌打孔器打取已活化好的病原菌菌饼，先将病原菌菌饼接在新鲜的PDA平板中央，
再将拮抗菌点接在距离菌饼2.5cm处，以仅接菌饼的平板为对照。放入28℃恒温培养箱倒置
培养。5d后，测量处理和对照的菌落直径，并计算抑菌率。结果显示菌株LZ88对烟草赤星病
(Alteraria alternata)、烟草黑胫病(Phytophthora parasitica var.nicotianae)、小麦
赤霉病(FusaHum graminearum Sehw)、葡萄炭疽病(Colletotrichum gloeosporioides 
Penz)、黄瓜枯萎病(Fusarium oxysporum.sp.cucumebrium Owen)和花生镰刀病(Fusarium 
roseum Link)均具有非常显著的拮抗作用(图2)。

[0081] 实施例3挥发性抑菌物质抑菌活性的测定

[0082] 挥发性物质活性测定采用平板对扣法。于PDA平板中心接种赤星病菌菌饼，同时在NA平板上划线接种菌株LZ88，将两个培养皿口对扣，并用封口膜封上，同时设置不接拮抗菌
LZ88的平板为对照，置于28℃恒温培养箱培养，7d后，观察对照和处理的生长情况。在培养
时应该注意，要把接种病原菌的平板放在上方，接种拮抗菌LZ88的平板放在下方。

[0083] 实验结果表明，在平板上，拮抗菌株LZ88的挥发性物质可以有效抑制烟草赤星病菌的生长，对照中赤星病菌已长满整个平板，实验组中赤星病菌的生长明显受到了抑制，且
抑菌效果明显。(图3)。

[0084] 实施例4菌株LZ88无菌滤液抑菌活性测定

[0085] 将菌株LZ88发酵液于8000r/min离心10min后收集上清，在无菌条件使用0.22μm细菌微孔滤膜过滤上清液除菌，滤液用于代谢产物活性测定。采用生长速率法，取1mL滤液与
15m灭菌冷却至60℃的PDA培养基混合均匀制成平板，以添加等量无菌水代替滤液的平板作
为对照，将直径为0.5cm生长旺盛的植物病原菌菌饼接种在平板上。每个处理重复3次。置于
28℃恒温培养，待对照长满后，测量对照和处理的菌落直径，计算抑菌率。结果如图4所示，
无菌滤液可以显著抑制病原菌的生长，在显微镜下观察孢子生长情况，可以看出添加了无
菌滤液的培养基上孢子量明显变少，说明无菌滤液产生的抑菌物质可以有效抑制孢子的形
成。

[0086] 实施例5菌株LZ88蛋白粗提液抑菌活性测定

[0087] 将菌株LZ88在NB培养基中发酵培养3d后，8500r/min离心15min，收集上清，上清用细菌过滤器 除菌体，得到无菌发酵滤液。按每100mL发酵液中加入51.6g硫酸
铵的比例，冰水浴中缓慢加入硫酸铵，4℃静置过夜后1000r/min，4℃离心15min，去上清，收
集沉淀。沉淀用0.02mol/L的磷酸缓冲液(PH＝7.2)溶解,在20mmol/LTris-HCl缓冲液(PH9.0)
中4℃过夜透析除盐(透析袋截留分子量为14000Da)。透析液用细菌过滤器 过
滤除去杂质后即为蛋白粗提液。然后测定蛋白粗提液的抑菌活性。

[0088] 实验结果表明，蛋白粗提液可以有效抑制链格孢菌的生长。如图5所示，在混合了蛋白粗提液的培养基上，赤星病菌的生长明显受到了抑制，用PBS处理的平板和空白对照都
没有抑菌作用，说明起主要抑菌作用物质的是蛋白类物质。如图6，不同温度处理后的粗提
液仍具有抑菌活性，甚至在120℃下蛋白仍没有发生变性。说明蛋白粗提液有较好的稳定
性，受温度影响较小。

[0089] 实施例6菌株LZ88诱发烟草的系统抗性

[0090] 为了评价菌株LZ88诱导的烟草叶片的系统抗性，分别检测了抗性相关酶POD及PPO的活性。菌株LZ88在NB培养液中发酵后，菌悬液浓度调整为OD600值0.3，喷雾在长出10片烟
叶的烟株上，分别测量喷雾的当天和第1、3、5、7、9及12d后的过氧化物酶(POD)和多酚氧化
酶(PPO)活性变化，以NB培养液的处理作对照。

[0091] 烟草叶片粗提液的制备：称取用菌株LZ88发酵液处理过的烟叶片和空白对照烟叶各0.1g，将烟叶上的主脉去除后,放入研钵,研钵中加入少量的蒸馏水和石英砂，待研磨充
分后用蒸馏水定容至10mL。然后于4℃下离心,收集的上清液将用于检测酶的活性。

[0092] 6.1过氧化物酶(POD)活性测定取粗提液1mL、0.2mol/L醋酸缓冲液(PH5.0)1mL、1％邻甲氧基苯酚1mL。摇匀后,于30℃的水浴锅中,5min后加入双氧水溶液1mL，反应到2min
时用紫外分光光度计测OD470值。以每克鲜组织每分钟OD470值变化0.01为一个酶活性单位。

[0093] 6.2多酚氧化酶(PPO)活性测定取酶液1mL，加0.02mol/L邻苯二酚溶液1.5mL、0.05mol/L磷酸缓冲液(PH6.8)1.5mL。混合液摇匀后置于30℃的水浴锅中，2min后用紫外分
光光度计测量OD398值。

[0094] 实验结果表明，用菌株LZ88发酵液处理过的烟叶内的过氧化物酶和多酚氧化酶的含量均高于对照组，如图7和图8所示，发酵液处理后的烟叶内过氧化物酶(POD)含量在3d内
迅速提高，随后开始下降；而多酚氧化酶(PPO)含量在5d内达到最大值，随后又迅速下降。在
空白对照中，两种酶的活性变化随时间的变化均不明显，表明菌株LZ88发酵液可以在一段
时间内提高烟草抗性相关酶POD、PPO的活性，说明菌株LZ88的发酵液可能会诱导烟株对烟
草赤星病的抗性。

[0095] 实施例7温室中菌株LZ88的生物防治效果

[0096] 对于温室试验，使用烟草品种K326作为试验植物。待烟草长至5～6片叶进行喷药处理。将菌株Bacillus siamensis LZ88发酵液浓度调整到OD600为0.1。均匀的喷施烟草叶
片，共喷施三次，每隔三天喷施一次，以NB培养液喷施为对照。每个处理10株烟苗。第三次喷
施24h后采用注射法接种烟草赤星病。每株烟苗接种两片烟叶，每片烟叶注射接种6处。接病
后首先黑暗处理8h，之后按照16h光照，8h黑暗进行培养。接病后第5天开始调查病情，计算
病情指数和防病效果。根据GB/T 23222—2008国家烟草赤星病病害分级标准进行调查(以
叶片为单位)。按0-9级分级，分级标准如下(以叶片为单位)：

[0097] 0级：叶片无病斑；

[0098] 1级：病斑面积占叶片面积的1％以下；

[0099] 3级：病斑面积占叶片面积的2％～5％；

[0100] 5级：病斑面积占叶片面积的6％～10％；

[0101] 7级：病斑面积占叶片面积的11％～20％；

[0102] 9级：病斑面积占叶片面积的21％以上。

[0103] 病情指数和拮抗菌的生物防治效果计算如下：

[0104] 病情指数＝[∑(各级病叶数×该病级值)/(调查总叶数×最高级值)]×100

[0105] 防治效果＝[(对照病情指数-每个处理病情指数)/对照病情指数]×100％

[0106] 温室盆栽试验结果表明Bacillus siamensis LZ88对烟草赤星病有显著的抑制作用。与对照相比，LZ88处理的植株比对照组的病情指数低9.45，防效达80.98％(表1)。如图9
所示，与对照相比，用Bacillus siamensis LZ88发酵液处理过的烟苗，病害的发生程度较
弱。对照中，接病叶片发病症状明显，且病斑较大。用LZ88处理过的植株几乎没有发病，生长
状况良好。以上试验结果表明，Bacillus siamensis LZ88可以作为有效防治烟草赤星病的
生物防治剂。

[0107] 表1菌株LZ88对烟草赤星病的防病作用

[0108]

[0109]

[0110] 最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然
可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发
明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围
之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所
属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创
造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。