玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1及其编码基因和应用

摘要

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1及其编码基因和应用。玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1，通过将野生型玉米赤霉烯酮水解酶ZH607的第136‑142位氨基酸突变得到。本发明的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1的酶活力是野生型的2.9倍，因此，本发明高酶活力突变体能够满足能源、食品和饲料等领域中对于玉米赤霉烯酮降解活性的要求，具有广阔的应用前景。

权利要求

1.玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1通过将野生型玉米赤霉烯酮水解酶ZH607的第136‑142 位氨基酸由ASVTGME突变为DILLHIH得到，其中，所述野生型玉米赤霉烯酮水解酶ZH607的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1基因，其特征在于，编码权利要求1所述的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1。

3.根据权利要求2所述的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.包含权利要求2所述的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1基因的重组表达载体。

5.包含权利要求2所述的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1基因的重组菌株。

6.制备权利要求1所述的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）用包含玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1编码基因的重组表达载体转化宿主细胞，获得重组菌株；

（2）培养重组菌株，诱导表达玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1；

（3）分离并纯化所表达的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1。

7.权利要求1所述的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1用于水解玉米赤霉烯酮的应用。

说明书

玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1及其编码基因和应用

技术领域

[0001] 本发明属于农业生物技术领域，具体涉及玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1及其编码基因和应用。

背景技术

[0002] 玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)又被称为F‑2毒素，它是由多种镰刀菌属产生的非甾体、具有类雌激素性质的霉菌毒素。ZEN的雌激素效应毒性不仅仅表现在损害雌性动物
生殖能力，而且能引起雄性动物生殖系统的损害。此外，高剂量ZEN还具有肝肾毒性、肠道毒
性、免疫毒性及其霉菌毒素的联合毒性，严重危害动物健康。

[0003] 微生物降解法消除ZEN污染是利用微生物在代谢过程中产生的酶与ZEN作用，破坏ZEN分子的毒性基团，使其被降解或转化为无毒产物的过程。生物降解法降解ZEN专一性强、
ZEN分子被转化效率高、不会引起环境污染，并且能够保留饲料原有营养价值。但目前所发
现的玉米赤霉烯酮水解酶活性均较低，阻碍了玉米赤霉烯酮水解酶的大规模工业化生产及
应用。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1。

[0005] 本发明的再一目的在于提供上述突变体的编码基因。

[0006] 本发明的再一目的在于提供含有上述编码基因的重组表达载体。

[0007] 本发明的再一目的在于提供含有上述编码基因的重组菌株。

[0008] 本发明的再一目的在于提供上述玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1的制备方法。

[0009] 本发明的再一目的在于提供上述玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1的应用。

[0010] 根据本发明的具体实施方式，所述玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1通过将野生型玉米赤霉烯酮水解酶ZH607的第136‑142位氨基酸由ASVTGME突变为DILLHIH得到，其中，
野生型玉米赤霉烯酮水解酶ZH607的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

[0011] MSTTRATKTVTTKDGIKWHVEQEGNGPDIVLVPDGLGECQMFDKPMSIIAASGFRVTTFDMPGMSRSRDAPPETYRDVTGHKLAGYVDTLLEELKIPIASVWGCSSGATTVLALCAAFPERVRNAMPHELPTVNPASVTGMEEKDP
AVISQEMAAVSRSISGGTEAWDALGPEVHARLHDNYVRWARGYPVTIPPSAPTKSEVLHKRPVDWTVGGGTPTAMFF
DNIVIAVKEGLNIGLLPGGHFPYVSHPEAFAEYVVETCRKYI

[0012] 玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

[0013] MSTTRATKTVTTKDGIKWHVEQEGNGPDIVLVPDGLGECQMFDKPMSIIAASGFRVTTFDMPGMSRSRDAPPETYRDVTGHKLAGYVDTLLEELKIPIASVWGCSSGATTVLALCAAFPERVRNAMPHELPTVNPDILLHIHEKDP
AVISQEMAAVSRSISGGTEAWDALGPEVHARLHDNYVRWARGYPVTIPPSAPTKSEVLHKRPVDWTVGGGTPTAMFF
DNIVIAVKEGLNIGLLPGGHFPYVSHPEAFAEYVVETCRKYI

[0014] 玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：

[0015] ATGTCCACCACCAGAGCCACCAAGACTGTTACCACCAAGGATGGAATTAAGTGGCATGTTGAGCAAGAAGGAAACGGTCCAGACATTGTGTTGGTTCCAGATGGTTTGGGTGAGTGTCAAATGTTTGATAAGCCCATGTCCATTAT
TGCAGCCTCCGGTTTTAGAGTCACTACCTTTGATATGCCAGGTATGAGTAGATCCAGAGATGCTCCTCCAGAAACTT
ACAGAGATGTTACCGGTCATAAGCTGGCTGGTTACGTTGACACTTTGCTTGAGGAATTGAAGATTCCAATTGCTTCT
GTTTGGGGTTGTTCCTCTGGTGCTACTACTGTTCTGGCCTTGTGTGCTGCTTTTCCAGAAAGAGTTAGAAATGCCAT
GCCACACGAGTTGCCAACTGTTAACCCAGATATTTTACTTCATATTCATGAGAAGGACCCTGCTGTTATTTCTCAAG
AAATGGCTGCTGTTTCAAGATCAATTAGTGGTGGTACTGAAGCCTGGGATGCTTTAGGACCAGAAGTTCATGCTAGA
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TTTGCATAAGAGACCAGTTGATTGGACAGTTGGTGGTGGTACCCCAACTGCTATGTTTTTTGATAATATTGTCATCG
CTGTCAAGGAAGGTTTGAACATTGGTTTGTTGCCAGGTGGTCATTTCCCATACGTTTCTCATCCTGAAGCTTTTGCT
GAATACGTTGTTGAGACTTGTAGAAAGTACATTTAA

[0016] 上述序列包含终止子，共798bp。

[0017] 本发明还提供包含上述编码基因的重组表达载体，优选为pPICZ(α)A‑zh607‑AH。

[0018] 本发明还提供包含上述编码基因的重组菌株，优选为毕赤酵母X33(pPICZ(α)A‑zh607‑AH)。

[0019] 根据本发明具体实施方式的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1的制备方法，包括以下步骤：

[0020] (1)用包含玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1编码基因的重组表达载体转化宿主细胞，获得重组菌株；

[0021] (2)培养重组菌株，诱导表达玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1；

[0022] (3)分离并纯化所表达的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1。

[0023] 本发明还提供上述玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1的应用，尤其是在能源、食品和饲料领域。

[0024] 本发明的有益效果：

[0025] 本发明的玉米赤霉烯酮水解酶突变体ZHDM1的酶活力由野生型的4940U/mg提高到了14419U/mg，是野生型的2.9倍，因此，本发明高酶活力突变体能够满足能源、食品和饲料
等领域中对于玉米赤霉烯酮降解活性的要求，具有广阔的应用前景。

附图说明

[0026] 图1显示赤霉烯酮水解酶野生型及突变体在毕赤酵母X33中表达后的SDS‑PAGE电泳检测结果。

具体实施方式

[0027] 1、菌株及载体：本发明的表达宿主Pichia pastoris X33，表达质粒载体pPICZ(α)A。

[0028] 2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrog公司，其它都为国产试剂。

[0029] 3、大肠杆菌培养基LLB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl，pH自然)。毕赤酵母培养基YPD(Yeast Extract 1％,Trytone 2％，Glucose 2％pH自然)；BMGY(Yeast 
Extract 1％,Trytone 2％,YNB10％,生物素0.1％,pH自然)；BMMY(Yeast Extract 1％，
Trytone 2％，甲醇0.5％，YNB 10％，生物素0.1％，pH自然)。

[0030] 说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书
进行。

[0031] 实施例1含野生型赤霉烯酮水解酶基因的重组菌株X33(pPICZ(α)A‑zh607)的制备

[0032] 1.1扩增赤霉烯酮水解酶蛋白野生型ZH607的核酸序列zh607

[0033] 经密码子优化后，得到赤霉烯酮水解酶ZH607的编码基因zh607。采用PCR的方法扩增zh607基因及载体pPICZ(α)A核酸片段，通过重组试剂盒将两者连接，获得重组质粒pPICZ
(α)A‑zh607，并转化毕赤酵母X33，获得重组毕赤酵母菌株X33(pPICZ(α)A‑zh607)。

[0034] PCR所用引物如下：

[0035] 表1野生型赤霉烯酮水解酶及载体扩增特异性引物

[0036]

[0037] 其中，zh607‑pPICZ(α)A‑F及zh607‑pPICZ(α)A‑R用于扩增赤霉烯酮水解酶野生型ZH607的基因编码序列；pPICZ(α)A‑zh607‑F及pPICZ(α)A‑zh607‑R用于扩增可与zh607基因
重组的pPICZ(α)A载体核酸片段。

[0038] 扩增结束后，将PCR产物进行核酸电泳检测，zh607和pPICZ(α)A条带大小分别为835bp和3579bp(加引物)，分别回收纯化。

[0039] 1.2构建重组菌株X33(pPICZ(α)A‑zh607)

[0040] 将回收的zh607与pPICZ(α)A基因片段通过试剂盒重组酶进行重组连接，然后将重组产物转化大肠杆菌TransⅠ感受态，并涂布于LLB(含100μg/mL zeocin)进行筛选。

[0041] 待测序正确后，利用SacI限制性内切酶将重组质粒pPICZ(α)A‑zh607进行酶切，回收产物电击转化毕赤酵母感受态细胞X33进行诱导表达，得到重组表达菌株X33(pPICZ(α)
A‑zh607)。

[0042] 实施例2含突变型赤霉烯酮水解酶基因的重组菌株X33(pPICZ(α)A‑zh607‑AH)的制备

[0043] 2.1重组质粒pPICZ(α)A‑zh607‑AH的构建

[0044] 经优化突变位点设计为将136‑142位的ASVTGME替换为DILLHIH，通过点突变试剂盒的方法引入突变位点，并对其进行测序验证，获得赤霉烯酮水解酶突变质粒pPICZ(α)A‑
zh607‑AH。所用引物如表2所示：

[0045] 表2突变体玉米赤霉烯酮水解酶特异性引物

[0046]

[0047] 2.2构建重组菌株X33(pPICZ(α)A‑zh607‑AH)

[0048] 利用SacI将重组质粒pPICZ(α)A‑zh607‑AH进行酶切，回收产物电击转化毕赤酵母感受态细胞X33进行诱导表达，得到重组表达菌株X33(pPICZ(α)A‑zh607‑AH)。

[0049] 实施例3赤霉烯酮水解酶蛋白野生型ZH607及突变体ZHDM1的获得

[0050] 3.1蛋白ZH607及ZHDM1的诱导表达

[0051] 将得到的重组表达菌株X33(pPICZ(α)A‑zh607)及X33(pPICZ(α)A‑zh607‑AH)接种至YPD培养基中进行种子培养，200rpm，30℃培养48h后，以1％接种量转接至BMGY培养基中，
200rpm，30℃培养48h，富集足够的菌体后收集菌体并加入到含有1％甲醇的BMMY培养基中
进行诱导表达。

[0052] 2.蛋白ZH607及ZHDM1的纯化

[0053] 将诱导表达后的菌液12000rpm，10min离心，收集上清进行浓缩，再用10mM磷酸氢二钠溶液(柠檬酸调pH至7.6)进行透析，然后将透析后的酶液进行离子交换层析，A液为
10mM磷酸氢二钠溶液(柠檬酸调pH至7.6)，B液为A液加1M Nacl，纯化蛋白，收集洗脱液，进
行SDS‑PAGE，蛋白ZH607及ZHDM1蛋白纯化结果见图1。

[0054] 实施例4玉米赤霉烯酮水解酶ZH607及突变体ZHDM1的活性检测

[0055] 诱导表达后对玉米赤霉烯酮水解酶ZH607及突变体ZHDM1进行纯化及酶活的测定。

[0056] 酶活的测定方法(ZEN由DMSO溶)：

[0057]

[0058]

[0059] 37℃反应0.5h，加入800μL DMSO终止反应。

[0060] 终止反应后通过HPLC检测对照组及实验组ZEN剩余峰面积。

[0061] 酶活力单位(U)：在37℃，反应0.5h条件下，在1h内能转化1μg ZEN的酶量。

[0062] 酶活计算(每毫升酶液所含酶活力单位)：反应体系中ZEN初始含量*(对照组峰面积‑实验组峰面积)/对照组峰面积*2*稀释倍数*10。

[0063] 在pH8.0,35℃的最适条件下对纯化的玉米赤霉烯酮水解酶ZH607和突变体ZHDM1进行比活性测定。经HPLC检测，ZH607的比活力为4940U/mg,突变体ZHDM1的比活力为
14419U/mg，经定点突变，突变体ZHDM1的酶活力是野生型的2.9倍。

[0064] 实施例5玉米赤霉烯酮水解酶野生型和突变体的基本特性

[0065] 诱导表达后对ZH607、ZHDM1粗酶液进行纯化并测定基本性质。

[0066] 在pH 5.0‑11.0，37℃的条件下测定，ZH607、ZHDM1的最适pH,反应时间为30min,使用的缓冲液为：130mM的Na2HPO4‑柠檬酸缓冲液(pH 5.0‑7.0)、130mM的Tris‑HCl(pH 8.0)和
130mM的甘氨酸‑NaOH(pH 9.0‑11.0)。为测定pH稳定性，将纯化后的酶液在37℃,pH 5.0的
条件下孵育1h,在标准条件下(pH 8.0，37℃，反应30min)测定其剩余活性。反应测定具体方
法如实施例4所示。

[0067] 在25℃‑55℃的温度范围，pH 8.0的条件下反应30min测定温度对纯化ZH607、ZHDM1活性的影响。

[0068] 结果显示，ZH607、ZHDM1的最适pH为8.0，最适温度均为35℃。