人GPD2基因抑制剂及其应用

摘要

本发明公开了人GPD2基因抑制剂及其应用，具体是以人GPD2基因为目标，通过选取合适的靶基因序列，以RNA干扰的方式设计出具有高效抑制GPD2基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞特别是乳腺癌肿瘤细胞的增殖的核酸分子、重组载体以及慢病毒等抑制剂，提供了人GPD2基因在筛选肿瘤治疗药物、制备肿瘤治疗药物或制备肿瘤诊断药物中的应用，丰富了肿瘤治疗途径。

权利要求

1.人GPD2基因抑制剂，其特征在于：所述抑制剂是以人GPD2基因中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列为靶点设计的核酸分子；

所述核酸分子为SEQ ID NO：2所示的shRNA。

2.一种重组载体，其特征在于：包含能够转录权利要求1所述的人GPD2基因抑制剂的序列，所述序列嵌入载体中。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述载体为慢病毒载体。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于：所述慢病毒载体可以选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一种。

5.一种慢病毒，其特征在于：由权利要求2所述的重组载体经细胞包装后得到。

6.权利要求1所述的人GPD2基因抑制剂、权利要求2所述的重组载体或权利要求5所述的慢病毒在制备乳腺癌治疗药物或制备乳腺癌诊断药物中的应用。

7.一种预防或治疗乳腺癌的药物，其特征在于：包含1～99wt％权利要求1或2任一项所述的人GPD2基因抑制剂、权利要求3所述的重组载体或权利要求6所述的慢病毒，以及药学上可接受的载体。

说明书

人GPD2基因抑制剂及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及人GPD2基因抑制剂及其应用。

背景技术

[0002] RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指内源性或外源性双链RNA介导的细胞内mRNA发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失。它可高效、特异地阻断体内特定基因的表达，导致其降解，从而引起生物体内特异基因的沉默，使细胞表现出某种基因表型的缺失，是近年来新兴的一种常用的研究基因功能、寻找疾病治疗方法的实验室技术。目前，RNAi特异性的抑制基因表达，已应用于基因病、病毒感染性疾病、癌症的基因治疗等方面。

[0003] 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤性疾病，严重威胁妇女的生命健康。每年大约1,676,600名新的乳腺癌患者被发现，521,900名乳腺癌病人死亡，占癌症总数的25％，死亡人数占15％。与其他同类型的癌症类似，这种疾病的病因学被认为是多步骤的遗传和表观遗传的过程，包括癌基因激活和抑癌基因的失活等。正常基因突变或过表达导致乳腺癌，如HER2。建立这一亚型的分子发病机制及识别潜在的治疗靶点是提高乳腺癌的治疗效果的关键点。

[0004] GPD2(glycerol-3-phosphate dehydrogenase 2)定位于线粒体内膜，并催化甘油-3-磷酸转变为二羟丙酮磷酸。目前，GPD2与肿瘤相关研究极少，有研究发现，GPD2在前列腺癌Gleason评分GP3后GP4基质中表达差异有显著性；还有研究发现乳腺癌和癌旁GPD2免疫染色具有显著差异，癌的免疫染色显著高于癌旁；干扰GPD2的表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231有抑制其增殖的作用。基于以上研究，推测GPD2的表达可能与肿瘤的发生发展有一定联系。

发明内容

[0005] 针对上述现有技术，本发明的一个目的是提供人GPD2基因抑制剂的应用，具体是人GPD2基因抑制剂在筛选肿瘤治疗药物、制备肿瘤治疗药物或制备肿瘤诊断药物中的应用，特别是在针对乳腺癌的肿瘤中。

[0006] 本发明的另一个目的是提供一种抑制人GPD2基因的重组载体，使其以RNA干扰方式稳定并特异地下调GPD2基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞特别是乳腺癌肿瘤细胞的增殖。

[0007] 本发明的另一个目的是提供一种抑制人GPD2基因的慢病毒，使其以RNA干扰方式稳定并特异地下调GPD2基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞特别是乳腺癌肿瘤细胞的增殖。

[0008] 本发明的另外一个目的是提供所述重组载体和慢病毒在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用，特别是针对乳腺癌的肿瘤中。

[0009] 本发明的另外一个目的是提供一种预防或治疗肿瘤的药物，使其以RNA干扰方式稳定并特异地下调GPD2基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞特别是乳腺癌肿瘤细胞的增殖。

[0010] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

[0011] 人GPD2基因抑制剂，是以人GPD2基因中SEQ ID NO：1所示核苷酸序列为靶点设计的核酸分子，

[0012] 所述核酸分子为siRNA或shRNA，其中，所述siRNA中含有能够与GPD2基因中SEQ IDNO：1所示核苷酸序列杂交的核苷酸序列，所述shRNA中含有能够与GPD2基因中SEQ IDNO：1所示杂交的核苷酸序列。

[0013] 所述siRNA的核苷酸序列，具体如下：以GPD2基因为模板，设计多个19-21nt RNA干扰靶点序列。经过评估，选取以下序列作为干扰靶点：TGTATTAGAGAGTATCAAT(SEQID NO：1)。

[0014] 所述核酸分子为shRNA，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体如下：5’-CCGGCGTGTATTAGAGAGTATCAATCTCGAGATTGATACTCTCTAATACACGTTTTTG-3’，其中下划线部分表示茎环结构的序列。

[0015] 本发明以人GPD2基因为目标，选择其中合适的靶序列，以此为基础可筛选或制备出能够高效特异性抑制GPD2基因的转录或翻译，或能够高效特异性抑制GPD2蛋白的表达或活性的分子，从而进一步抑制肿瘤细胞的生长、增殖、分化、存活等，而所述分子即肿瘤治疗或预防药物。

[0016] 具体地，所述抑制剂优选为shRNA。shRNA包括正义链和反义链，以及连接正义链和反义链的茎环结构(loop)，所述正义链和反义链互补，且所述正义链序列包含与人GPD2基因中15-27个连续核苷酸序列相同的RNA序列。在本发明中，所述正义链核苷酸序列包含与如SEQID NO：1所示核苷酸序列相同的RNA序列，所述正义链核苷酸序列如SEQ ID NO：2任所示。

[0017] 基于上述技术思路，本发明还提供了多种人GPD2的抑制剂，包括：

[0018] 一种重组载体，包含能够转录出本发明所述核酸分子的序列以及载体，所述序列嵌入载体中。

[0019] 进一步地，所述载体为慢病毒载体。更进一步地，所述慢病毒载体包含启动子和/或编码被检测到的标记物的核苷酸序列。

[0020] 所述慢病毒载体可选用本领域公知载体，通过试剂公司即可购得。比如：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ等。

[0021] 一种慢病毒，由上述重组载体经细胞包装后得到。

[0022] 将本发明所述慢病毒处理乳腺癌MDA-MB-231细胞，检测GPD2基因的沉默效率和抑制MDA-MB-231细胞增殖能力，结果显示，经过本发明所述慢病毒处理的MDA-MB-231细胞GPD2mRNA(shGPD2)的表达水平下调了96.4％，同时增殖速度显著减缓，表面下调GPD2基因表达后肿瘤细胞的增殖速度明显降低。

[0023] 通过免疫组织化学的方法检测GPD2基因在肿瘤组织、正常组织和肿瘤周围正常组织中的表达水平。申请人发现GPD2基因在肿瘤组织中的表达量显著高于正常组织和肿瘤周围正常组织。提示GPD2基因可能作为一种癌基因，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，GPD2基因的表达水平可能成为肿瘤诊断的标志物。如图1-10所示，申请人检测发现GPD2基因在多种肿瘤高表达，具体包括：乳腺癌、宫颈鳞状细胞癌与宫颈腺癌、胆管癌、结肠腺癌、淋巴样肿瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤、肺鳞状细胞癌、胰腺癌、直肠腺癌、胃腺癌及胸腺癌。

[0024] 基于此，本发明提供了所述核酸分子、所述重组载体或所述慢病毒在制备预防或治疗肿瘤的药物中的应用。优选地，所述肿瘤为乳腺癌、宫颈鳞状细胞癌与宫颈腺癌、胆管癌、结肠腺癌、淋巴样肿瘤弥漫性大B细胞淋巴癌、肺鳞状细胞癌、胰腺癌、直肠腺癌、胃肠癌或胸腺癌。

[0025] 基于上述应用，本发明还提供了一种预防或治疗肿瘤的药物，包含本发明所述核酸分子、所述重组载体或所述慢病毒，以及药学上可接受的赋形剂。

[0026] 进一步地，所述赋形剂选自载体、稀释剂、湿润剂、乳化剂、防腐剂、甜味剂中的一种或两种以上。更进一步地，所述赋形剂选自糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水中的一种或两种以上。

[0027] 进一步地，所述药物为片剂、丸剂、粉剂或溶液剂。

[0028] 本发明以人GPD2基因为目标，通过选取合适的靶基因序列，以RNA干扰的方式设计出具有高效抑制GPD2基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞特别是乳腺癌肿瘤细胞的增殖的核酸分子、重组载体以及慢病毒等抑制剂，提供了人GPD2基因在筛选肿瘤治疗药物、制备肿瘤治疗药物或制备肿瘤诊断药物中的应用，丰富了肿瘤治疗途径。

附图说明

[0029] 图1为GPD2基因在宫颈鳞状细胞癌与宫颈腺癌高表达。

[0030] 图2为GPD2基因在胆管癌高表达。

[0031] 图3为GPD2基因在肺鳞状细胞癌高表达。

[0032] 图4为GPD2基因在结肠腺癌高表达。

[0033] 图5为GPD2基因在淋巴样肿瘤弥漫性大B细胞淋巴癌高表达。

[0034] 图6为GPD2基因在乳腺癌高表达。

[0035] 图7为GPD2基因在胃肠癌高表达。

[0036] 图8为GPD2基因在胸腺癌高表达。

[0037] 图9为GPD2基因在胰腺癌高表达。

[0038] 图10为GPD2基因在直肠癌高表达。

[0039] 图11为GV115载体质粒图谱。

[0040] 图12为RNA干扰载体构建及阳性克隆鉴定示意图。

[0041] 图13为阳性克隆的PCR鉴定电泳图，泳道1为阴性对照(ddH2O)，泳道2为自连对照(空载体自连对照组)，泳道3为250bp Marker(从上至下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp)泳道4-8为单克隆psc26940-1,2,3,4,5。

[0042] 图14为阴性对照和本发明慢病毒对乳腺癌MDA-MB-231细胞中GPD2mRNA的表达水平的影响的试验结果，其中纵坐标英文表示GPD2mRNA的表达水平，横坐标英文表示对照(shCtrl)和本发明慢病毒(shGPD2)。

[0043] 图15为MTT法检测阴性对照和本发明慢病毒对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖能力的影响的试验结果。

[0044] 图16为MTT法检测阴性对照和本发明慢病毒对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖能力的影响的试验结果。

具体实施方式

[0045] 本发明公开了人GPD2基因的抑制剂以及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述产品和应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0046] 在具体实施方式中，本发明的设计思路为：

[0047] 从Genbank中调取人GPD2基因序列，选取合适的靶序列，即shRNA靶点；合成针对GPD2基因的有效shRNA靶点序列、两端含酶切位点粘端的单链DNA Oligo；慢病毒载体双酶切后与单链DNAOligo连接，构建表达GPD2基因shRNA的RNAi质粒，即重组载体；将RNAi质粒和慢病毒包装需要的辅助载体，产生重组慢病毒颗粒，即可制得高效沉默GPD2基因的慢病毒。

[0048] 基于上述方法，本发明提供了5个干扰GPD2基因的有效靶点(具体如SEQIDNO：1所示)，构建了特异干扰人GPD2基因的慢病毒。

[0049] 本发明发现，利用慢病毒介导的RNAi方法，在降低GPD2基因在肿瘤细胞中的表达后，可以有效抑制肿瘤细胞的增殖。本发明研究表明，GPD2基因是一个原癌基因，可促进肿瘤细胞增殖，在肿瘤发生和发展中具有重要的生物学功能，GPD2基因可以为肿瘤治疗的靶标，慢病毒介导的GPD2基因特异性沉默可作为肿瘤治疗的一种新手段。

[0050] 下面就本发明提供的人GPD2基因的抑制剂及其应用做详细说明。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件，如[美]Sambrook.J等著，黄培堂等译，分子克隆试验指南，第三版，北京科学出版社2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

[0051] 实施例1

[0052] 抑制人GPD2基因慢病毒载体的构建

[0053] 1、RNA干扰靶点设计及双链DNA oligo制备

[0054] (1)筛选人GPD2基因抑制剂的靶点

[0055] 从Genbank调取GPD2(NM_000408)基因信息；根据RNA干扰序列设计原则，选取得到针对GPD2基因有效的shRNA干扰靶点，具体为TGTATTAGAGAGTATCAAT(SEQ ID NO：1)。

[0056] (2)DNA oligo序列合成

[0057] 根据已选靶点序列设计shRNA干扰序列，并在两端添加合适的限制性内切酶酶切位点以完成载体构建。除此之外，在正链3’端添加TTTTT终止信号，而反链5’端添加终止信号互补序列。设计完成后送捷瑞公司合成单链DNA oligo。

[0058]

[0059] 其中：CCGG为AgeI酶切位点；AATTC为EcoRI酶切位点；G为EcoRI酶切位点互补序列。

[0060] (3)双链DNA oligo制备

[0061] 将合成的单链DNA oligo干粉溶解于退火缓冲液中(终浓度20μM)，90℃水浴15min。自然冷却至室温后，形成带粘性末端的双链。

[0062] 2、线性化载体制备

[0063] 按照NEB说明书配制50μL反应体系，使用AgeI和EcoRI双酶切GV115载体(图11所示)使其线性化。

[0064]

[0065] 37℃(最适温度)反应1h，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段，之后切胶回收目的片段。

[0066] 3、RNA干扰慢病毒载体构建

[0067] (1)连接

[0068] 按照Fermentas T4DNA Ligase说明书配制20μL反应体系，将双链DNA oligo与线性化的载体相连。

[0069]

[0070] 于16℃反应1h-3h，连接产物命名为psc26940，之后进行转化实验。

[0071] (2)转化

[0072] 将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，详细操作步骤如下：

[0073] 步骤1，将10μL连接产物psc26940加入到100μL大肠杆菌感受态细胞中，冰浴30min。

[0074] 步骤2，42℃热激90sec，冰浴2min。

[0075] 步骤3，加入500μL无抗生素的LB液体培养基，200rpm于37℃摇床震荡培养1hr。

[0076] 步骤4，取150μL菌液均匀涂抹在含有Amp的LB固体培养基上，于37℃培养箱中过夜培养。

[0077] (3)阳性克隆的PCR鉴定

[0078] 在连接转化产物长出菌克隆表面取样，作为模板；在以慢病毒载体中RNAi序列的上下游，设计通用PCR引物，进行PCR鉴定实验。

[0079] RNA干扰载体构建及阳性克隆鉴定示意图如图12所示。

[0080] 引物如下：

[0081]

[0082] PCR扩增条件如下：

[0083] 按下表配制20μL PCR反应体系，用无菌枪头挑取单个菌落为模板，进行PCR扩增，反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，22次循环；72℃5min。PCR结束后，取5μL产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测条带。

[0084]

[0085] 琼脂糖凝胶电泳图片如图13所示，保存鉴定结果正确的克隆，并进行测序。

[0086] 对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的针对SEQ ID NO：1有效shRNA靶点序列的表达RNAi的载体，该载体可转录出如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

[0087] 以鉴定引物-F进行阳性克隆测序，挑选测序结果与目标序列完全一致的克隆用于下一步实验。

[0088] psc26940测序结果为(SEQ ID NO：5)：

[0089] TTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGCGTGTATTAGAGAGTATCAATCTCGAGATTGATACTCTCTAATACACGTTTTTAATTCTCGACCTCGAGACAAATGGCAGTATTCATCCACGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTT(shRNA干扰序列插入片段用下划线标注，其中AgeI酶切位点被破坏)。

[0090] 4、质粒抽提

[0091] 将测序正确的菌液转接于150mL含Amp抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养过夜。按照EndoFree Maxi Plasmid Kit说明书提取质粒，质检合格的质粒进入下游流程。

[0092] 详细操作步骤如下：

[0093] 1.8000rpm离心4min收集菌体。

[0094] 2.加入7mL P1，震荡混匀；

[0095] 3.加入7mL P3，颠倒混匀6～8次，静置5min；

[0096] 4.加入7mL P4，颠倒混匀6～8次，冰浴10min；

[0097] 5.9000rpm离心10min，将上清转移到过滤器CS中，过滤后加入10mL异丙醇混匀；

[0098] 6.向吸附柱中加入2.5mL的平衡液BL，8000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将柱子放回备用；

[0099] 7.将上清分两次倒入吸附柱中，8000rpm离心2min，弃废液；

[0100] 8.向吸附柱中加入10mL漂洗液PW(已加入无水乙醇)，相同转速离心2min，弃废液，重复该步骤一次；

[0101] 9.向吸附柱中加入3mL无水乙醇，8000rpm离心2min，弃废液；

[0102] 10.9500rpm空甩5min，除去残留的漂洗液；

[0103] 11.将吸附柱转移至一新的白管中，在柱中心滴加800μL洗脱缓冲液TB(先预热)，室温放置5min，然后9500rpm离心2min；

[0104] 12.将管中的洗脱液转移到一干净的1.5mL EP管中，-20℃保存；

[0105] 13.取样电泳，使用分光光度计(Thermo_Nanodrop 2000)测定质粒浓度，质检。

[0106] 14.将质检合格的质粒转交下游平台进行病毒包装。

[0107] 实施例2

[0108] 实时荧光定量RT-PCR法检测GPD2基因的沉默效率

[0109] 处于对数生长期的乳腺癌MDA-MB-231细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×104/mL)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(MOI，RKO：10)值，加入适宜量的实施例1制备的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到4天后，收集细胞。根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书，抽提总RNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书，将RNA逆转录获得cDNA(逆转录反应体系见下表，42℃反应1h)然后在70℃水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活。

[0110] 逆转录反应体系

[0111]试剂 体积(μL)
5×RTbuffer 4.0
10mMdNTPs 2.0
RNasin 0.5
M-MLV-RTase 1.0
DEPCH2O 3.5
Total 11.0

[0112] 采用TP800型Real time PCR仪(TAKARA)进行实时定量检测。RRS1基因的引物如下：上游引物5’-TGGTGGCAGTTACCTTACTACT-3’(SEQ  ID NO：6)和下游引物5’-CAAGGGCTCTTGATTTGCTGA-3’(SEQ ID NO：7)。以管家基因G A P D H为内参，引物序列如下：上游引物5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’(SEQ  ID  NO：8)和下游引物5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’(SEQ ID NO：9)。按下表中的比例配置反应体系。

[0113] Real-time PCR反应体系

[0114]试剂 体积(μL)
SYBRpremixextaq 10.0
上游引物(2.5μM) 0.5
下游引物(2.5μM) 0.5
cDNA 1.0
ddH2O 8.0
Total 20.0

[0115] 设定程序为两步法Real-time PCR：预变性95℃，15s；之后每一步变性95℃，5s；退火延伸60℃，30s；共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持
4s,同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用2-ΔΔCt分析法计算侵染了GPD2mRNA的表达丰度。侵染对照病毒的细胞(shCtrl)作为对照。实验结果(图14)表明，乳腺癌MDA-MB-231细胞中GPD2mRNA(shGPD2)的表达水平下调了96.4％。

[0116] 实施例3

[0117] MTT法检测肿瘤细胞感染慢病毒的增殖能力

[0118] 将乳腺癌MDA-MB-231细胞胰酶消化后接种于12孔板中，细胞密度为10-15％。第二天换为新鲜的培养基，内含5μg/ml polybrene。将实施例1的慢病毒按照侵染复数(MOI，RKO：10)值加入到培养板中，感染12-24h后换新鲜的培养基。感染72h后，荧光显微镜下观察荧光，感染效率达到90％。

[0119] 将处于对数生长期的感染病毒后的细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液；接种于96孔板，每孔100μL；置37℃、5％CO2培养箱培养；培养终止前4h加入10μL 5mg/mL的MTT；弃培养液后加100mL DMSO终止反应；酶标仪490nm检测OD值；采用软件SPSS12.0对数据进行统计绘图；

[0120] 如图15和图16的MTT比色法结果所示，与侵染对照病毒的对照组(shCtrl)相比，RNA干扰降低GPD2基因的表达(shGPD2)后，肿瘤细胞数目的增加速度显著降低，表明：下调GPD2基因表达后肿瘤细胞的增殖速度明显降低。