一种yebN基因改造的重组菌株及其构建方法与应用

摘要

本发明公开了一种多核苷酸序列以及包括该多核苷酸序列的产重组菌株，是对大肠杆菌中的yebN基因进行点突变形成，改造后的基因序列如SEQ ID NO:2所示。该重组菌株与未突变的野生型菌株相比，有利于生产高浓度的L‑苏氨酸，且菌株稳定性好，作为L‑苏氨酸生产菌株能够进一步降低生产成本。

权利要求

1.核苷酸序列在L-苏氨酸制备中的应用，所述核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的yebN基因编码序列第74位碱基发生突变而形成的核苷酸序列，所述突变为SEQ ID NO:1中第74位碱基由鸟嘌呤（G）突变为腺嘌呤（A）。

2.根据权利要求1的应用，所述突变后的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.重组蛋白在L-苏氨酸制备中的应用，所述重组蛋白由权利要求1所述的突变后的核苷酸序列编码。

4.根据权利要求3的应用，所述重组蛋白为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

5.重组载体在L-苏氨酸制备中的应用，所述重组载体包括SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求5的应用，所述重组载体是将所述核苷酸序列导入质粒构建而成。

7.重组菌株在L-苏氨酸制备中的应用，所述重组菌株含有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

8.根据权利要求7的应用，所述重组菌株是将包括SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的重组载体导入宿主菌株中重组形成；所述宿主菌株选自大肠杆菌。

9.根据权利要求8的应用，所述宿主菌株为E. coli W3110或E. coli CGMCC 7.232菌株。

10.根据权利要求9的应用，包括采用所述重组菌株进行发酵，制备得到L-苏氨酸。

说明书

一种yebN基因改造的重组菌株及其构建方法与应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种yebN基因改造的重组菌株及其构 建方法与应用。

背景技术

[0002] L-苏氨酸是八大必需氨基酸之一，在人和动物的生长发育中发挥着重要作用，被广泛应 用于饲养业、食品业以及医疗业等方面。

[0003] 目前，L-苏氨酸生产主要有化学合成法、蛋白水解法和微生物发酵法和酶法，其中蛋白 质水解法和化学合成法因其存在种种弊端，工业化生产中已经基本不再使用，酶法生产具有 专一性高、产品单一、易于精制的特点，但所需酶难以获得，制约了酶法的应用。微生物发 酵法生产成本低、资源节约、对环境污染小，是目前工业生产L-苏氨酸的主要方式。国外从 1960年代开始有采用直接发酵法生产L-苏氨酸的报道，目前国内外均采用基因工程菌进行生 产，大多数氨基酸生产菌株是通过随机诱变的方法发展提高的，但是通过诱变而改变的基因 是随机分布的，因此会产生较多副产物，不易获得高产菌株。因此仍然存在对开发以高产率 更经济地生产L-苏氨酸的方法的需要。

发明内容

[0004] 本发明提供一种核苷酸序列，其包括SEQ ID NO:1所示的野生型yebN基因编码序列第 74位碱基发生突变而形成的核苷酸序列。

[0005] 根据本发明，所述突变为SEQ ID NO:1中第74位碱基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)； 具体地，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。所述突变是指所述位点的碱基/核苷酸发生 变化，所述突变方法可以选自诱变、PCR定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。

[0006] 本发明提供如上所述的多核苷酸序列编码的重组蛋白。

[0007] 根据本发明的重组蛋白，其包括如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；具体地，所述重组 蛋白包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列第25位的甘氨酸被天门冬氨酸取代。

[0008] 本发明提供包括上述核苷酸序列或重组蛋白的重组载体。

[0009] 根据本发明的重组载体，是将上述核苷酸序列导入质粒构建而成；作为一个实施方案， 所述质粒为pKOV质粒。具体地，可以将所述核苷酸序列和所述质粒通过内切酶进行酶切， 形成互补的粘性末端，将二者连接构建成重组载体。

[0010] 本发明进一步提供一种重组菌株，其含有编码序列发生点突变的yebN基因编码核苷酸序 列，例如所述SEQ ID NO:1中第74位碱基发生点突变。

[0011] 根据本发明的重组菌株，所述yebN基因编码核苷酸序列包括SEQ ID NO:1中第74位碱 基由鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)的突变。

[0012] 作为本发明的一个实施方案，其含有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

[0013] 作为本发明的一个实施方案，其含有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

[0014] 根据本发明的重组菌株，是将上述重组载体导入宿主菌株中重组形成；所述宿主菌株没 有特别的限定，可以选自本领域已知的保留yebN基因的产L-苏氨酸菌株，例如选自大肠杆 菌。作为本发明的一个实施方案，所述宿主菌株为E.coli K12、其衍生菌株E.coli K12(W3110) 菌株、或者E.coli CGMCC 7.232菌株。

[0015] 根据本发明的重组菌株，是以pKOV质粒为载体。

[0016] 根据本发明的重组菌株，其可以进一步包括或者不包括其他改造。

[0017] 本发明提供一种重组菌株的构建方法，包括如下步骤：

[0018] 改造如SEQ ID NO:1所示的野生型yebN基因编码区的核苷酸序列，使其第74位碱基发 生突变，得到包含突变yebN编码基因的重组菌株。

[0019] 根据本发明的构建方法，所述改造包括诱变、PCR定点突变法、和/或同源重组等方法中 的至少一种。

[0020] 根据本发明的构建方法，所述突变是指SEQ ID NO:1中第74位碱基由鸟嘌呤(G)突变 为腺嘌呤(A)；具体地，所述突变后的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

[0021] 进一步地，所述构建方法包括如下步骤：

[0022] (1)改造如SEQ ID NO:1所示的野生型yebN基因开放阅读框区域的核苷酸序列，使其 第74位碱基发生突变，得到突变的yebN基因开放阅读框区域核苷酸序列；

[0023] (2)将所述突变的核苷酸序列与质粒连接，构建重组载体；

[0024] (3)将所述重组载体导入宿主菌株，得到所述包含点突变的重组菌株。

[0025] 根据本发明的构建方法，所述步骤(1)包括：点突变的yebN基因编码区构建，即根据 yebN基因编码序列，合成两对扩增yebN基因编码区片段的引物，通过PCR定点突变法在野 生型yebN基因编码区(SEQ ID NO:1)中引入点突变，得到点突变的yebN基因编码区核苷 酸序列(SEQ ID NO:2)，记为yebN(G74A)。

[0026] 在本发明的一个实施方案中，所述步骤(1)中，所述引物为：

[0027] P1:5'CGGGATCCCTTCGCCAATGTCTGGATTG 3'(划线部分为限制性内切酶酶切位点 BamH I)(SEQ ID NO:5)

[0028] P2:5'ATGGAGGGTGGCATCTTTAC 3'(SEQ ID NO:6)

[0029] P3:5'TGCATCAATCGGTAAAGATG 3'(SEQ ID NO:7)

[0030] P4:5'AAGGAAAAAAGCGGCCGCCAACTCCGCACTCTGCTGTA 3'(划线部分为限制性内 切酶酶切位点Not I)(SEQ ID NO:8)

[0031] 在本发明的一个实施方案中，所述步骤(1)包括：以E.coli K12为模板，分别以引物P1 和P2、P3和P4，进行PCR扩增，获得两条含有点突变的yebN基因编码区分离的大小为690bp 和700bp DNA片段(yebN(G74A)-Up和yebN(G74A)-Down片段)。将上述两条DNA片段经琼脂 糖凝胶电泳分离纯化后，再以上述两条DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过重叠PCR 扩增(Overlap PCR)，获得yebN(G74A)-Up-Down片段。

[0032] 在本发明的一个实施方案中，所述yebN(G74A)-Up-Down片段核苷酸序列大小为1340bp。

[0033] 在本发明的一个实施方案中，所述PCR扩增按如下方式进行：94℃变性30s，52℃退火 30s，以及72℃延伸30s(30个循环)。

[0034] 在本发明的一个实施方案中，所述重叠PCR扩增按如下方式进行：94℃变性30s，52℃ 退火30s，以及72℃延伸60s(30个循环)。

[0035] 根据本发明的构建方法，所述步骤(2)包括重组载体的构建，将上述yebN(G74A)-Up-Down 片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化，然后将其和pKOV质粒分别用BamH I/Not I双酶切，将酶 切后的yebN(G74A)-Up-Down片段和pKOⅤ质粒经琼脂糖凝胶电泳分离纯化并连接，获得重组 载体pKOV-yebN(G74A)。

[0036] 根据本发明的构建方法，所述步骤(3)包括重组菌株的构建：将重组载体pKOV-yebN(G74A)导入宿主菌株，得到重组菌株。

[0037] 在本发明的一个实施方案中，所述步骤(3)的导入为电转化法。

[0038] 根据本发明的构建方法，还进一步包括筛选重组菌株的步骤；示例性地，采用含氯霉素 的培养基进行筛选。

[0039] 本发明还提供如上所述的构建方法所获得的重组菌株。

[0040] 本发明提供如上所述的核苷酸序列、重组蛋白、重组载体、重组菌株在L-苏氨酸制备中 的应用。

[0041] 根据本发明所述的重组菌株在L-苏氨酸制备中的应用，包括采用所述重组菌株进行发酵， 制备得到L-苏氨酸。

[0042] 有益效果

[0043] 本发明通过对产苏氨酸的菌株中yebN基因编码序列引入点突变，获得重组型菌株，所获 得的菌株与未突变的野生型菌株相比，有利于生产高浓度的L-苏氨酸，且菌株稳定性好，作 为L-苏氨酸生产菌株能够进一步降低生产成本。

具体实施方式

[0044] 以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。但本领域技术人员了解，本发明的保护 范围不仅限于以下实施例。根据本发明公开的内容，本领域技术人员将认识到在不脱离本发 明技术方案所给出的技术特征和范围的情况下，对以上所述实施例做出许多变化和修改都属 于本发明的保护范围。

[0045] 实施例1构建用于yebN基因编码区定点突变(G74A)(对应编码蛋白的氨基酸序列第25位 甘氨酸被天冬氨酸取代G25D)的质粒pKOV-yebN(G74A)

[0046] YEBN酶由yebN基因编码，在E.coli K12菌株及其衍生菌株(如W3110等)中，野生型 的yebN基因ORF序列如Genbank登录号为AP009048.1中序列1907402-1907968所示。依据 该序列设计并合成两对扩增yebN的引物，构建载体用于将出发菌株中yebN基因编码区序列 第74位碱基G变为A。引物设计如下(由上海invitrogen公司合成)：

[0047] P1:5'CGGGATCCCTTCGCCAATGTCTGGATTG 3'(划线部分为限制性内切酶酶切位点 BamH I)(SEQ ID NO:5)

[0048] P2:5'ATGGAGGGTGGCATCTTTAC 3'(SEQ ID NO:6)

[0049] P3:5'TGCATCAATCGGTAAAGATG 3'(SEQ ID NO:7)

[0050] P4:5'AAGGAAAAAAGCGGCCGCCAACTCCGCACTCTGCTGTA 3'(划线部分为限制 性内切酶酶切位点Not I)(SEQ ID NO:8)

[0051] 构建方法为：以野生型菌株E.coli K12基因组为模板，分别以引物P1和P2，P3和P4进行 PCR扩增，获得含有点突变的、长度分别为690bp和700bp的两条DNA片段(yebN(G74A)-Up和 yebN(G74A)-Down片段)。PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL， Mg2+(25mM)4μL，引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL，所述PCR按如 下方式进行：94℃变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸30s(30个循环)。将上述两条DNA片 段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化后，再以纯化后的两条DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通 过Overlap PCR扩增出长度约为1340bp的片段(yebN(G74A)-Up-Down片段)。

[0052] PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL，引物 (10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL，所述Overlap PCR按如下方式进行：94℃ 变性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸60s(30个循环)。

[0053] 将上述yebN(G74A)-Up-Down片段经琼脂糖凝胶电泳分离纯化，然后将其和pKOV质粒(购自 Addgene公司)分别用BamH I/Not I双酶切，将酶切后的yebN(G74A)-Up-Down片段和pKOV质粒经 琼脂糖凝胶电泳分离纯化并连接，获得载体pKOV-yebN(G74A)。将载体pKOV-yebN(G74A) (G74A) (G74A)送测序 公司进行测序鉴定，将含有正确的点突变(yebN )的载体pKOV-yebN 保
存备用。

[0054] 实施例2包含点突变基因yebN(G74A)的工程菌株的构建

[0055] 野生型大肠杆菌菌株E.coli K12(W3110)和高产L-苏氨酸的菌株E.coli CGMCC 7.232(保 藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心)的染色体上均保留了野生型的yebN基因。将构建好的 质粒pKOV-yebN(G74A)分别转入E.coli K12(W3110)和E.coli CGMCC 7.232，通过等位基因置 换，将这两个菌株染色体中的yebN基因序列第74位碱基G变为A。

[0056] 具体过程为：将质粒pKOV-yebN(G74A)通过电击转化转入宿主菌感受态细胞后加入0.5mL 的SOC液体培养基；在30℃、100rpm的摇床中复苏2h；取100μL培养液涂布于氯霉素含量为 34μg/mL的LB固体培养基，30℃培养18h；挑选长出的单克隆菌落，接种于10mL LB液体培养 基中，37℃、200rpm培养8h；取100μL培养液涂布于氯霉素含量为34μg/mL的LB固体培养基， 42℃培养12h；挑选1-5个单菌落接种于1mL LB液体培养基中，37℃、200rpm培养4h；
取100μL 培养液涂布于含有10％蔗糖的LB固体培养基，30℃培养24h；挑选单克隆，并一一对应划线于 LB固体培养基和氯霉素含量为34μg/mL的LB固体培养基；挑选在LB固体培养基上生长，同时 在氯霉素含量为34μg/mL的LB固体培养基不能生长的对应菌株进行PCR扩增鉴定。PCR扩增 采用如下引物(上海invitrogen公司合成)：

[0057] P5：5'CCATCACGGCTTGTTGTTC 3'(SEQ ID NO:9)

[0058] P6：5'ACGAAAACCCTCAATAATC 3'(SEQ ID NO:10)

[0059] 上述PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，Mg2+(25mM)4μL， 引物(10pM)各2μL，Ex Taq(5U/μL)0.25μL，总体积50μL，所述PCR扩增按如下方式进行：94℃ 预变性5min，(94℃变性30s、52℃退火30s、72℃延伸30s，30个循环)，72℃过度延伸
10min， PCR扩增产物进行SSCP(单链构象多态性，Single-Strand Conformation Polymorphism)电泳，以 质粒pKOV-yebN(G74A)扩增片段为阳性对照，野生型大肠杆菌扩增片段为阴性对照，水作为空 白对照。在SSCP电泳中，长度相同而序列排列不同的单链寡核苷酸链在冰浴中形成的空间结 构不同，电泳时迁移率也会有所差异。所以，片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致，且 与阳性对照片段位置一致的菌株即为等位替换成功的菌株。
以等位替换成功的菌株为模板， 用引物P5和P6再次通过PCR扩增目的片段，并将目的片段连接到pMD19-T载体，测序。通过 测序结果序列比对，yebN基因编码区序列第74位碱基G变为A的重组子即为改造成功的菌株。 将来自E.coli K12(W3110)的重组子命名为YPThr05，将来自E.coli CGMCC 7.232的重组子命 名为YPThr06。

[0060] 实施例3苏氨酸发酵实验

[0061] 将E.coli K12(W3110)菌株、E.coli CGMCC 7.232菌株以及突变菌株YPThr05、YPThr06 分别接种在25mL表1所述的液体培养基中，于37℃、200rpm培养12h。然后，分别取1mL各菌 株的培养物接种在25mL表1所述的液体培养基中，于37℃、200rpm发酵培养36h。通过HPLC 测定L-苏氨酸的含量，每株菌做三个平行，计算平均值，检测结果见表2。

[0062] 表1 培养基配方

[0063]成分 配方g/L
葡萄糖 40
硫酸铵 12
磷酸二氢钾 0.8
七水硫酸镁 0.8
七水硫酸亚铁 0.01
一水硫酸锰 0.01
酵母提取物 1.5
碳酸钙 0.5
L-甲硫氨酸 0.5
氢氧化钾调节pH值 pH 7.0

[0064] 表2 苏氨酸发酵实验结果

[0065]

[0066]

[0067] 由表2结果所示，无论对于高产还是低产L-苏氨酸的原始菌株，yebN基因的氨基酸序列第 25位甘氨酸被天冬氨酸取代后，都有助于L-苏氨酸产量的提高。