一种银白杨遗传转化方法

摘要

本发明提供了一种银白杨遗传转化方法，涉及遗传转化技术领域。本发明通过农杆菌侵染法，将目的基因转入到银白杨的体内，在较短的时间内得到阳性植株。在本发明实施例中，用β‑葡糖苷酸酶基因(GUS)做为报告基因，进行银白杨的遗传转化，可在短时间内得到大量转基因银白杨。本发明所述银白杨遗传转化方法解决了现有杨树遗传转化方法在银白杨遗传转化中的不适用问题，可以大大提高银白杨的转化效率，而且有效缩短了转化的时间。

权利要求

1.一种银白杨遗传转化方法，包括以下步骤：(1)以银白杨无菌组培苗的叶片和茎段为外植体，将所述外植体浸泡在侵染菌液中，得侵染后的外植体；所述侵染菌液为活化后的携带有重组质粒的农杆菌菌液；

所述叶片为茎顶端向下第4～5片叶；

(2)吸干所述侵染后的外植体表面液体后，平铺于CM1培养基上暗培养2d后，转移至CM2培养基中暗培养4～5周，得愈伤组织；所述CM1培养基中包括以下浓度的原料：WPM 2.41g/L、蔗糖30g/L、乙酰丁香酮100μmol/L、玉米素10mg/L、NAA 1mg/L和琼脂6g/L；所述CM2培养基中包括以下浓度的原料：WPM 2.41g/L、蔗糖30g/L、玉米素10mg/L、NAA 1mg/L、头孢霉素

400mg/L、潮霉素10mg/L和琼脂6g/L；

(3)将所述愈伤组织接种于CM3培养基上进行诱导培养，得不定芽；所述CM3培养基包括以下浓度的原料：WPM 2.41g/L、蔗糖30g/L、玉米素10mg/L、NAA 0.1mg/L、头孢霉素400mg/L、潮霉素10mg/L和琼脂6g/L；

(4)将所述不定芽接种于CM4培养基上进行不定芽发育培养，得无根苗；所述CM4培养基中包括以下浓度的原料：WPM 2.41g/L、蔗糖30g/L、6-BA 0.5mg/L、NAA 0.1mg/L、头孢霉素

400mg/L、潮霉素10mg/L和琼脂6g/L；

(5)将所述无根苗接种于CM5培养基上进行生根培养，得转基因苗；所述CM5培养基 中包括以下浓度的原料：1/2MS 2.47g/L、IBA 0.5mg/L、蔗糖15g/L、头孢霉素400mg/L、潮霉素

10mg/L和琼脂6g/L。

2.根据权利要求1所述遗传转化方法，其特征在于，步骤(1)中选择3～5周的银白杨无菌组培苗叶片和茎段作为外植体，所述叶片为边长为0.4～0.6cm的小块，所述茎段的长度为0.4～0.6cm。

3.根据权利要求1所述遗传转化方法，其特征在于，步骤(1)所述侵染菌液的OD600为0.4～0.6。

4.根据权利要求1或3所述遗传转化方法，其特征在于，所述侵染菌液的制备方法，包括以下步骤：A.将携带有重组质粒的农杆菌在YEB平板培养基上划线培养，得单菌落；所述YEB平板培养基中包含50mg/L的卡那霉素和50mg/L的利福平；

B.将所述单菌落按照1个单菌落：5mL YEB液体培养基的比例进行接种，震荡培养至OD600为0.7～0.9，得扩大菌种；所述YEB液体培养基内包含50mg/L的卡那霉素和50mg/L的利福平；

C.将所述扩大菌种接种于YEB无抗液体培养基中，震荡培养至OD600为0.7～0.9，得活化菌液；所述扩大菌种与YEB无抗液体培养基的体积比为1μL：1mL；

D.将所述活化菌液离心，收集菌体；

E.使用WPM重悬液重悬所述菌体，震荡培养1～2h，得所述侵染菌液；所述WPM重悬液中包括以下浓度的原料：WPM 2.41g/L、蔗糖30g/L和乙酰丁香酮100μmol/L。

5.根据权利要求4所述遗传转化方法，其特征在于，步骤B、C和E中所述震荡培养的温度为28℃，转速为180rpm。

6.根据权利要求1所述遗传转化方法，其特征在于，步骤(2)在CM1培养基和CM2培养基上进行的暗培养的温度均为25℃；在所述CM2培养基上暗培养期间，每10～14d更换一次所述CM2培养基。

7.根据权利要求1所述遗传转化方法，其特征在于，步骤(3)所述诱导培养的温度为25℃，光周期为光照16h，避光8h，光照强度为2000lx。

8.根据权利要求1所述遗传转化方法，其特征在于，步骤(4)所述不定芽发育培养的温度为25℃，光周期为光照16h，避光8h，光照强度为2000lx。

9.根据权利要求1所述遗传转化方法，其特征在于，步骤(5)所述无根苗的高度为1.8～

2.5cm。

10.根据权利要求1所述遗传转化方法，其特征在于，步骤(5)所述生根培养的温度为25℃，光周期为光照16h，避光8h，光照强度为2000lx。

说明书

一种银白杨遗传转化方法

技术领域

[0001] 本发明属于遗传转化技术领域，具体涉及一种银白杨遗传转化方法。

背景技术

[0002] 银白杨(PopμLμs abla L.)广泛分布于地中海西部盆地、中欧、东欧以及中亚的河谷地带。在我国境内则主要分布在辽东南部、陕西、宁夏、甘肃、山西、青海、新疆及西藏等地，该树种具有抗旱、抗风、耐寒、寿命长、干形通直、材质好、树形高大、美观等许多优良特性，是青藏高原和西北黄土高原的主要造林树种，常常被用作农田保护、公路绿化、治理荒沙荒地、建材和薪材、家具和雕刻图案等。20世纪80年代，我国就开始了银白杨组培快繁技术的研究，并且取得了重要的进展。但是对于银白杨转化体系的研究，目前还不是很成熟，尤其是现有的杨树转基因方案并不适用于银白杨的转基因。

发明内容

[0003] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种银白杨遗传转化方法，解决现有杨树遗传转化方法在银白杨遗传转化中的不适用问题，可以大大提高银白杨的转化效率，而且有效缩短了转化的时间。

[0004] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0005] 本发明提供了一种银白杨遗传转化方法，包括以下步骤：(1)以银白杨无菌组培苗的叶片和茎段为外植体，将所述外植体浸泡在侵染菌液中，得侵染后的外植体；所述侵染菌液为活化后的携带有重组质粒的农杆菌菌液；

[0006] (2)吸干所述侵染后的外植体表面液体后，平铺于CM1培养基上暗培养2d后，转移至CM2培养基中暗培养4～5周，得愈伤组织；所述CM1培养基中包括以下浓度的原料：WPM 2.41g/L、蔗糖30g/L、乙酰丁香酮100μmol/L、玉米素10mg/L、NAA 1mg/L和琼脂6g/L；所述CM2培养基中包括以下浓度的原料：WPM 2.41g/L、蔗糖30g/L、玉米素10mg/L、NAA1mg/L、头孢霉素400mg/L、潮霉素10mg/L和琼脂6g/L；

[0007] (3)将所述愈伤组织接种于CM3培养基上进行诱导培养，得不定芽；所述CM3培养基包括以下浓度的原料：WPM 2.41g/L、蔗糖30g/L、玉米素10mg/L、NAA 0.1mg/L、头孢霉素400mg/L、潮霉素10mg/L和琼脂6g/L；

[0008] (4)将所述不定芽接种于CM4培养基上进行不定芽发育培养，得无根苗；所述CM4培养基中包括以下浓度的原料：WPM 2.41g/L、蔗糖30g/L、6-BA 0.5mg/L、NAA 0.1mg/L、头孢霉素400mg/L、潮霉素10mg/L和琼脂6g/L；

[0009] (5)将所述无根苗接种于CM5培养基上进行生根培养，得转基因苗；所述CM5培养中包括以下浓度的原料：1/2MS 2.47g/L、IBA 0.5mg/L、蔗糖15g/L、头孢霉素400mg/L、潮霉素10mg/L和琼脂6g/L。

[0010] 优选的，步骤(1)中选择3～5周的银白杨无菌组培苗叶片和茎段作为外植体，所述叶片为边长为0.4～0.6cm的小块，所述茎段的长度为0.4～0.6cm。

[0011] 优选的，步骤(1)所述侵染菌液的OD600为0.4～0.6。

[0012] 优选的，所述侵染菌液的制备方法，包括以下步骤：A.将携带有重组质粒的农杆菌在YEB平板培养基上划线培养，得单菌落；所述YEB平板培养基中包含50mg/L的卡那霉素和50mg/L的利福平；

[0013] B.将所述单菌落按照1个单菌落：5mLYEB液体培养基的比例进行接种，震荡培养至OD600为0.7～0.9，得扩大菌种；所述YEB液体培养基内包含50mg/L的卡那霉素和50mg/L的利福平；

[0014] C.将所述扩大菌种接种于YEB无抗液体培养基中，震荡培养至OD600为0.7～0.9，得活化菌液；所述扩大菌种与YEB无抗液体培养基的体积比为1μL：1mL；

[0015] D.将所述活化菌液离心，收集菌体；

[0016] E.使用WPM重悬液重悬所述菌体，震荡培养1～2h，得所述侵染菌液；所述WPM重悬液中包括以下浓度的原料：WPM 2.41g/L、蔗糖30g/L和乙酰丁香酮100μmol/L。

[0017] 优选的，步骤B、C和E中所述震荡培养的温度为28℃，转速为180rpm。

[0018] 优选的，步骤(2)在CM1培养基和CM2培养基上进行的暗培养的温度均为25℃；在所述CM2培养基上暗培养期间，每10～14d更换一次所述CM2培养基。

[0019] 优选的，步骤(3)所述诱导培养的温度为25℃，光周期为光照16h，避光8h，光照强度为2000lx。

[0020] 优选的，步骤(4)所述不定芽发育培养的温度为25℃，光周期为光照16h，避光8h，光照强度为2000lx。

[0021] 优选的，步骤(5)所述无根苗的高度为1.8～2.5cm。

[0022] 优选的，步骤(5)所述生根培养的温度为25℃，光周期为光照16h，避光8h，光照强度为2000lx。

[0023] 本发明提供了一种银白杨遗传转化方法，通过农杆菌侵染法，将目的基因转入到银白杨的体内，在较短的时间内得到阳性植株。本发明将生芽培养分为两个阶段，前期先用玉米素(ZT)诱导不定芽发生，后期再用6-BA诱导不定芽发育，两种激素搭配使用可以大大缩短银白杨转化的时间。在本发明实施例中，用β-葡糖苷酸酶基因(GUS)做为报告基因，进行银白杨的遗传转化，可在短时间内得到大量转基因银白杨。本发明所述银白杨遗传转化方法解决了现有杨树遗传转化方法在银白杨遗传转化中的不适用问题，可以大大提高银白杨的转化效率，而且有效缩短了转化的时间。

附图说明

[0024] 图1为侵染后的外植体在CM1培养基上的培养图；

[0025] 图2为在CM2培养基上形成愈伤组织图；

[0026] 图3为在CM3培养基上愈伤组织诱导分化不定芽图；

[0027] 图4为在CM4培养基上不定芽发育图；

[0028] 图5为在CM5培养基上无根苗生根图；

[0029] 图6为转基因植株PCR检测结果图；

[0030] 图7为转基因植株GUS染色结果图。

具体实施方式

[0031] 本发明提供了一种银白杨遗传转化方法，包括以下步骤：(1)以银白杨无菌组培苗的叶片和茎段为外植体，将所述外植体浸泡在侵染菌液中，得侵染后的外植体；所述侵染菌液为活化后的携带有重组质粒的农杆菌菌液；

[0032] (2)吸干所述侵染后的外植体表面液体后，平铺于CM1培养基上暗培养2d后，转移至CM2培养基中暗培养4～5周，得愈伤组织；所述CM1培养基中包括以下浓度的原料：WPM 2.41g/L、蔗糖30g/L、乙酰丁香酮100μmol/L、玉米素10mg/L、NAA 1mg/L和琼脂6g/L；所述CM2培养基中包括以下浓度的原料：WPM 2.41g/L、蔗糖30g/L、玉米素10mg/L、NAA1mg/L、头孢霉素400mg/L、潮霉素10mg/L和琼脂6g/L；

[0033] (3)将所述愈伤组织接种于CM3培养基上进行诱导培养，得不定芽；所述CM3培养基包括以下浓度的原料：WPM 2.41g/L、蔗糖30g/L、玉米素10mg/L、NAA 0.1mg/L、头孢霉素400mg/L、潮霉素10mg/L和琼脂6g/L；

[0034] (4)将所述不定芽接种于CM4培养基上进行不定芽发育培养，得无根苗；所述CM4培养基中包括以下浓度的原料：WPM 2.41g/L、蔗糖30g/L、6-BA 0.5mg/L、NAA 0.1mg/L、头孢霉素400mg/L、潮霉素10mg/L和琼脂6g/L；

[0035] (5)将所述无根苗接种于CM5培养基上进行生根培养，得转基因苗；所述CM5培养中包括以下浓度的原料：1/2MS 2.47g/L、IBA 0.5mg/L、蔗糖15g/L、头孢霉素400mg/L、潮霉素10mg/L和琼脂6g/L。

[0036] 本发明所述银白杨遗传转化方法，以银白杨无菌组培苗的叶片和茎段为外植体，将所述外植体浸泡在侵染菌液中，得侵染后的外植体；所述侵染菌液为活化后的携带有重组质粒的农杆菌菌液。本发明所述叶片和茎段优选来源于3～5周的银白杨无菌组培苗，更优选来源于4周的银白杨无菌组培苗。本发明对所述银白杨无菌组培苗上的叶片和茎段优选进行处理，包括将所述叶片裁剪为小块，将所述茎段裁剪为小段。本发明所述小块的边长优选为0.4～0.6cm，更优选为0.5cm。本发明所述小段的长度优选为0.4～0.6cm，更优选为0.5cm。

[0037] 本发明将所述外植体浸泡在侵染菌液中，所述浸泡的时间优选为10～15min。本发明所述侵染菌液的制备方法，优选包括以下步骤：A.将携带有重组质粒的农杆菌在YEB平板培养基上划线培养，得单菌落；所述YEB平板培养基中包含50mg/L的卡那霉素和50mg/L的利福平；

[0038] B.将所述单菌落按照1个单菌落：5mLYEB液体培养基的比例进行接种，震荡培养至OD600为0.7～0.9，得扩大菌种；所述YEB液体培养基内包含50mg/L的卡那霉素和50mg/L的利福平；

[0039] C.将所述扩大菌种接种于YEB无抗液体培养基中，震荡培养至OD600为0.7～0.9，得活化菌液；所述扩大菌种与YEB无抗液体培养基的体积比为1μL：1mL；

[0040] D.将所述活化菌液离心，收集菌体；

[0041] E.使用WPM重悬液重悬所述菌体，震荡培养1～2h，得所述侵染菌液；所述WPM重悬液中包括以下浓度的原料：WPM 2.41g/L、蔗糖30g/L和乙酰丁香酮100μmol/L。

[0042] 本发明在制备所述侵染菌液时，将携带有重组质粒的农杆菌在YEB平板培养基上划线培养，得单菌落；所述YEB平板培养基中包含50mg/L的卡那霉素和50mg/L的利福平。本发明对所述农杆菌携带的重组质粒并没有特殊限定，也没有对重组质粒上的目的基因进行限定，在本发明实施例中，为方便说明，利用GUS基因进行试验，但不可仅将该基因视为本发明的保护范围。本发明对所述划线培养的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规划线培养方法即可。本发明所述划线培养的温度优选为28℃，直至得单菌落。

[0043] 得单菌落后，本发明将所述单菌落按照1个单菌落：5mLYEB液体培养基的比例进行接种，震荡培养至OD600为0.7～0.9，得扩大菌种；所述YEB液体培养基内包含50mg/L的卡那霉素和50mg/L的利福平。本发明所述震荡培养的温度优选为28℃，转速优选为180rpm。本发明所述扩大菌种的OD600优选为0.8。

[0044] 得扩大菌种后，本发明将所述扩大菌种接种于YEB无抗液体培养基中，震荡培养至OD600为0.7～0.9，得活化菌液；所述扩大菌种与YEB无抗液体培养基的体积比为1μL：1mL。本发明所述震荡培养的温度优选为28℃，转速优选为180rpm。本发明所述扩大菌种的OD600优选为0.8。

[0045] 得活化菌液后，本发明将所述活化菌液离心，收集菌体。本发明优选在4℃下进行离心，所述离心的转速优选为4000rpm，所述离心的时间优选为10min。

[0046] 得菌体后，本发明使用WPM重悬液重悬所述菌体，震荡培养1～2h，得所述侵染菌液；所述WPM重悬液中包括以下浓度的原料：WPM 2.41g/L、蔗糖30g/L和乙酰丁香酮100μmol/L。本发明对所述WPM重悬液的用量并没有特殊限定。本发明所述震荡培养的温度优选为28℃，转速优选为180rpm。本发明所述扩大菌种的OD600优选为0.4～0.6。本发明得所述侵染菌液后，优选的在冰上保存。

[0047] 得侵染后的外植体后，本发明吸干所述侵染后的外植体表面液体后，平铺于CM1培养基上暗培养2d后，转移至CM2培养基中暗培养4～5周，得愈伤组织；所述CM1培养基中包括以下浓度的原料：WPM 2.41g/L、蔗糖30g/L、乙酰丁香酮100μmol/L、玉米素10mg/L、NAA 1mg/L和琼脂6g/L；所述CM2培养基中包括以下浓度的原料：WPM 2.41g/L、蔗糖30g/L、玉米素10mg/L、NAA 1mg/L、头孢霉素400mg/L、潮霉素10mg/L和琼脂6g/L。本发明优选利用无菌滤纸吸干所述侵染后的外植体表面液体，然后平铺于CM1培养基上暗培养2d后，转移至CM2培养基中暗培养4～5周。本发明在所述CM1培养基和CM2培养基上进行的暗培养的温度优选均为25℃。本发明在所述CM2培养基上暗培养期间，优选每10～14d更换一次所述CM2培养基。本发明中两次暗培养过程分别为不定芽的发生和发育过程，玉米素(ZT)有助于不定芽的诱导发生，6-BA有助于不定芽的发育，在ZT和6-BA的共同作用下，可大大缩短银白杨转化的时间。本发明对所述CM1培养基和CM2培养基中各原料的来源和制备方法并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可，在制备所述培养基时，优选的将所述培养基的pH值调节至
5.80～6.00后加入琼脂，121℃灭菌20min，灭菌后加入抗生素和不耐高温激素。

[0048] 得愈伤组织后，本发明将所述愈伤组织接种于CM3培养基上进行诱导培养，得不定芽；所述CM3培养基包括以下浓度的原料：WPM 2.41g/L、蔗糖30g/L、玉米素10mg/L、NAA 0.1mg/L、头孢霉素400mg/L、潮霉素10mg/L和琼脂6g/L。本发明所述诱导培养的温度优选为
25℃，光周期为光照16h，避光8h，光照强度为2000lx。本发明所述诱导培养的时间优选为3～4周。

[0049] 得不定芽后，本发明将所述不定芽接种于CM4培养基上进行不定芽发育培养，得无根苗；所述CM4培养基中包括以下浓度的原料：WPM 2.41g/L、蔗糖30g/L、6-BA 0.5mg/L、NAA 0.1mg/L、头孢霉素400mg/L、潮霉素10mg/L和琼脂6g/L。本发明所述不定芽发育培养的温度优选为25℃，光周期为光照16h，避光8h，光照强度为2000lx。本发明所述不定芽发育培养的时间优选为3～4周。

[0050] 得无根苗后，本发明将所述无根苗接种于CM5培养基上进行生根培养，得转基因苗；所述CM5培养中包括以下浓度的原料：1/2MS 2.47g/L、IBA0.5mg/L、蔗糖15g/L、头孢霉素400mg/L、潮霉素10mg/L和琼脂6g/L。本发明优选在所述不定芽生长至2cm左右时，将其剪下转接到CM5培养基中诱导不定根产生。本发明所述生根培养的条件优选为温度为25℃，光周期为光照16h，避光8h，光照强度为2000lx。

[0051] 下面结合实施例对本发明提供的银白杨遗传转化方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0052] 1.实验准备阶段：

[0053] 1)植物材料：选择长到瓶口的无菌组培苗的叶片和茎段；

[0054] 2)实验试剂：蔗糖(Sucrose)、琼脂粉(Agar)、乙酰丁香酮(AS)、玉米素(ZT)、萘乙酸(NAA)、6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、吲哚乙酸(IBA)，头孢霉素(Cef)，潮霉素(Hyg)、卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)、Woody Plant Basal Medium withVitamins(WPM)、Yeast Extract Mannitol Broth(YEB)、1/2MS Medium(1/2MS)；

[0055] 3)实验仪器：28℃恒温培养箱、28℃摇床、超净台、紫外分光光度计；

[0056] 4)准备工作：试管、试管塞、1.5mL Ep管、250mL锥形瓶，剪刀、镊子、滤纸等提前灭菌；

[0057] 5)配制培养基：配方如表1所示，在配制时所有培养基的pH值至5.80～6.00后加入琼脂粉，121℃灭菌20分钟。灭菌后加入抗生素和不耐高温激素。

[0058] 表1培养基配方

[0059]

[0060] 实施例1

[0061] 将GUS基因转到银白杨体内：

[0062] 1.将GUS基因(GenBank:MG687280.1)连接到ΔpCAMBIA1302载体上，ΔpCAMBIA1302载体是传统的pCAMBIA1302改造的一个新型双元表达载体，它主要是用CaMV35S启动子(CaMV35S-P)(835bp)和多克隆位点(42bp)取代了pCAMBIA1302载体上原有的T-DNA区段上的组成型CaMV35S启动子(CaMV35S-P)(538bp)和报告基因GFP。将重组基因转到DH10B大肠杆菌感受态中。测序正确后，提取质粒，通过电击转化法转到EHA105农杆菌感受态中。

[0063] 2.将携带有重组质粒的农杆菌(EHA105)在YEB(50mg/L Kan+50mg/L Rif)平板上划线，28℃培养，2天后出现单菌落。

[0064] 3.挑取单菌落进行菌落PCR，并将其接种于1mL YEB(50mg/L Kan+50mg/LRif)液体培养基中，将PCR产物送测序，测序结果正确后，进行保菌，后续转化实验可直接进行摇菌。

[0065] 4.取50μL的菌液接种于5mLYEB(50mg/L Kan+50mg/L Rif)液体培养基中，28℃，180rpm震荡培养30个小时后OD600＝0.773。

[0066] 5.取200μL菌液于200mL新鲜YEB无抗液体培养基中28℃，180rpm震荡培养15个小时后OD600＝0.682。此时在超近工作台中将200mL菌液分装到4个50mL离心管中，4000rpm，4℃离心10min，将菌体收集到管底。

[0067] 6.每个离心管中加入35mLWPM重悬液重悬菌体，28℃震荡培养2h后OD600＝0.586，此时将菌液暂存于冰上用于侵染。

[0068] 7.选择生长4周左右的银白杨组培苗，取其茎顶端向下第4-5片叶和茎顶端向下第2-4节的茎段，将叶片剪成边长0.5cm的小块，茎段剪成0.5cm的小段，浸泡在上一步准备好的菌液中侵染15min。

[0069] 8.用无菌滤纸将叶片和茎段表面的菌液吸干，平铺在CM1培养基上，25℃暗培养两天，如图1所示。

[0070] 9.暗培养两天后将叶片和茎段转移到CM2培养基中，25℃暗培养，期间每10-14天更换一次培养基。4周时大部分叶片和茎段边缘出现了淡黄色团状愈伤组织，如图2所示。此时将其转移至CM3培养基上，培养条件为：光强2000lx，温度25℃，光周期光照16h，避光8h。3周时开始出现如图3所示的不定芽。将长出不定芽的愈伤组织转移到CM4培养基上，培养条件为：光强2000lx，温度25℃，光周期光照16h，避光8h。培养3周后，少量不定芽长至2公分左右，如图4所示。将其剪下转接到CM5培养基中诱导不定根。2周后开始出现如图5所示的不定根。待其根系发达时，将其移栽到温室中进行土培。

[0071] 10.转基因植株的检测

[0072] 1)检测外源基因GUS是否整合到银白杨基因组中

[0073] 提取银白杨转基因候选阳性植株的基因组DNA为模板，利用引物(p1302OE-JC1/p1302OE-JC2)进行PCR扩增，检测GUS基因是否整合到银白杨基因组中。引物p1302OE-JC1/p1302OE-JC2位于ΔpCAMBIA1302载体多克隆位点两侧，检测含有GUS基因的LB-RB区段是否整合到银白杨基因组上，序列分别为：

[0074] p1302OE-JC1：TTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGG；

[0075] p1302OE-JC2：CAAGACCGGCAACAGGATT。检测结果如图6所示。

[0076] 2)GUS基因的组织化学染色

[0077] 具体方法如下：取转基因候选阳性植株茎尖处的新长出的叶片，放入1.5mL Ep管中，加入GUS染液，在37℃恒温条件下放置2h左右，充分染液后再用75％乙醇脱色，放于体视镜下观察。植株叶片可被GUS染液染成特异蓝色的植株为转基因阳性。

[0078] GUS染液中包括：0.1mol/LK3Fe(CN)6，0.1mol/L K4Fe(CN)6，0.01mol/L Na2EDTA，500mg/L X-Gluc，1％Triton X-100(v/v)，0.14mol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)。

[0079] 本发明提供了一种银白杨遗传转化方法，解决了现有杨树遗传转化方法在银白杨遗传转化中的不适用问题，大大提高银白杨的转化效率，而且有效缩短了转化的时间。

[0080] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。