敲低TLR4基因猪肺泡巨噬细胞系的构建方法及其应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，具体涉及敲低TLR4基因猪肺泡巨噬细胞系的构建方法及其应用。该猪肺泡巨噬细胞系的保藏编号为：CCTCC NO：C2019174。敲低TLR4基因猪肺泡巨噬细胞系的构建方法：将含有sgRNA的重组慢病毒转染猪肺泡巨噬细胞，经抗性筛选得到所述TLR4基因敲低的猪肺泡巨噬细胞系；所述sgRNA由SEQ ID NO.1～2所示核苷酸序列退火得到。本发明构建的敲低TLR4基因猪肺泡巨噬细胞系可以促进口蹄疫病毒复制，与未敲低的细胞系相比，该敲低TLR4基因猪肺泡巨噬细胞系中口蹄疫病毒复制量是前者的2～3倍。

权利要求

1.敲低TLR4基因猪肺泡巨噬细胞系，其特征在于，该猪肺泡巨噬细胞系的保藏编号为： CCTCC NO：C2019174。

2.权利要求1所述的敲低TLR4基因猪肺泡巨噬细胞系在促进口蹄疫病毒复制中的应用。

说明书

敲低TLR4基因猪肺泡巨噬细胞系的构建方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及敲低TLR4基因猪肺泡巨噬细胞系的构建方法及其应用。

背景技术

[0002] 口蹄疫(FMD)是一种高度传染性疾病，主要影响猪、牛、绵羊、山羊、鹿和其他偶蹄动物。口蹄疫的致病因子是口蹄疫病毒(FMDV)，属于小核糖核酸病毒科的口蹄疫病毒属。病毒基因组包含长度为8.5kb的正单链RNA链，编码四种结构蛋白(VP1-VP4)，八种非结构蛋白(L，2A，2B，2C，3A，3B，3C以及3D)和一些切割中间体。病毒蛋白具有多种功能，可以通过许多不同的机制实现FMDV的传播和复制，并抵消宿主的抗病毒反应。

[0003] TLR是一种I型跨膜蛋白，由胞外富含亮氨酸的重复序列结构域、胞内保守的Toll/IL-1受体结构域和跨膜结构域构成。TLRs是机体抵抗外界微生物入侵的第一道免疫防线，同时也是连接固有免疫和适应性免疫的桥梁，属于模式识别受体家族。目前已鉴定TLRs有13种，其分布十分广泛，主要表达于各种免疫细胞，如树突状细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞及小胶质细胞等。TLRs能识别包括细菌、病毒和真菌等在内的微生物，并能与它们的保守序列结合。一旦TLRs活化完成，一系列保守级联反应开始启动，并最终激活两个主要的细胞内转录因子：NF-κB和干扰素调节因子。

[0004] Toll样受体4(TLR4)属于模式识别受体(PRR)家族。它们是高度保守的受体，可识别保守的病原体相关分子模式(PAMP)，因此成为抵御感染的第一道防线。TLR4长期以来被认为是革兰氏阴性脂多糖(LPS)的受体。此外，它还结合由组织损伤产生的内源性分子。因此，TLR4是一种关键受体，感染和非感染刺激都会诱导促炎反应。由外源或内源配体触发的TLR4介导的炎症也参与几种急性和慢性疾病，具有作为炎症反应的放大器的关键作用。

[0005] TLR4的基因定位于9号染色体，主要分布于单核巨噬细胞，可以识别细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、细菌磷壁酸和宿主坏死细胞释放的热休克蛋白(heat-shock proteins,HSP)等。TLR4基因首次是在人类细胞表面被鉴定出，由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成，全长有2526bp的CDS序列，包含三个外显子，在家畜中能够编码841个氨基酸。经过近几年的研究，发现更多的TLR4的生物学功能，主要包括诱导免疫炎性因子引发炎症反应、诱导畜禽机体的特异性免疫、协助机体清除体内病毒和与其他TLRs分子产生协同作用等(MolteniMonica,GemmaSabrina,Rossetti Carlo.The Role of Toll-Like Receptor 
4 in Infectious and Noninfectious Inflammation.[J].Mediators of inflammation,
2016,2016.)。由于其功能大多均参与机体的免疫反应，因此其在畜禽机体内主要表达在单核巨噬细胞、粒细胞、树突状细胞、淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞和骨髓单核细胞等参与宿主防御功能的细胞中。

[0006] CRISPR-Cas9基因编辑技术是继ZFN和TALEN技术之后迅速发展起来的第三代基因组编辑技术，其是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR-Cas9基因编辑技术，是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景。

发明内容

[0007] 本发明利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，获得敲低TLR4基因猪肺泡巨噬细胞系，所得细胞系可用于促进口蹄疫病毒复制。

[0008] 本发明具体采用以下技术方案：

[0009] 本发明提供一种敲低TLR4基因猪肺泡巨噬细胞系，该细胞系的保藏编号为CCTCC NO：C2019174。

[0010] 本发明还提供一种敲低TLR4基因猪肺泡巨噬细胞系的构建方法，将含有sgRNA的重组慢病毒转染猪肺泡巨噬细胞，经抗性筛选得到所述TLR4基因敲低的细胞系；所述sgRNA由SEQ ID NO.1～2所示核苷酸序列退火得到。

[0011] 进一步地，敲低TLR4基因猪肺泡巨噬细胞系的构建方法具体包括以下内容：

[0012] 步骤1：根据猪源TLR4基因序列设计sgRNA引物F和sgRNA引物R；所述sgRNA引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，sgRNA引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

[0013] 步骤2：酶切慢病毒载体，将sgRNA引物F和sgRNA引物R退火得到sgRNA，将酶切后的慢病毒载体和sgRNA连接，所述慢病毒载体为pGL-U6-gRNA；

[0014] 步骤3：将步骤2得到的重组慢病毒载体进行包装；

[0015] 步骤4：将步骤3得到的慢病毒感染猪肺泡巨噬细胞，筛选获得敲低TLR4基因猪肺泡巨噬细胞系。

[0016] 进一步地，所述sgRNA引物F和sgRNA引物R退火的反应体系为：sgRNA引物F1μL，sgRNA引物R1μL，退火buffer48μL；反应程序：90℃，4min，70℃，10min，37℃，20min，10℃，20min。

[0017] 本发明还提供一种用于敲低TLR4基因表达的慢病毒载体，所述慢病毒载体包括上述的sgRNA。

[0018] 上述敲低TLR4基因猪肺泡巨噬细胞系可用于促进口蹄疫病毒复制。

[0019] 本发明的有益效果在于：

[0020] 1、本发明构建了用于敲低PAM细胞TLR4基因的sgRNA引物对，与对照引物对相比，该引物对的敲低效率显著。

[0021] 2、与未敲低的细胞系相比，本发明制备的敲低TLR4基因猪肺泡巨噬细胞系中口蹄疫病毒复制量是前者的2～3倍。

附图说明

[0022] 图1为三对sgRNA引物构建的sgRNA的敲低效果图。

[0023] 图2为PRK-HA-TLR4质粒的剂量依赖性降解VP3蛋白。

[0024] 图3为过表达TLR4的PAM细胞感染FMDV后FMDV的3D基因表达情况。

[0025] 图4为过表达TLR4的PAM细胞感染FMDV后细胞中VP3的蛋白含量。

[0026] 图5为过表达TLR4的PAM细胞感染FMDV后TCID50检测结果。

[0027] 图6为FMDV感染PAM细胞后，野生型PAM细胞和敲低TLR4的PAM细胞中FMDV的3D基因表达情况。

[0028] 图7为FMDV感染PAM细胞后，野生型PAM细胞和敲低TLR4的PAM细胞中VP3蛋白含量。

[0029] 图8为FMDV感染PAM细胞后，野生型PAM细胞和敲低TLR4的PAM细胞的TCID50检测结果。

[0030] 图9为pCDNA3.1-HA-N的质粒图谱。

[0031] 图10为pCDNA3.1-3Xflag-C的质粒图谱。

[0032] 图1、2、4和7中，αTLR4表示用的内源性TLR4的抗体，αβ-actin表示用的细胞内参的抗体，αFlag表示Flag标签的抗体，αHA表示HA标签的抗体，TLR4表示内源性TLR4的表达量，β-actin表示细胞内参的表达量，Flag-VP3表示VP3是带Flag标签的，表示VP3的含量，HA-TLR4表示TLR4是带HA标签的，表示TLR4的含量，αVP3表示VP3内源性抗体，VP3表示VP3的蛋白量的多少，Con表示空载。

[0033] 图3中Con表示的是表达的空载pCDNA3.1，TLR4表示过表达载体pCDNA3.1-HA-TLR4。

[0034] 图5中EV表示过表达空载体pCDNA3.1，TLR4表示过表达载体pCDNA3.1-HA-TLR4。

[0035] 图6中Coni表示的是敲除的空载eGFP的PAM细胞(对照)，TLR4-RNAi#1表示敲除的TLR4的细胞系。

[0036] 图8中Coni表示的是敲除的空载eGFP的PAM细胞(对照)，TLR4-RNAi#1表示敲除的TLR4的细胞系。

[0037] 保藏信息：

[0038] 保藏时间：2019年07月24日；

[0039] 保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心；

[0040] 保藏编号：CCTCC NO：C2019174；

[0041] 保藏单位地址：中国武汉武汉大学；

[0042] 分类命名：猪肺泡巨噬细胞TLR4-1。

具体实施方式

[0043] 以下实施例是为了更好的说明本发明的技术方案，而不是以此来限制本发明的保护范围。

[0044] 实施例中所用FMDV由中国农业科学院兰州兽医研究所国家口蹄疫病毒参考实验室提供，慢病毒载体pGL-U6-gRNA由武汉大学舒红兵教授赠送，公众可从NTCC典型培养物保藏中心购买，Trans5α感受态细胞、293T细胞、HEK-293T细胞、PK-15细胞、PAM细胞均购买于兰州瑞博莱生物科技有限公司。

[0045] 实施例1 TLR4基因敲除的PAM细胞系的构建

[0046] 1.1sgRNA的设计

[0047] 根据猪源TLR4基因序列(Gene ID:399541)，确定外显子序列，根据外显子序列结构选择敲除位点，利用软件设计出三对sgRNA引物，分别为：

[0048] sgRNA-F-1:5’-CACCGGCCAGGACGAAGACTGGGTG-3’(SEQ ID NO.1)

[0049] sgRNA-R-1:5’-AAACCACCCAGTCTTCGTCCTGGCC-3’(SEQ ID NO.2)；

[0050] sgRNA-F-2:5’-CACCGGGGAGGACAGCGTCCTGGGG-3’(SEQ ID NO.3)

[0051] sgRNA-R-2:5’-AAACCCCCAGGACGCTGTCCTCCCC-3’(SEQ ID NO.4)；

[0052] sgRNA-F-3:5’-CACCGGCAGGAATACCTACCTGGAG-3’(SEQ ID NO.5)

[0053] sgRNA-R-3:5’-AAACCTCCAGGTAGGTATTCCTGCC-3’(SEQ ID NO.6)。

[0054] 1.2载体构建

[0055] 1.2.1酶切空质粒(pGL-U6-gRNA)和胶回收

[0056] 用限制性内切酶BSmbI酶切5μg质粒，37℃，2h：

[0057] 表1限制性内切酶BSmb1酶切体系

[0058]BSmbI 5μL
慢病毒载体 5μg
NEB buffer 10μL
灭菌水 补至50μL

[0059] 凝胶提取试剂盒消化过的质粒，凝胶纯化，并在Elution Buffer中洗脱。

[0060] 1.2.2 sgRNA引物退火反应

[0061] 表2退火sgRNA反应体系

[0062]sgRNA-F 1μL
sgRNA-R 1μL
退火buffer 48μL

[0063] PCR程序设置：90℃，4min，70℃，10min，37℃，20min，10℃，20min。

[0064] 1.2.3质粒连接和转化筛选

[0065] 表3质粒连接反应体系

[0066] sgRNA 6μL酶切载体 2μL
T4连接酶 1μL
T4 buffer 1μL

[0067] 将表3所述反应体系混匀，室温孵育1h，获得重组质粒。

[0068] 1.2.4转化筛选

[0069] 转化：在含有100μL Trans5α感受态细胞的EP管中加入10μL重组质粒，混匀。冰上放置30min，然后将EP管放到42℃循环水浴热激90s。取出，迅速冰浴5min。每管加1mL无抗LB液体培养基，37℃、220rpm慢摇复苏30min。将复苏好的菌液于6000rpm、室温条件下离心3min，吸去800μL上清后，将剩余的上清与沉淀的菌体充分悬浮，然后涂布于含有氨苄青霉素的固体LB培养基上。将平板置于37℃培养箱中培养过夜。

[0070] 筛选：将阳性克隆挑出，提质粒，随后进行酶切鉴定，反应体系如下：

[0071] 表4重组质粒酶切反应体系

[0072]重组质粒 8.2μL
EcoRI 0.4μL
KpnI 0.4μL
10×buffer 1μL

[0073] 将表4所述的反应体系在室温下孵育30min，进行凝胶电泳。电泳结果中10000bp处为慢病毒载体，300bp处为sgRNA，结果表明，筛选出来的阳性质粒为重组质粒。

[0074] 1.3慢病毒包装

[0075] 把构建好的重组质粒以及pST1374-Cas9-D10A质粒(重组质粒和pST1374-Cas9-D10A质粒的质量比为1:1，pST1374-Cas9-D10A质粒购买于兰州瑞博莱生物科技有限公司)利用lipofectamine 3000脂质体转染进293T细胞中，转染8～12h后将培养基换为10％FBS、无双抗的DMEM中，继续孵育12～24h，待细胞病变达到70％时，将细胞上清收集并用0.22μm的滤膜将上清过滤待用。

[0076] 1.4感染细胞

[0077] 用PAM细胞铺12孔板，待细胞长到30％时加入1mL慢病毒、1ml10％FBS、无双抗的DMEM和1.5μLpolybrene，感染8～12h后重复感染，12h后将细胞消化，转到6孔板中，并用加了1％嘌呤霉素的DMEM进行培养，待细胞长满后，取一半细胞进行WB(蛋白免疫印迹)实验，验证TLR4基因是否敲低。

[0078] 结果如图1所示，所构建的三对sgRNA中，只有sgRNA-F-1和sgRNA-R-1构建的sgRNA(1#)敲低效率显著，另外两个效果不显著，故后面只用1#检测对口蹄疫病毒的影响。实施例2TLR4降解FMDV结构蛋白VP3的分析

[0079] 2.1实验步骤

[0080] (1)将HEK-293T细胞铺12孔板，待细胞长至60％～80％时，将信号通路分子质粒pCDNA3.1-HA-TLR4(购于兰州瑞博莱生物科技有限公司)按0μg、2μg、4μg、6μg分别与FMDV的pCDNA3.1-FLAG-VP3质粒(购于兰州瑞博莱生物科技有限公司)1μg共转染到HEK-293T细胞中；pCDNA3.1-HA-TLR4由TLR4基因片段插入如图9所示的pCDNA3.1-HA-N载体的EcoR I和Xho I之间构建而成，pCDNA3.1-FLAG-VP3由VP3基因片段插入图10所示的pCDNA3.1-3Xflag-C载体的EcoR I和Xho I之间构建而成。

[0081] (2)转染24h后收样，用冷却的PBS洗1～2遍，加入100μL的SDS loading buffer进行裂解，WB方法检测VP3蛋白的表达情况。

[0082] 2.2实验结果

[0083] 结果如图2所示，随着pCDNA3.1-HA-TLR4质粒的剂量逐渐上升，VP3的蛋白含量逐渐下降。因此，上述信号通路分子TLR4能够降解VP3蛋白，说明TLR4能够降解VP3蛋白。

[0084] 实施例3过表达TLR4对VP3蛋白降解的影响

[0085] 3.1 FMDV感染细胞

[0086] 3.1.1实验步骤

[0087] (1)将PK-15细胞铺到12孔板上，待细胞长至60％～80％时，利用lipofectamine 3000脂质体转染PRK-HA-TLR4(5μg)以及相应空载体pCDNA3.1(5μg)，转染18h后分不同时间点(0,6,12h)感染FMDV(MOI＝0.1)；

[0088] (2)收样后，分别进行Q-PCR检测FMDV的3D基因的拷贝数，TCID50以及WB检测VP3蛋白的含量。

[0089] Q-PCR反应试剂：2×one step RT-PCR bufferⅢ(12.5μL)，Takara Ex Taq HS(0 .5μL)，Primer  Scrip  RT  Enzyme  mixⅡ(0.5μL)，正向引物(5’ACTGGGTTTTACAAACCTGTGA-3C)(0.5μL)，反向引物(5’GCGAGTCCTGCCACGGA-3C)(0.5μL)，探针(5FAM-TCCTTTGCACGCCGTGGGAC-TAMRA--3A)(1μL)，RNA(2μL)，H2O(7.5μL)；

[0090] WB检测：分别收集上述样品，加SDS-loading buffer裂解后，用WB法检测VP3蛋白的表达情况。

[0091] TCID50检测：感染FMDV结束后收集细胞上清液，用DMEM培养基将病毒作连续10倍稀释，即10-1,10-2，……。根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。用排枪吸去细胞铺满80％左右的96孔板中的培养液，再用PBS洗2次(此目的是去除血清，因为血清会影响病毒的吸附)，弃掉；每个稀释度取100ul加入96孔板，每个稀释度作8个重复。终体积为200ul。并设置空白对照，即200ulDMEM培养基。置于37℃培养。按时间点观察细胞病变，并记录细胞病变孔数。结果的计算用Reed-Muench两氏法。

[0092] 3.1.2实验结果

[0093] 如图3所示：Q-PCR结果表明PAM细胞可以被FMDV感染，并且随着病毒感染时间的增加，过表达TLR4的PAM细胞中FMDV基因拷贝数减少。

[0094] 如图4所示：WB检测结果显示，随着病毒感染时间的增加，过表达TLR4后VP3蛋白的含量较空载有所减少。

[0095] 如图5所示：TCID50检测显示过表达TLR4细胞致死率较空载有所下降。

[0096] 已知TLR4是一种关键受体，感染和非感染刺激都会诱导促炎反应，具有作为炎症反应的放大器的关键作用。口蹄疫病毒也会引起机体发生炎症反应，是一种炎症诱导病毒(GuiBoxiang,ChenQin,HuChuanxia,ZhuCaihui,HeGuimei.Effects of calcitriol(1,25-dihydroxy-vitamin D3)on the inflammatory response induced by H9N2 influenza virus infection in human lung A549 epithelial cells and in mice.[J].Virology journal,2017,14)。但当感染口蹄疫病毒，过表达TLR4的PAM细胞反而抑制了口蹄疫病毒的复制，并没有如预期促进口蹄疫病毒的复制。

[0097] 实施例4敲低TLR4对促进VP3蛋白增加的影响

[0098] 4.1.1实验步骤(1)PAM WT细胞(未敲低TLR4的野生型PAM细胞)和实施例1制备的PAM敲低TLR4基因的细胞铺于12孔板，12h后接FMDV(MOI＝0.1)，分别在6h和12h收集样品，进行绝对定量Q-PCR实验，检测FMDV的3D基因的拷贝数，TCID50以及WB检测。

[0099] Q-PCR反应试剂：2×one step RT-PCR bufferⅢ(12.5μL)，Takara Ex Taq HS(0 .5μL)，Primer  Scrip  RT  Enzyme  mixⅡ(0.5μL)，正向引物(5’ACTGGGTTTTACAAACCTGTGA-3C)(0.5μL)，反向引物(5’GCGAGTCCTGCCACGGA-3C)(0.5μL)，探针(5FAM-TCCTTTGCACGCCGTGGGAC-TAMRA--3A)(1μL)，RNA(2μL)，H2O(7.5μL)；

[0100] Q-PCR反应条件：42℃，15min；95℃，10s；55℃，30s；72℃，30s；步骤2～4共40个循环。

[0101] WB检测：分别收集上述样品，加SDS-loading buffer裂解后，用WB法检测VP3蛋白的表达情况。

[0102] TCID50检测：感染FMDV结束后收集细胞上清液，用DMEM培养基将病毒作连续10倍稀释，即10-1,10-2，……。根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。用排枪吸去细胞铺满80％左右的96孔板中的培养液，再用PBS洗2次(此目的是去除血清，因为血清会影响病毒的吸附)，弃掉；每个稀释度取100ul加入96孔板，每个稀释度作8个重复。终体积为200ul。并设置空白对照，即200ulDMEM培养基。置于37℃培养。按时间点观察细胞病变，并记录细胞病变孔数。结果的计算用Reed-Muench两氏法。

[0103] 4.1.2实验结果

[0104] Q-PCR结果如图6所示：不论是在FMDV感染PAM细胞后6h还是12h后，敲低TLR4的PAM细胞中FMDV的3D基因拷贝数均显著高于WT PAM细胞，该结果表明，敲低TLR4后，FMDV感染PAM细胞的能力显著增强。

[0105] WB检测如图7所示：随着病毒感染时间的增加，敲低TLR4后VP3的蛋白含量较空载有所增加。

[0106] TCID50检测如图8所示：敲低TLR4细胞致死率较空载有所上升。

[0107] 以上之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围。