一种靛玉红衍生物及其作为CDK/HDAC双靶标抑制剂的应用转让专利
申请号 : CN201910575031.2
文献号 : CN110590640B
文献日 : 2020-12-15
发明人 : 何彬 , 赵永龙 , 曹灼贤 , 杨芬芬 , 李燕 , 李勇军
申请人 : 贵州医科大学
摘要 :
本发明公开一种靛玉红衍生物及其作为CDK/HDAC双靶标抑制剂的应用,该靛玉红衍生物能够有效抑制CDK/HDAC的活性，因此可作为CDK/HDAC的双靶标抑制剂，并且本发明合成原料便宜、成本较低，抗肿瘤活性明显，可用于高效低毒的新型CDK/HDAC双靶标抑制剂类抗肿瘤药物。
权利要求 :
1.一种靛玉红衍生物，其特征在于，所述衍生物 的结构通式为：所述R1为氢、卤素，R1是4'位取代、5'位取代、6'位取代或7'位取代；
所述R2为氢、卤素，R2是4位取代、5位取代、6位取代或7位取代；
所述R3为羟基；
所述n表示的是1-10的整数，包括1和10。
2.如权利要求1所述的靛玉红衍生物用于CDK/HDAC双靶标抑制剂类抗肿瘤药物的制备的用途。
3.如权利要求1所述靛玉红衍生物的合成方法，其特征在于，该方法的合成途径如下：其中，R1、R2、R3、n如权利要求1所述。
说明书 :
一种靛玉红衍生物及其作为CDK/HDAC双靶标抑制剂的应用
技术领域
[0001] 本发明属于药物化学领域，具体涉及一种靛玉红衍生物及其作为 DK/HDAC双靶标抑制剂的应用。
背景技术
[0002] CDK即周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases),是一 组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，CDK通过对丝氨酸/苏氨酸蛋白的化学作 用驱动细胞周期，和周期蛋白cyclin协同作用，是细胞周期调控中 的重要因子；CDK可以和cyclin结合形成异二聚体，其中CDK为催 化亚基，cyclin为调节亚基，不同的cyclin—CDK复合物，通过CDK 活性，催化不同底物磷酸化，而实现对细胞周期不同时相的推进和转 化作用。其在调节细胞周期进程，转录和其他主要生物过程(包括神 经元分化和代谢)中起重要作用；由于细胞周期蛋白或CDK的扩增， 过表达或突变导致这些激酶的组成型或去调节的过度活跃有助于癌 细胞的增殖，这些激酶的异常活性也已在多种人类癌症中被报道。因 此，这些激酶构成的增殖的生物标志物在癌症治疗中是一个十分有吸 引力的药理学靶标。
[0003] 组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)是从组蛋白上 的正乙酰赖氨酸氨基酸中除去乙酰基的酶，其作用是促进组蛋白和 DNA骨架之间的高亲和力结合，抑制浓缩DNA的转录；当HDAC过度 表达并被转录因子募集，就会导致特定基因的不正常抑制，从而导致 癌症；直肠癌、胃癌、胃癌、宫颈癌中HDAC家族表达明显高于正常 水平；而HDAC抑制剂可以通过抑制HDAC来控制组蛋白和非组蛋白的 乙酰化水平，从而对癌细胞产生多种作用，如肿瘤细胞的阻滞、分化 和活跃的细胞凋亡；其对肿瘤细胞迁移、侵袭、转移的抑制作用和抗 肿瘤血管生成作用也被证实；组蛋白去乙酰化酶抑制剂是以HDACs为 靶点开发的抗肿瘤药物，能使细胞周期的停滞以及诱导肿瘤细胞凋 亡，在体外和体内都具有明显抗肿瘤作用；研发HDAC抑制剂已经成 为有效治疗肿瘤的一个新热点。
[0004] 相关研究证明CDK抑制剂与HDAC抑制剂联合用药能有效治疗神 经母细胞瘤、黑色素瘤和套细胞淋巴瘤等，而关于单一化学抑制剂对 CDK和HDAC双功能靶向的文献少有报道，因此我们设计一种靶向CDK 和HDAC的新型单分子，以避免更多单独药物的副作用，例如药物- 药物相互作用或不同的物理化学性质。
[0005] 1999年发现靛玉红可抑制细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)与ATP 结合，靛玉红成为靶向CDK的新的先导化合物。因此，我们基于靛玉 红的结构以及已上市的HDAC抑制剂SAHA的结构，设计合成一种靛玉 红衍生物作为CDK/HDAC双靶标抑制剂，以获得一种新型高效的抗肿 瘤药物。
发明内容
[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供一种靛玉红衍生物，所述抑制 剂的结构通式为：
[0007]
[0008] 所述R1为氢、卤素、烷基、甲氧基、氨基、硝基、杂环基、芳 基或三氟甲基，也可以是4位取代、5位取代、6位取代、7位取代。
[0009] 所述R2为氢、卤素、烷基、甲氧基、氨基、硝基、杂环基、芳 基或三氟甲基，也可以是4位取代、5位取代、6位取代、7位取代。
[0010] 所述R3为羟基、杂环基、芳基、环烷基或烷基。
[0011] 所述n表示的是1-10的整数，包括1和10。
[0012] 上述的靛玉红衍生物用于CDK/HDAC双靶标抑制剂。
[0013] 上靛玉红衍生物的合成途径如下：
[0014]
[0015] 上述靛玉红衍生物的合成途径具体包括以下步骤：
[0016] 步骤a：将KOH(60mmol,2eq)与K2CO3(30mmol,1eq)用水(60mL)溶 解，加入邻溴苯甲酸(30mmol,1eq)和甘氨酸(45mmol,1.5eq)，再 加入铜粉(0.17mmol)，加热回流12h，过滤，取滤液，加入1N盐酸 (120mL)酸化，收集沉淀物，减压干燥，得到产物A。
[0017] 步骤b：称取产物A(20mmol,1eq)于圆底烧瓶中，用乙酸酐(35mL) 溶解，再加入NaOAc(30mmol,2eq)，加热回流5h后冷却至60℃，减 压蒸馏除去乙酸酐，然后用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水硫 酸钠干燥，旋干，最后进行柱层析分离纯化即得产物B；
[0018] 步骤c：将产物B(4mmol,1eq)和靛红(4.5mmol,1.125eq)加入烧 瓶中，换气使其处于惰性气体环境保护下进行反应，加入冰醋酸(20mL) 和浓盐酸(3.4mL)，室温下搅拌过夜，然后用水(30mL)稀释，抽滤， 加入1N HCl/EtOH重结晶，抽滤，得到产物C；
[0019] 步骤d：将产物C(0.38mmol,1eq)和盐酸羟胺(8.36mmol,22eq) 加入烧瓶中，加入吡啶(4mL)溶解，加热回流4h，用2N盐酸(50mL) 洗涤，过滤，得到靛玉红-3’-肟；
[0020] 步骤e：将靛玉红-3’-肟(0.18mmol,1eq)加入烧瓶中，用乙醇(3mL) 溶解，加入溴代脂肪酸酯(1.98mmol,11eq)，加入四甲基胍(209μL)， 加热回流2h，用水和1N盐酸稀释，过滤取滤渣，用水洗涤滤渣，干 燥得到产物E；
[0021] 步骤f：取产物E(0.14mmol,1eq)与圆底烧瓶中，冰浴下加THF： H2O＝3:1溶液(8mL)溶解，搅拌10min，另取LiOH(0.7mmol，5eq)用溶 剂溶解后再加入瓶中，约30min后TLC监测反应，充分反应后加饱和 氯化铵溶液淬灭反应，然后用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤，无水 硫酸钠干燥，浓缩后纯化得产物F；
[0022] 步骤g：将产物F(0.3mmol,1eq)加入圆底烧瓶中，用THF溶解， 加入DIEA(0.6mmol,2eq)反应10min，加入HBTU(0.45mmol,1.5eq)反 应10min，再加入胺类化合物(0.6mmol,
2eq)，反应2h后监测反应， 充分反应后，旋干，用二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗涤，干燥过滤后 旋干，最后进行柱层析分离纯化即得目标产物。
2eq)，反应2h后监测反应， 充分反应后，旋干，用二氯甲烷萃取，饱和食盐水洗涤，干燥过滤后 旋干，最后进行柱层析分离纯化即得目标产物。
[0023] 有益效果
[0024] 本发明提供的靛玉红衍生物，能够有效抑制CDK/HDAC的活性，因 此可作为CDK/HDAC的双靶标抑制剂，并且本发明合成原料便宜、成本 较低，抗肿瘤活性明显，可用于高效低毒的新型CDK/HDAC双靶标抑制 剂类抗肿瘤药物。
具体实施方式
[0025] 下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然， 所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例； 基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动 前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0026] 实施例1
[0027] 采用以下靛玉红衍生物的合成路线：
[0028]
[0029] 其中n、R1、R2、R3的定义见表1：
[0030] 表1
[0031]
[0032] 化合物1-6的13C-NMR、1H-NMR和HR-MS数据
[0033] 化合物1：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)：δ11.70(s,1H),10.80(s,1H),10.40 (s,1H),8.71(s,1H),8.61(d,J＝7.7Hz,1H),8.11(d,J＝7.1Hz,1H),7.42(s,2H), 7.15(t,J＝
7.5Hz,1H),7.05–6.98(m,2H),6.90(d,J＝7.4Hz,1H),4.58(s, 2H),2.03-1.96(m,2H),
1.90(s,2H),1.66–1.55(m,2H),1.47(d,J＝6.2Hz,2H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)：171.39,
169.51,151.61,145.98,144.51,139.18, 133.31,128.68,126.90,123.74,122.87,
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8.61(d,J＝7.8Hz,2H),8.10(d,J＝7.6Hz,1H),7.41(s,2H),7.14(t,J＝7.5 Hz,1H),7.07-
6.95(m,2H),6.92(d,J＝7.5Hz,1H),4.57(t,J＝5.6Hz,2H),1.96(t, J＝7.0Hz,2H),1.93–
1.82(m,2H),1.58–1.41(m,4H),1.35(d,J＝6.3Hz, 2H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6):
171.38,169.61,151.59,145.97,144.50,139.21, 133.29,128.63,126.89,123.71,
122.86,122.01,121.09,116.70,112.29,109.54, 100.56,76.90,32.72,29.02,28.90,
25.69,25.60.HR-MS(ESI)m/z calculated C23H23N4O4-[M-H]- for 419.1725,found
419.1721.
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1.90(s,2H),1.66–1.55(m,2H),1.47(d,J＝6.2Hz,2H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6)：171.39,
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25.69,25.60.HR-MS(ESI)m/z calculated C23H23N4O4-[M-H]- for 419.1725,found
419.1721.
[0035] 化合物3：1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ11.66(s,1H),10.76(s,1H),10.32 (s,1H),8.64(s,1H),8.57(d,J＝7.8Hz,1H),8.06(d,J＝7.6Hz,1H),7.37(s,2H), 7.11(t,J＝
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29.04,25.85,25.59.HR-MS(ESI)m/z calculated C24H25N4O4-[M-H]- for 433.1881,found
433.1882.
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433.1882.
[0036] 化合物4：1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ11.70(s,1H),10.79(s,1H),10.42(s, 1H),8.61(d,J＝7.8Hz,2H),8.10(d,J＝7.6Hz,1H),7.36(s,2H),7.14(t,J＝7.5Hz, 1H),7.03((t,J＝7.3Hz,1H),6.85(d,J＝7.5Hz,1H),4.58(t,J＝5.6Hz,2H),1.95 (t,J＝7.0Hz,
2H),1.92–1.83(m,2H),1.56–1.41(m,4H),1.34(d,J＝6.3Hz, 2H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6):170.32,169.91,164.64,155.39,142.87,140.40, 133.81,131.89,130.12,130.02，
124.87,118.81,118.62,117.81,117.86,114.11, 112.69,75.6，32.54,28.68,27.64,
25.69,24.91HR-MS(ESI)m/z calculated C24H22BrN4O4-[M-H]- for 497.0830,found
497.0826.
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124.87,118.81,118.62,117.81,117.86,114.11, 112.69,75.6，32.54,28.68,27.64,
25.69,24.91HR-MS(ESI)m/z calculated C24H22BrN4O4-[M-H]- for 497.0830,found
497.0826.
[0037] 化合物5：1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.53(s,1H),10.40(s,1H),10.02(s, 1H),8.74(s,1H),8.12(d,J＝7.8Hz,2H),7.36(s,2H),7.16(t,J＝7.4Hz,2H),7.13 (t,J＝
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[0038] 化合物6:1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.63(s,1H),10.43(s,1H),10.32(s, 1H),8.64(s,1H),8.06(d,J＝7.6Hz,2H),7.25(s,2H),7.13(t,J＝7.5Hz,2H), 7.09(t,J＝
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7.3Hz,2H),6.86(d,J＝7.5Hz,2H),5.22(s,1H)4.63(t,J＝5.6Hz,2H), 1.98(t,J＝7.0Hz,
2H),1.95–1.80(m,4H),1.65–1.56(m,4H),1.33(d,J＝6.3Hz, 2H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6):179.78,169.32,164.56,154.34,148.57,143.87, 141.60,131.72,130.76,128.52,
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[0039] 化合物7:1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.52(s,1H),10.39(s,1H),10.33(s, 1H),8.59(s,1H),8.07(d,J＝7.5Hz,2H),7.27(s,2H),7.15(t,J＝7.5Hz,2H),7.08(t, J＝
7.0Hz,1H),6.84(d,J＝7.5Hz,2H),5.21(s,1H)4.65(t,J＝5.6Hz,2H),1.97(t, J＝7.0Hz,
2H),1.93–1.78(m,4H),1.66–1.58(m,4H),1.32(d,J＝6.3Hz,2H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6):179.76,169.35,164.54,154.32,148.53,143.85,141.62, 131.73,130.77,128.53,
125.62,125.33,125.26,124.24,123.16,122.64, 118.46,118.28,117.65,114.46,
114.19,112.42,110.13,76.32，38.56,28.57,27.65, 25.76,24.95.HR-MS(ESI)m/z calculated C29H27BrN5O3-[M-H]- for 572.1303, found 572.1305.
7.0Hz,1H),6.84(d,J＝7.5Hz,2H),5.21(s,1H)4.65(t,J＝5.6Hz,2H),1.97(t, J＝7.0Hz,
2H),1.93–1.78(m,4H),1.66–1.58(m,4H),1.32(d,J＝6.3Hz,2H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6):179.76,169.35,164.54,154.32,148.53,143.85,141.62, 131.73,130.77,128.53,
125.62,125.33,125.26,124.24,123.16,122.64, 118.46,118.28,117.65,114.46,
114.19,112.42,110.13,76.32，38.56,28.57,27.65, 25.76,24.95.HR-MS(ESI)m/z calculated C29H27BrN5O3-[M-H]- for 572.1303, found 572.1305.
[0040] 实施例2：
[0041] 靛玉红衍生物作为CDK/HDAC双靶标抑制剂在体外的CDK抑制活性和 HDAC抑制活性
[0042] HDAC抑制活性筛选
[0043] 在EP管中加入反应体系需要的溶液(详见表2)，最后加核提取物37℃孵 育1h,(第一个样品加入后间隔30s，再加入第二个样品中)，反应完成后，30s 取一个插冰上，再加入2×胰酶继续孵育1h，反应完成后，30s取一个插冰上， 再取120ul加入96孔板中，Ex：360nm，Em：460nm测荧光(整个过程注意避 光操作)。最后将不同浓度化合物的抑制率％和浓度进行S曲线拟合，计算出IC50 值。
[0044] 表2
[0045]
[0046] *单位：μL；底物：(Boc-Lys(acetyl)-AMC；SAHA终浓度：1μM；靛玉红终浓度： 1μM；
[0047] *缓冲液：1M Tris-HCl 5μL、5M NaCl 3μL、30mM KCl 10μL、10mM MgCl2 10μL。
[0048] 化合物1～7的HDAC抑制活性结果如表3：
[0049] 表3对HDAC的IC50值
[0050]
[0051] CDK抑制活性筛选
[0052] 使用 Luminescent Kinase Assays试剂盒测试化合物1-7对CDK 的抑制活性，以靛玉红为阳性对照，按照操作说明书在测试板中每孔加入激酶、 ATP-荧光底物和不同浓度待测物，并将测试板在30℃下反应1h后，每孔再加入 Kinase Glo Plus并继续在30℃下放置20min。使用酶标仪读取发光强度，分析实 验结果，并计算出IC50。
[0053] 化合物1～7的CDK抑制活性结果如表4：
[0054] 表4对CDK的IC50值
[0055]
[0056]
[0057] *单位：μM；nd：未确定。
[0058] 实施例3：
[0059] 靛玉红衍生物作为CDK/HDAC双靶标抑制剂对不同肿瘤细胞的抗肿瘤活 性。
[0060] 采用公认的可用于大规模抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验测定的四甲基氮唑 蓝比色法(MTT)评价候选化合物对5种人癌细胞株的抗细胞增殖活性。测试化合 物为化合物2、4；阴性对照组为不加药组；阳性对照药为临床上使用的抗肿瘤 药物Vorinostat(SAHA)。
[0061] 细胞株：人乳腺癌细胞MCF-7、人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549、 人结肠癌细胞SW480、宫颈癌细胞Hela。
[0062] 细胞增殖抑制率＝(阴性对照组OD值-药物组OD值)*100％/阴性对照组OD 值。通过化合物系列浓度的抑制率计算得到IC50值(单位为μM)，结果见表5。
[0063] 表5 MTT法测定化合物2和4对不同肿瘤细胞的IC50值(单位为μM)
[0064]
[0065] 在此有必要指出的是，以上实施例和试验例仅限于对本发明的技 术方案做进一步的阐述和理解，不能理解为对本发明的技术方案做进 一步的限定，本领域技术人员作出的非突出实质性特征和显著进步的 发明创造，仍然属于本发明的保护范畴。