连接子，载药连接子、细胞穿透肽偶联药物、抗体偶联药物及其制备方法

摘要

本发明涉及药物递送领域，公开了连接子，载药连接子、细胞穿透肽偶联药物、抗体偶联药物及其制备方法，该连接子具有式(I)所示的结构，本发明提供的光响应自催化断裂的连接子和载药连接子能够将药物偶联至多肽或蛋白质类递送载体上，能够实现药物向细胞内的可控递送。

权利要求

1.一种光响应自催化断裂式的连接子，其特征在于，该连接子具有式(I1)所示的结构，其中，在式(I1)中，R1为选自4,5-二甲氧基-2-硝基苄基、2-硝基苄基、1-(2-硝基苄基)乙烷基中的至少一种光敏保护基；

n为2或3。

2.根据权利要求1所述的连接子，其中，在式(I1)中，R1为4,5-二甲氧基-2-硝基苄基，n为3。

3.根据权利要求1所述的连接子，其中，所述连接子具有式(I2)所示的结构，且在式(I2)中，R1为4,5-二甲氧基-2-硝基苄基；

4.一种光响应自催化断裂式的载药连接子，其特征在于，该载药连接子具有式(II1)所示的结构，在式(II1)中，DOX为由阿霉素提供的基团，其中，R1的定义与权利要求1-3中任意一项中的定义相同。

5.一种制备式(II1)所示的载药连接子的方法，其特征在于，该方法包括：(1)在二异丙基乙基胺和溶剂存在下，将式(1)所示的化合物与三光气进行反应，得到式(2)所示的化合物；

(2)在二异丙基乙基胺和溶剂存在下，将式(2)所示的化合物与阿霉素进行反应，得到式(3)所示的化合物；

(3)在硫酸铜、二甲基甲酰胺和水存在下，将式(3)所示的化合物与式(4)所示的叠氮化聚乙二醇马来酰亚胺和抗坏血酸盐进行反应，得到所述载药连接子；

其中，在式(II1)、式(1)、式(2)和式(3)中，R1为选自4,5-二甲氧基-2-硝基苄基、2-硝基苄基、1-(2-硝基苄基)乙烷基中的至少一种光敏保护基。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述式(1)所示的化合物与二异丙基乙基胺、三光气的用量摩尔比为1：(2-3)：(1-1.5)。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述溶剂为四氢呋喃。

8.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述反应的条件包括：温度为10-40℃，时间为4-24h，搅拌速度为50-1000rpm。

9.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤(2)中，所述式(2)所示的化合物与所述二异丙基乙基胺、所述阿霉素的用量摩尔比为1：(2-3)：(1-1.5)。

10.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤(2)中，所述溶剂为二氯甲烷。

11.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤(2)中，所述反应的条件包括：温度为10-

40℃，时间为1-15h，搅拌速度为50-1000rpm。

12.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤(3)中，式(3)所示的化合物与式(4)所示的叠氮化聚乙二醇马来酰亚胺、抗坏血酸盐和硫酸铜的用量摩尔比为1：(1-1.5)：(0.8-

1.2)：(0.4-0.6)。

13.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤(3)中，所述反应的条件包括：温度为10-

40℃，时间为2-30h，搅拌速度为50-1000rpm。

14.一种制备细胞穿透肽偶联药物的方法，其特征在于，该方法包括：(1)将权利要求4所述的载药连接子溶于溶剂中，得到载药连接子储存液；

(2)将所述载药连接子储存液与细胞穿透肽H3-V35C进行加成反应，得到所述细胞穿透肽偶联药物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中，在步骤(2)中，所述载药连接子储存液与所述细胞穿透肽H3-V35C的用量摩尔比为(1-1.5)：1。

16.根据权利要求14所述的方法，其中，在步骤(2)中，所述加成反应的条件包括：反应温度为20-60℃，反应时间为0.5-8h。

17.根据权利要求14所述的方法，其中，在步骤(2)中，所述加成反应在HEPES缓冲液存在下进行。

18.由权利要求14-17中任意一项所述的方法制备得到的细胞穿透肽偶联药物。

19.一种制备抗体偶联药物的方法，其特征在于，该方法包括：(1)将权利要求4所述的载药连接子溶于溶剂中，得到载药连接子储存液；以及将单克隆抗体与还原剂溶液进行还原反应，得到抗体还原后的溶液；

(2)将所述载药连接子储存液和所述抗体还原后的溶液进行加成反应，得到所述抗体偶联药物；

其中，在步骤(1)中，所述单克隆抗体为曲妥珠单克隆抗体。

20.由权利要求19所述的方法制备得到的抗体偶联药物。

说明书

连接子，载药连接子、细胞穿透肽偶联药物、抗体偶联药物及

其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及药物递送领域，具体涉及一种光响应自催化断裂式的连接子、一种光响应自催化断裂式的载药连接子及其制备方法、一种制备细胞穿透肽偶联药物的方法以及由该方法制备得到的细胞穿透肽偶联药物、一种制备抗体偶联药物的方法以及由该方法制备得到的抗体偶联药物。

背景技术

[0002] 前药策略被广泛运用于药物的设计和开发中，其目的是提高母体药物的药代动力学性质，尤其是靶向递送能力(Nat.Rev.Drug  Discov.2108,17,559-587；Chem.Soc.Rev.2019,48,1077-1094)。

[0003] 一般来说，前药的构建是通过含有“触发开关”的连接子将药物分子与载体偶联而成。当前药递送至靶细胞或组织后，在内源性刺激因素(pH值变化、酶、氧化还原反应)或外源性刺激因素(光小分子引发剂)的作用下，裂解连接子，释放出活性药物，继而发挥药效。因此，连接子的合理设计是实现前药高效、可控递送的关键。

[0004] 在某些情况下，药物与载体之间的空间距离可能破坏连接子的裂解，导致药物的不完全释放。

[0005] 为了克服这一问题，研究者发展了“自我牺牲(self-immolative)”的连接子(Angew.Chem.Int.Ed.2003,42,4494-4499)。经过刺激因素引发，“自我牺牲”连接子经过串联分解反应，能够高效释放出活性药物。

[0006] 迄今，只有两类“自我牺牲”式的连接子得到了广泛应用；一类是经过串联消除机制，另一类是通过环化机制(Angew.Chem.Int.Ed.2015,54,7492-7509；Chem.Eng.J.2018,340,24-31)。然而，这两类连接子在裂解过程中，均可能产生具有毒副作用的产物，如醌甲基化物，从而导致额外的副作用。

[0007] 因此，发展新型、生物兼容、高效的“自我牺牲”式的连接子对于前药的设计开发是很有必要的。

发明内容

[0008] 本发明的目的之一是为了克服现有技术存在的缺陷，提供一种新型光响应性、自催化断裂式的连接子及载药连接子。

[0009] 本发明的目的之二是提供细胞穿透肽偶联药物和抗体偶联药物，实现抗癌药物向癌细胞内的靶向、可控递送。

[0010] 为了实现上述目的，本发明的第一方面提供一种光响应自催化断裂式的连接子，该连接子具有式(I)所示的结构，

[0011]

[0012] 其中，在式(I)中，

[0013] R1为选自4,5-二甲氧基-2-硝基苄基、2-硝基苄基、1-(2-硝基苄基)乙烷基中的至少一种光敏保护基；

[0014] R2为含有或者不含有选自N、O、S中的至少一种杂原子的链状烷基，形成R2的链状烷基中的主链上的原子数为10-60，所述链状烷基的主链上含有或者不含有饱和环结构、含有或者不含有不饱和环结构、含有或者不含有烯基、含有或者不含有炔基，且所述链状烷基的主链为未取代的基团或为由选自C1-3的烷基、卤素中的至少一种基团取代的基团，或者所述链状烷基的主链上的至少一个C原子与O原子之间形成双键结构。

[0015] 本发明的第二方面提供一种光响应自催化断裂式的载药连接子，该载药连接子具有式(II)所示的结构，其中，在式(II)中，R1和R2的定义与权利要求1或2中的定义相同，M为含有选自-NH2、-SH、-OH中的至少一种可反应基团的抗肿瘤药物提供的基团，Y为由M提供的-NH-、-S-或-O-；

[0016]

[0017] 本发明的第三方面提供一种制备式(II1)的载药连接子的方法，该方法包括：

[0018]

[0019] (1)在二异丙基乙基胺和溶剂存在下，将式(1)所示的化合物与三光气进行反应，得到式(2)所示的化合物；

[0020] (2)在二异丙基乙基胺和溶剂存在下，将式(2)所示的化合物与阿霉素进行反应，得到式(3)所示的化合物；

[0021] (3)在硫酸铜、二甲基甲酰胺和水存在下，将式(3)所示的化合物与式(4)所示的叠氮化聚乙二醇马来酰亚胺和抗坏血酸盐进行反应，得到所述载药连接子；

[0022]

[0023] 其中，在式(II1)、式(1)、式(2)和式(3)中，R1为选自4,5-二甲氧基-2-硝基苄基、2-硝基苄基、1-(2-硝基苄基)乙烷基中的至少一种光敏保护基。

[0024] 本发明的第四方面提供一种制备细胞穿透肽偶联药物的方法，该方法包括：

[0025] (1)将本文所述的载药连接子溶于溶剂中，得到载药连接子储存液；

[0026] (2)将所述载药连接子储存液与细胞穿透肽H3-V35C进行加成反应，得到所述细胞穿透肽偶联药物。

[0027] 本发明的第五方面提供由前文所述的方法制备得到的细胞穿透肽偶联药物。

[0028] 本发明的第六方面提供一种制备抗体偶联药物的方法，该方法包括：

[0029] (1)将前文所述的载药连接子溶于溶剂中，得到载药连接子储存液；以及将单克隆抗体与还原剂溶液进行还原反应，得到抗体还原后的溶液；

[0030] (2)将所述载药连接子储存液和所述抗体还原后的溶液进行加成反应，得到所述抗体偶联药物。

[0031] 本发明的第七方面提供由前文所述的方法制备得到的抗体偶联药物。

[0032] 本发明提供的光响应自催化断裂的连接子和载药连接子能够将药物偶联至多肽或蛋白质类递送载体上，能够实现药物向细胞内的可控递送。

附图说明

[0033] 图1是激光共聚焦显微镜分析药物阿霉素(DOX)在HeLa细胞内的定位；

[0034] 图2是细胞穿透肽偶联药物H3-PC4AP-DOX在HeLa细胞中的毒性研究；

[0035] 图3为光照后，抗体偶联药物Trastuzumab-PC4P-DOX在血清中释放药物DOX的效率；

[0036] 图4为激光共聚焦显微镜分析曲妥珠单抗Trastuzumab和抗体偶联药物Trastuzumab-PC4P-DOX对HER2不同表达水平乳腺癌细胞的结合亲和力，其中图4a表示曲妥珠单抗Trastuzumab和抗体偶联药物Trastuzumab-PC4P-DOX都能够识别并结合HER2高表达的SK-RB-3细胞，图4b表示曲妥珠单抗Trastuzumab和抗体偶联药物Trastuzumab-PC4P-DOX不能识别和结合HER2低表达的MCF7细胞；

[0037] 图5为抗体偶联药物Trastuzumab-PC4AP-DOX在不同HER2表达水平的乳腺癌细胞中的毒性，其中图5a表示抗体偶联药物Trastuzumab-PC4AP-DOX在HER2高表达的SK-BR-3细胞中的毒性具有剂量依赖性，图5b对比抗体偶联药物Trastuzumab-PC4AP-DOX在HER2高表达的SK-BR-3细胞与HER2低表达的MCF7细胞中的毒性差异。

具体实施方式

[0038] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

[0039] 如前所述，本发明的第一方面提供了一种光响应自催化断裂式的连接子，该连接子具有式(I)所示的结构，

[0040]

[0041] 其中，在式(I)中，

[0042] R1为选自4,5-二甲氧基-2-硝基苄基、2-硝基苄基、1-(2-硝基苄基)乙烷基中的至少一种光敏保护基；

[0043] R2为含有或者不含有选自N、O、S中的至少一种杂原子的链状烷基，形成R2的链状烷基中的主链上的原子数为10-60，所述链状烷基的主链上含有或者不含有饱和环结构、含有或者不含有不饱和环结构、含有或者不含有烯基、含有或者不含有炔基，且所述链状烷基的主链为未取代的基团或为由选自C1-3的烷基、卤素中的至少一种基团取代的基团，或者所述链状烷基的主链上的至少一个C原子与O原子之间形成双键结构。

[0044] 根据一种优选的具体实施方式，在式(I)中，所述连接子具有式(I1)所示的结构，[0045]

[0046] 其中，在式(I1)中，

[0047] R1为选自4,5-二甲氧基-2-硝基苄基、2-硝基苄基、1-(2-硝基苄基)乙烷基中的至少一种光敏保护基；

[0048] n为大于等于2的正整数。

[0049] 根据另一种优选的具体实施方式，在式(I1)中，

[0050] R1为4,5-二甲氧基-2-硝基苄基，n为3。

[0051] 根据一种特别优选的具体实施方式，所述连接子具有式(I2)所示的结构，且在式(I2)中，R1为4,5-二甲氧基-2-硝基苄基；

[0052]

[0053] 如前所述，本发明的第二方面提供了一种光响应自催化断裂式的载药连接子，该载药连接子具有式(II)所示的结构，其中，在式(II)中，R1和R2的定义与权利要求1或2中的定义相同，M为含有选自-NH2、-SH、-OH中的至少一种可反应基团的抗肿瘤药物提供的基团，Y为由M提供的-NH-、-S-或-O-；

[0054]

[0055] 根据一种优选的具体实施方式，所述载药连接子具有式(II1)所示的结构，在式(II1)中，DOX为由阿霉素提供的基团，

[0056]

[0057] 如前所述，本发明的第三方面提供了一种制备式(II1)所示的载药连接子的方法，该方法包括：

[0058]

[0059] (1)在二异丙基乙基胺和溶剂存在下，将式(1)所示的化合物与三光气进行反应，得到式(2)所示的化合物；

[0060] (2)在二异丙基乙基胺和溶剂存在下，将式(2)所示的化合物与阿霉素进行反应，得到式(3)所示的化合物；

[0061] (3)在硫酸铜、二甲基甲酰胺和水存在下，将式(3)所示的化合物与式(4)所示的叠氮化聚乙二醇马来酰亚胺和抗坏血酸盐进行反应，得到所述载药连接子；

[0062]

[0063]

[0064] 其中，在式(II1)、式(1)、式(2)和式(3)中，R1为选自4,5-二甲氧基-2-硝基苄基、2-硝基苄基、1-(2-硝基苄基)乙烷基中的至少一种光敏保护基。

[0065] 优选情况下，在步骤(1)中，所述式(1)所示的化合物与二异丙基乙基胺、三光气的用量摩尔比为1：(2-3)：(1-1.5)。

[0066] 优选地，在步骤(1)中，所述溶剂为四氢呋喃。

[0067] 优选地，在步骤(1)中，所述反应的条件包括：温度为10-40℃，时间为4-24h，搅拌速度为50-1000rpm。

[0068] 优选情况下，在步骤(2)中，所述式(2)所示的化合物与所述二异丙基乙基胺、所述药物的用量摩尔比为1：(2-3)：(1-1.5)。

[0069] 优选地，在步骤(2)中，所述溶剂为二氯甲烷。

[0070] 优选地，在步骤(2)中，所述反应的条件包括：温度为10-40℃，时间为1-15h，搅拌速度为50-1000rpm。

[0071] 优选情况下，在步骤(3)中，式(3)所示的化合物与式(4)所示的叠氮化聚乙二醇马来酰亚胺、抗坏血酸盐和硫酸铜的用量摩尔比为1：(1-1.5)：(0.8-1.2)：(0.4-0.6)。

[0072] 优选地，在步骤(3)中，所述反应的条件包括：温度为10-40℃，时间为2-30h，搅拌速度为50-1000rpm。

[0073] 本发明的前述步骤(1)、步骤(2)和步骤(3)中还可以结合采用本领域内常规采用的各种后处理手段对获得的中间体等进行后处理，本发明在此不再详述，本领域技术人员不应理解为对本发明的限制。

[0074] 本发明对制备式(1)所示的化合物的方法没有特别的限制，本领域技术人员根据式(1)所示的化合物的结构式可以采用有机合成领域内常规的制备方法获得。本发明的以下示例性地提供一种优选的具体实施方式制备式(1)所示的化合物，本领域技术人员不应理解为对本发明的限制。

[0075]

[0076] (1)将式(a1)所示的化合物、咪唑、叔丁基二苯基氯硅烷和二甲基甲酰胺进行第一混合，形成第一混合溶液，将反应后得到的有机相洗涤、干燥、过滤、柱层析得到式(a2)所示的化合物，其中，R2为叔丁基二苯基氯硅烷提供的基团，R3为苯甲酰基；

[0077] (2)将式(a2)所示的化合物与甲醇钠甲醇溶液和二氯甲烷进行第二混合，形成第二混合溶液，然后将所述第二混合溶液旋蒸除去溶剂，柱层析得到式(a3)所示的化合物；

[0078] (3)将式(a3)所示的化合物与氢化钠、四氢呋喃进行第三混合后冷却，形成第三混合溶液；再将所述第三混合溶液与炔丙基溴进行反应；然后将反应后得到的有机相洗涤、干燥、过滤、柱层析得到式(a4)所示的化合物；

[0079] (4)将式(a4)所示的化合物与三氟化硼乙醚溶液、丙二硫醇、二氯甲烷进行反应，然后将反应后得到的有机相洗涤、干燥、过滤、柱层析得到式(a5)所示的化合物；

[0080] (5)将式(a5)所示的化合物与草酰氯、三乙胺、二甲基亚砜进行反应，然后将反应后得到的有机相洗涤、干燥、过滤、柱层析得到式(a6)所示的化合物；

[0081] (6)将所述式(a6)所示的化合物与N-溴代丁二酰亚胺，R1所示保护基的醇化合物，乙腈进行混合，形成混合溶液，然后将所述混合溶液旋蒸除去溶剂，柱层析得到式(a7)所示的化合物；

[0082] (7)将式(a7)所示的化合物与四正丁基氟化铵，四氢呋喃进行反应，然后将反应后得到的溶液旋蒸除掉溶剂，柱层析得到式(1)所示的化合物。

[0083] 优选地，在前述制备式(1)所示的化合物的优选具体实施方式中，在步骤(1)中，式(a1)所示的化合物、咪唑、叔丁基二苯基氯硅烷和二甲基甲酰胺的用量比为1mmol:(3-4)mmol:(1.2-1.5)mmol:(50-70)mL；更优选，所述第一混合的条件包括：温度为18-25℃，时间为10-12小时，搅拌速度为400-600转/分钟。

[0084] 优选地，在前述制备式(1)所示的化合物的优选具体实施方式中，在步骤(2)中，式(a2)所示的化合物与甲醇钠甲醇溶液和二氯甲烷的用量比为1mmol:(0.3-0.4)mL:(4-7)mL；更优选地，所述第二混合的条件包括：温度为18-25℃，时间为0.5-1小时，搅拌速度为400-600转/分钟。

[0085] 优选地，在前述制备式(1)所示的化合物的优选具体实施方式中，在步骤(3)中，式(a3)所示的化合物与所述炔丙基溴、所述氢化钠和所述四氢呋喃的用量比为1mmol:(2-3)mmol:(2-3)mmol：(3-5)mL。更优选地，所述第三混合的条件包括：温度为-10℃至10℃，时间为15-30分钟，搅拌速度为400-600转/分钟。优选地，将所述第三混合溶液与炔丙基溴进行反应的条件包括：温度为18-25℃，时间为4-6小时，搅拌速度为400-600转/分钟。

[0086] 优选地，在前述制备式(1)所示的化合物的优选具体实施方式中，在步骤(4)中，式(a4)所示的化合物与丙二硫醇、三氟化硼乙醚溶液、二氯甲烷的用量的比为1mmol:(1.0-1.5)mmol:(2.0-2.5)mmol:(4-6)mL；优选地，步骤(4)中的所述反应的条件包括：温度为-5℃至0℃，时间为10-30分钟，搅拌速度为400-600转/分钟，所述三氟化硼乙醚以滴加的方式加入体系，滴加速率为10-15滴/分钟。

[0087] 优选地，在前述制备式(1)所示的化合物的优选具体实施方式中，在步骤(5)中，式(a5)所示的化合物、草酰氯、二甲基亚砜、三乙胺和二氯甲烷的用量的比为1mmol:(1.0-1.5)mmol:(2.0-2.5)mmol:(4.0-6.0)mmol:(4-6)mL；优选地，在步骤(5)中，所述反应过程包括：第一阶段的反应条件包括温度为-78℃，时间为40-60分钟，搅拌速度为400-600转/分钟，所述二甲基亚砜以滴加的方式加入体系，滴加速率为10-15滴/分钟；第二阶段的反应条件包括温度为-78℃，时间为40-60分钟，搅拌速度为400-600转/分钟，式(a5)所示的化合物以滴加的方式加入体系，滴加速率为10-15滴/分钟；第三阶段的反应条件包括温度为-78℃，时间为20-40分钟，搅拌速度为400-600转/分钟，所述三乙胺以滴加的方式加入体系。

[0088] 优选地，在前述制备式(1)所示的化合物的优选具体实施方式中，在步骤(6)中，式(a6)所示的化合物与N-溴代丁二酰亚胺，R1所示保护基的醇化合物，乙腈的用量的比为1mmol:(5-6)mmol:(4-6)mmol:(20-30)mL；优选地，在步骤(6)中，所述混合的条件包括：温度为-10℃，时间为40-60分钟，搅拌速度为400-600转/分钟。

[0089] 优选地，在前述制备式(1)所示的化合物的优选具体实施方式中，在步骤(7)中，式(a7)所示的化合物与四正丁基氟化铵，四氢呋喃的用量的比为1mmol:(2-3)mL:(8-12)mL；优选地，在步骤(7)中，所述反应的条件包括：温度为18-25℃，时间为1-3小时，搅拌速度为
400-600转/分钟。

[0090] 如前所述，本发明的第四方面提供了一种制备细胞穿透肽偶联药物的方法，该方法包括：

[0091] (1)将前文所述的载药连接子溶于溶剂中，得到载药连接子储存液；

[0092] (2)将所述载药连接子储存液与细胞穿透肽H3-V35C进行加成反应，得到所述细胞穿透肽偶联药物。

[0093] 优选地，在步骤(2)中，所述载药连接子储存液与所述细胞穿透肽H3-V35C的用量摩尔比为(1-1.5)：1。

[0094] 优选地，在步骤(2)中，所述加成反应的条件包括：反应温度为20-60℃，反应时间为0.5-8h。

[0095] 优选地，在步骤(2)中，所述加成反应在HEPES缓冲液存在下进行，优选所述HEPES缓冲液的pH值为7.5。

[0096] 本发明的方法优选还包括将得到的细胞穿透肽偶联药物进一步纯化的步骤，优选PD-MiniTrap-G25重力离心脱盐，收集所需组分峰NanoDrop测浓度后-80℃保存备用。

[0097] 本发明的所述细胞穿透肽偶联药物能够在肿瘤细胞内光控释放所负载的抗肿瘤药物，优选所述肿瘤细胞为HeLa细胞，光控条件优选为7mW/cm2，光照时间优选为5-7分钟。

[0098] 如前所述，本发明的第五方面提供了由前文所述的方法制备得到的细胞穿透肽偶联药物。

[0099] 优选所述细胞穿透肽偶联药物具有式(5)所示的结构：

[0100]

[0101] 其中，在式(5)中，Nv为4,5-二甲氧基-2-硝基苄基。

[0102] 如前所述，本发明的第六方面提供了一种制备抗体偶联药物的方法，该方法包括：

[0103] (1)将前文所述的载药连接子溶于溶剂中，得到载药连接子储存液；以及将单克隆抗体与还原剂溶液进行还原反应，得到抗体还原后的溶液；

[0104] (2)将所述载药连接子储存液和所述抗体还原后的溶液进行加成反应，得到所述抗体偶联药物。

[0105] 优选地，在步骤(1)中，所述单克隆抗体为曲妥珠单克隆抗体。

[0106] 优选地，所述还原反应的时间为2-3小时，反应温度为35～40℃，更优选为37℃。

[0107] 优选地，所述加成反应的温度为35～40℃，更优选为37℃。

[0108] 优选地，以抗体的摩尔量为基准，还原剂的摩尔量为抗体摩尔量的4倍。

[0109] 优选地，以抗体的摩尔量为基准，所述载药连接子的摩尔量为抗体摩尔量的8倍。

[0110] 本发明的方法优选还包括将得到的抗体偶联药物进一步纯化的步骤，优选PD-MiniTrap-G25重力离心脱盐，收集所需组分峰NanoDrop测浓度后-80℃保存备用。

[0111] 如前所述，本发明的第七方面提供了由前文所述的方法制备得到的抗体偶联药物。

[0112] 本发明优选所述抗体偶联药物具有式(6)所示的结构：

[0113]

[0114] 其中，在式(6)中，mAb为Trastuzumab(曲妥珠单克隆抗体)，n为大于1且小于等于8的整数，Nv为4,5-二甲氧基-2-硝基苄基。

[0115] 在本发明中，所述Trastuzumab单克隆抗体为重组人源化抗体，特异性结合于人HER2，所述抗体的分子量约为150kDa。M优选为抗癌药物阿霉素DOX，通过连接子上的马来酰亚胺基团与Trastuzumab抗体的链间二硫键发生迈克尔加成反应制备得到抗体偶联药物。

[0116] 本发明的所述抗体偶联药物能够在肿瘤细胞内实现药物的靶向递送。其中所述肿瘤细胞包括HER2阳性的SK-BR-3细胞和HER2阴性的MCF7细胞。

[0117] 本发明还具有如下具体的优点：

[0118] (1)本发明的载药连接子在生理条件下具有较好的稳定性，脱靶释放导致的副作用较低；

[0119] (2)光照后，药物能够高效快速的从载体上释放下来，连接子通过自催化式裂解，不会产生有毒的副产物；

[0120] (3)连接子是光响应性的，具有时空分辨率高，非侵入性的优点。

[0121] 基于此，本发明所述的新型的光响应性的、自催化断裂式连接子在药物的可控递送方面有着广泛的应用前景。

[0122] 以下将通过实例对本发明进行详细描述。以下实例中，在没有特别说明的情况下，使用的各种原料均来自商购。

[0123] 4,5-二甲氧基-2-硝基苄醇(自制)、叔丁基二苯基氯硅烷(百灵威，货号362315)、咪唑(Adamas，货号45081D)、炔丙基溴(innochem，货号A64659)、氢化钠(Adamas，货号81778A)、三氟化硼乙醚(TCI，货号A15275)、丙二硫醇(Adamas，货号13966C)、N-溴代丁二酰亚胺(阿拉丁，货号B105057)、二氯甲烷(天津市化学试剂供销公司，货号3975)、四氢呋喃(天津市化学试剂供销公司，货号2287)、二异丙基乙基胺(Alfa，货号A11801)、盐酸阿霉素(索莱宝，货号D8740-25)、三光气(innochem，货号A57532)、抗坏血酸钠(麦克林，货号S817635)、五水合硫酸铜(麦克林，货号C805356)。

[0124] 实施例1

[0125] 称取1.0eq的式(a1)所示化合物(其中，在式(a1)中，“R3”为苯甲酰基)，在氩气保护下用60mL无水二甲基甲酰胺溶解；然后向反应体系中加入3.0eq咪唑和1.5eq叔丁基二苯基氯硅烷。室温搅拌过夜后，乙酸乙酯稀释，水洗，分出的有机相无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，抽干得到粗产物式(a2)所示的化合物。

[0126] 取上一步产物(其中，在式(a2)中，“R2”为叔丁基二苯基硅基)溶于60mL二氯甲烷中，加入7.0mL的25质量％的甲醇钠甲醇溶液，室温搅拌1h。减压浓缩，柱层析分离得两个异构体，两步产率85％。

[0127] 异构体a：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.65-7.62(m,4H),7.44-7.38(m,6H),5.12(dd,J＝5.6,2.0Hz,1H),4.51-4.47(m,1H),4.10-4.07(m,1H),3.42(dd,J＝12.0,2.8Hz,1H),3.33(s,3H),3.11(dd,J＝12.0,4.4Hz,1H),2.19(ddd,J＝14.0,5.6,4.8Hz,1H),2.04(ddd,J＝14.0,6.8,2.4Hz,1H),1.06(s,9H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ135.7,133.5,133.5,
130.0,129.9,127.8,127.8,105.9,88.4,73.4,63.4,55.4,43.1,26.9,19.0.HRMS(ESI):
C22H30NaO4Si,[M+Na]+计算值409.1811,实测值409.1803.

[0128] 异构体b：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.67-7.64(m,4H),7.44-7.38(m,6H),4.91(dd,J＝5.6,2.4Hz,1H),4.21-4.17(m,1H),4.01-3.98(m,1H),3.57(dd,J＝12.0,2.8Hz,1H),3.38(s,3H),3.23(dd,J＝12.0,4.4Hz,1H),2.17-2.09(m,1H),1.91(ddd,J＝13.6,4.8,
2.4Hz,1H),1.07(s,9H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ135.8,135.8,133.7,133.6,129.9,
129.9,127.8,127.7,104.6,84.0,72.0,61.7,55.1,42.0,26.9,19.1.HRMS(ESI):
C22H30NaO4Si,[M+Na]+计算值409.1811,实测值409.1803.

[0129] 氩气保护下，将1.0eq式(a3)所示化合物溶于36mL干燥的四氢呋喃中，0℃下加入2.5eq.氢化钠，15分钟后室温继续搅拌30分钟，加入2.5eq.炔丙基溴，室温搅拌5小时。水淬灭，浓缩，乙酸乙酯稀释，饱和氯化钠洗涤，有机相无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析分离得式(a4)所示的化合物(收率95％)。

[0130] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.69-7.64(m,8H),7.46-7.37(m,12H),5.06(dd,J＝5.2,2.0Hz,1H),4.93(dd,J＝6.0,2.4Hz,1H),4.38-4.33(m,1H),4.21-4.17(m,1H),4.15-4.09(m,2H),4.06-4.05(m,2H)4.02(dd,J＝4.8,2.4Hz,1H),3.53(dd,J＝11.8,2.8Hz,1H),3.39(s,2H),3.34-3.24(m,2H),3.29(s,6H),3.38-3.35(m,2H),2.16-2.05(m,2H),1.97(ddd,J
13
＝13.2,6.8,2.0Hz,1H),1.86(ddd,J＝14.0,4.8,2.4Hz,1H),1.08(s,9H),1.07(s,9H). C NMR(101MHz,CDCl3)δ135.88,135.86,135.79,129.83,129.79,127.74,127.70,127.68,
105.43,104.64,85.18,82.62,79.63,79.43,74.60,74.40,73.85,72.53,71.40,68.91,
58.45,58.29,55.09,54.98,41.93,41.66,26.91,26.89,19.13,19.06.HRMS(ESI):
+
C25H32NaO4Si,[M+Na]计算值447.1968,实测值447.1975.

[0131] 取1.0eq.式(a4)所示化合物，1.2eq.丙二硫醇溶于25.0mL二氯甲烷中，冰浴下逐滴加入2.2eq.三氟化硼乙醚，继续搅拌15分钟。饱和碳酸氢钠淬灭反应，分液，有机相饱和食盐水洗，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析分离得产物(a5)(收率85％)。

[0132] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.75-7.70(m,4H),7.45-7.39(m,6H),4.11-4.03(m,3H),3.93(dd,J＝10.0,4.4Hz,1H),3.85-3.80(m,1H),3.51(dd,J＝10.0,4.0Hz,1H),3.42(dd,J＝9.6,7.6Hz,1H),2.71-2.63(m,3H),2.46-2.41(m,1H),2.39(t,J＝2.0Hz,1H),2.28(d,J＝4.0Hz,1H),2.09-2.02(m,1H),2.00-1.96(m,1H),1.87-1.72(m,2H),1.09(s,9H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ136.1,136.1,133.7,133.2,129.9,129.8,127.8,127.7,79.3,74.8,
73.3,71.5,70.5,58.4,43.7,38.5,30.2,29.6,27.1,25.8,19.6.HRMS(ESI):
C27H36NaO3S2Si,[M+Na]+计算值523.1773,实测值523.1761.

[0133] 氩气保护，-78℃条件下，向1.3eq.草酰氯的二氯甲烷溶液中逐滴滴加2.4eq.二甲亚砜，继续搅拌45分钟后，逐滴滴加式(a5)所示化合物1.0eq.，45分钟后滴加5.0eq.三乙胺，30分钟后升至室温。饱和氯化铵淬灭反应，搅拌15分钟后，分液，水相用二氯甲烷萃取，合并有机相，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析分离得产物(a6)(收率85％)。

[0134] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.65-7.64(m,4H),7.47-7.37(m,6H),4.53(d,J＝18Hz,1H),4.51(t,J＝5.2Hz,1H),4.33(d,J＝18Hz,1H),4.12(d,J＝2.2Hz,2H),3.95(t,J＝
7.6Hz,1H),2.80-2.56(m,4H),2.41(t,J＝2.2Hz,1H),2.36-2.27(m,1H),2.05-1.95(m,
2H),1.88-1.80(m,1H),1.13(s,9H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ207.9,135.9,132.8,132.3,
130.2,128.0,128.0,78.8,75.4,75.2,72.2,58.1,41.1,39.9,28.6,28.5,27.1,25.5,+
19.4.HRMS(ESI):C27H35O3S2Si,[M+H]计算值499.1797,实测值499.1800.

[0135] 取1.0eq.式(a6)所示化合物5.5eq.N-溴代丁二酰亚胺溶于42.0mL二氯甲烷/乙腈中，-10℃下加入4.5eq.的4,5-二甲氧基-2-硝基苄醇，继续搅拌1小时。升至室温，饱和硫代硫酸钠淬灭反应，分液，水相用乙醚萃取2次，合并有机相，饱和碳酸氢钠，氯化钠依次洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，柱层析分离得式(a7)所示化合物(产率65％,4个异构体)。

[0136] 将1.0eq.式(a7)所示化合物(其中，在式(2)中，“R1”为4,5-二甲氧基-2-硝基苄基)溶于10.0mL四氢呋喃中，加入1.82mL 1M的四正丁基氟化铵的四氢呋喃溶液，室温下搅拌2小时。减压浓缩，柱层析分离得产物式(1)所示的化合物(收率89％)。高压制备(C18,10μm,21.2mm×250mm,流速15mL/min,流动相A:水,B:乙腈,0-10-20-27min,B:5％-40％-70％-70％.)纯化得核磁鉴定样品：

[0137] 1-1(RT＝22.0min)：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.59(s,1H),7.53(s,1H),7.28(s,1H),6.84(s,1H),5.58(dd,J＝5.6,4.4Hz,1H),4.99(s,2H),4.93(s,2H),4.56-4.54(m,
1H),4.24-4.21(m,2H),3.97-3.86(m,2H),3.92(s,3H),3.90(s,3H),3.89(s,3H),3.79(s,
3H),2.50(t,J＝2.4Hz,1H),2.46-2.41(m,1H),2.36-2.31(m,1H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ
153.39,153.15,147.74,147.23,139.67,138.73,130.90,128.61,110.18,109.84,109.81,
107.97,107.39,105.68,78.78,76.45,75.83,67.79,66.75,60.76,58.72,56.30,56.24,
56.21,56.14,40.07.HRMS(ESI):C26H30N2NaO13,[M+H]+计算值601.1646,实测值601.1643.[0138] 1-2(RT＝23.5min)：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.67(s,1H),7.65(s,1H),7.25(s,
1H),7.15(s,1H),5.33(d,J＝4.8Hz,1H),5.18-4.85(m,4H),4.61(dd,J＝9.6,7.2Hz,1H),
4.15(t,J＝2.4Hz,2H),3.96-3.91(m,2H),3.97(s,3H),3.96(s,3H),3.92(s,6H),2.45-
2.41(m,2H),2.24-2.17(m,1H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ153.55,153.50,147.70,139.49,
139.35,130.13,129.74,110.18,109.84,107.94,107.90,104.10,102.17,78.89,75.30,+
73.49,70.08,66.69,61.45,58.69,56.37,39.40.HRMS(ESI):C26H30N2NaO13,[M+H]计算值
601.1646,实测值601.1643.

[0139] 1-3(RT＝24.5min)：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.71(s,1H),7.68(s,1H),7.24(s,1H),7.23(s,1H),5.41(d,J＝5.6Hz,1H),5.19-5.06(m,2H),4.97-4.92(m,2H),4.33(m,
1H),4.21(d,J＝2.4Hz,2H),4.01-3.87(m,2H),3.99(s,3H),3.98(s,3H),3.95(s,3H),3.94(s,3H),2.62-2.55(m,1H),2.45(t,J＝2.4Hz,1H),2.18–2.15(m,1H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ153.61,153.48,147.83,147.61,139.53,139.45,130.27,129.61,110.44,110.26,
110.24,108.01,107.87,105.22,79.00,75.39,75.09,67.24,66.23,60.96,58.67,56.46,
56.40,56.37,56.34,39.22.HRMS(ESI):C26H30N2NaO13,[M+H]+计算值601.1646,实测值
601.1643.

[0140] 氩气保护下，将1.0eq.的1-1溶于2.0mL无水四氢呋喃中，加入2.2eq.二异丙基乙基胺，1.0eq.三光气，室温过夜搅拌。水洗，二氯甲烷萃取，有机相无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，得粗产物式(2)所示化合物。将1.0eq.上述式(2)所示化合物溶于3.0mL二氯甲烷中，加入2.4eq.二异丙基乙基胺，1.2eq.阿霉素，室温搅拌4小时。浓缩，柱层析分离得式(3)所示的化合物(两步产率65％)。

[0141] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ14.0(s,1H),13.2(s,1H),8.00(d,J＝7.6Hz,1H),7.77(t,J＝8.0Hz,1H),7.58(s,1H),7.49(s,1H),7.37(d,J＝8.4Hz,1H),7.27(s,1H),6.82(s,1H),5.52-5.48(m,2H),5.35-5.34(m,1H),5.24(d,J＝8.8Hz,1H),4.96-4.91(m,4H),4.75(s,
2H),4.54(s,1H),4.17-4.12(m,2H),4.10(d,J＝2Hz,2H),4.06(s,3H),3.91-3.81(m,2H),
3.90(s,3H),3.86(s,3H),3.83(s,3H),3.75(s,3H),3.70-3.66(m,2H),3.24(d,J＝18.8Hz,
1H),2.97(d,J＝18.8Hz,1H),2.53-2.49(m,1H),2.42-2.38(m,1H),2.38-2.30(m,2H),
13
2.20-2.15(m,1H),1.92-1.79(m,2H),1.29(d,J＝6.4Hz,3H). C NMR(101MHz,CDCl3)δ
213.8,187.1,186.6,161.0,156.1,155.6,154.3,153.4,153.2,147.7,147.1,139.5,
138.5,135.8,135.4,133.5,133.4,131.0,128.6,120.7,119.8,118.4,111.6,111.4,
110.0,109.7,108.6,107.9,107.3,105.0,100.6,79.2,75.3,69.6,69.6,67.9,67.2,65.9,
65.5,60.8,58.5,56.7,56.3,56.2,56.1,53.4,47.0,38.8,35.6,34.0,30.2,16.8.HRMS(ESI):C54H57N3NaO25,[M+Na]+计算值1170.3179,实测值1170.3206.

[0142] 取1.0eq.式(3)所示化合物和1.2eq.的Mal-PEG3-N3溶于3mL(2:1)二甲基甲酰胺水混合溶剂中,加入0.5eq.五水硫酸铜和1.0eq.抗坏血酸钠,室温下搅拌过夜，LC-MS监测反应，待原料反应完后直接高压制备分纯得红色固体载药连接子(产率45％)。分离条件(C18,10μm,21.2mm×250mm,流速15mL/min,流动相A:水,B:乙腈,0-18min,B:45％-80％.RT＝10.5min)。

[0143] 1H NMR(400MHz,CDCl3)δ13.99(s,1H),13.26(s,1H),8.03(d,J＝7.6Hz,1H),7.79(t,J＝8.0Hz,1H),7.72(s,1H),7.58(s,1H),7.49(s,1H),7.39(d,J＝8.4Hz,1H),7.36(s,1H),6.84(s,1H),6.69(s,2H),5.54-5.44(m,2H),5.35-5.32(m,2H),4.96-4.86(m,4H),
4.78(s,2H),4.68-4.53(m,5H),4.17-4.15(m,1H),4.07(s,3H),3.92(s,3H),3.88(s,3H),
3.84-3.82(m,3H),3.80(s,3H),3.78(s,3H),3.73-3.70(m,2H),3.65-3.50(m,10H),3.42-
3.40(m,2H),3.30-3.26(m,1H),3.16-3.02(m,2H),2.52-2.49(m,3H),2.38-2.34(m,3H),
2.22-1.85(m,5H),1.34-1.32(m,3H).HRMS(ESI):C69H81N8O31,[M+H]+计算值1517.5008,实测值1517.5007.

[0144] 所得载药连接子(Mal-PC4AP-DOX)的结构如下：

[0145]

[0146] Nv为4,5-二甲氧基-2-硝基苄基。

[0147] 实施例2

[0148] 本实施例在于说明由实施例1制备的载药连接子与细胞穿透肽偶联制备细胞穿透肽偶联药物的过程。

[0149] 包括以下步骤：

[0150] 1)将实施例1制备得到的载药连接子Mal-PC4AP-DOX溶于二甲基甲酰胺，得到浓度为1.5mM的载药连接子储存液。将H3-V45C蛋白溶于无菌水中，得到浓度为300μM的储存液。

[0151] 2)取33.5微升载药连接子储存液与160微升H3-V35C蛋白混合于pH为7.5(20mM)的HEPES缓冲液，37℃下孵育1小时。

[0152] 3)反应结束后，得到的细胞穿透肽偶联药物(H3-PC4AP-DOX，结构如式5所示)需要进一步纯化，采用PD MiniTrap G-25脱盐柱脱盐。具体脱盐方法：脱盐柱上样200微升，采用重力离心的方式，离心温度室温，转速1000×g，离心时间2分钟。脱盐后NanoDrop测浓度储存于-80℃。

[0153] 实施例3

[0154] 本实施例在于说明由实施例2制备的细胞穿透肽偶联药物H3-PC4AP-DOX可以用于HeLa细胞内阿霉素DOX的光控释放。

[0155] 3.1共聚焦显微镜检测DOX和H3-PC4AP-DOX的细胞定位

[0156] 取对数生长期的HeLa细胞用胰酶消化、洗涤、离心后将其制备成单细胞悬液。将计过数的细胞接种于24孔板(密度1.0×105个/孔)，置于37℃含有5％CO2的恒温培养箱中过夜培养。过夜培养后细胞用PBS洗涤2次，分别加入含有10μM阿霉素、H3-PC4AP-DOX的完全培养基。继续培养不同时间后，吸去原培养液，PBS浸洗细胞2次，300μL的4％多聚甲醛室温固定20分钟。PBS浸洗2次后，加入300μL(10μg/mL)DAPI染色7分钟后PBS充分洗涤、封片。激光共聚焦显微镜(Nikon A1+,Nikon,Tokyo,Japan)进行拍摄观察(DAPI通道：激发波长408nm,发射波长：425-475nm),DOX通道：激发波长561nm,发射波长：570-620nm)。

[0157] 光照组H3-PC4AP-DOX孵育3小时后，加入新鲜培养基，365nm(7.0mW cm-2)光照5分钟后37℃继续培养一定时间。其余操作与上述过程相同。

[0158] 如图1所示：H3-PC4AP-DOX经光照后，HeLa细胞核中明显观察到DOX的荧光(红色)。由此可见，光照后DOX能够从实施例2中设计合成的细胞穿透肽偶联药物H3-PC4AP-DOX中释放下来。

[0159] 3.2 H3-PC4AP-DOX针对于HeLa细胞的细胞杀伤活性

[0160] 取对数生长期的HeLa细胞用胰酶消化、洗涤、离心后将其制备成单细胞悬液。取100μL接种于96孔板中(3000个/孔)，将细胞培养板置于37℃含有5％CO2的细胞培养箱中过夜孵育。加入不同浓度梯度H3-PC4AP-DOX的完全培养基，继续培养40分钟后，PBS洗涤细胞2次，加入新鲜培养基。光照组将96孔板置于UV-LED(7mW/cm2,365nm)上方10cm处光照7分钟，对照组避光室温培养相同时间。培养箱中继续培养48小时后，每孔加入10μL的CCK-8，继续培养1小时后，用酶标仪测定450nm处的吸光度，计算不同条件下药物对细胞的生长抑制率。
实验过程中分别设置空白组(不含细胞)及阴性对照组(无药物处理)，按下列公式计算细胞的抑制率：细胞抑制率＝(对照组A450值-加药组A450值)/(对照组A450值-空白组A450值)×100％。IC50值由GraphPad Prism软件处理分析得到。上述实验，独立重复3次，每个浓度设
4个复孔。如图2所示：CCK-8实验表明与对照组相比，H3-PC4AP-DOX孵育的Hela细胞经光照后，细胞成活率明显降低，因此本发明获得的光敏性Mal-PC4AP-DOX连接子能够用于细胞穿透肽作为载体的药物递送体系。

[0161] 实施例4

[0162] 本实施例在于说明由实施例1制备的载药连接子Mal-PC4AP-DOX能够用与制备抗体偶联药物，实现药物的靶向递送。

[0163] 4.1抗体药物偶联物Trastuzumab-PC4AP-DOX(结构如式6所示)的制备[0164] 包括以下步骤：

[0165] 1)将TCEP还原剂溶于无菌水中，配置成1.0mM的还原剂储存液。将抗体Trastuzumab溶于缓冲液PBS中，配置成浓度为5mg/mL的储存液。

[0166] 2)20μL的Trastuzumab溶液中加入2.8μL的TCEP，37℃孵育2小时，得到抗体还原后的溶液。所加TCEP还原剂的摩尔量为Trastuzumab抗体摩尔量的4倍。

[0167] 3)取3.8μL实施例1制备的载药连接子Mal-PC4AP-DOX加入到还原后的抗体溶液中，继续孵育1小时后得到抗体偶联药物。所加连接子-细胞毒素药物溶液为抗体摩尔量的8倍。反应结束后抗体偶联物通过PD SpinTrap G-25(GE Healthcare,28-9180-04)重力离心脱盐纯化。具体脱盐方法如下：脱盐柱上样100μL，采用重力离心的方式，离心温度室温，转速800×g，离心时间2分钟。脱盐完成后，经NanoDrop测浓度后储存于-80℃。

[0168] 4.2 12％SDS-PAGE检测抗体药物偶联物Trastuzumab-PC4AP-DOX在血清的光照释放效率

[0169] 取30μL的3μM的Trastuzumab-PC4AP-DOX混合于18μL人血清中，365nm(7mW/cm2)光照5分钟后，37℃孵育。不同时间点取样7μL，终浓度20mM氰基硼氢化钠淬灭反应，与SDS上样缓冲液(含有50mM Tris，pH6.8，甘油10％(v/v)，SDS 2％(w/v)，溴酚蓝0.1％(w/v))混合，12％SDS-PAGE分析。所得凝胶先通过GE Typhoon Gel Imaging Scanner荧光成像(激发波长532nm，发射波长570nm)，再用考马斯亮蓝染色。

[0170] 结果如图3所示，光照后，孵育仅10分钟，DOX就分别从抗体的重链和轻链上释放下来，总释放效率约为70％。延长至1小时，总释放效率可达85％左右，因此，本发明的载药连接子Mal-PC4AP-DOX能够用于抗体作为载体的药物递送。

[0171] 4.3激光共聚焦显微镜检测抗体药物偶联物Trastuzumab-PC4AP-DOX与乳腺癌细胞的结合活性

[0172] 将计过数的乳腺癌细胞SK-BR-3(HER2高表达)与MCF-7(HER2低表达)细胞分别接5
种于24孔板(密度1.0×10个/孔)，置于37℃含有5％CO2的恒温培养箱中过夜培养。过夜培养后细胞用PBS洗涤2次，4％多聚甲醛室温固定20分钟。PBS浸洗2次后，10％山羊血清室温封闭30分钟。清除血清，500nM Trastuzumab或Trastuzumab-PC4AP-DOX室温孵育细胞30分钟，PBS浸洗2次后，山羊抗人AF488抗体(1:200)继续孵育30分钟。DAPI(10μg/mL)染色7分钟PBS充分洗涤、封片，激光共聚焦显微镜(Nikon A1+,Nikon,Tokyo,Japan)进行拍摄观察(DAPI通道:激发波长408nm,发射波长:425-475nm),AF488通道:激发波长486nm,发射波长:
500-550nm)。结果如图4a所示，曲妥珠单抗和抗体偶联药物Trastuzumab-PC4AP-DOX都能够特异性地与HER2高表达的乳腺癌细胞SK-BR结合。但是，它们都不能与HER2低表达的乳腺癌细胞MCF7结合(图4b)。

[0173] 4.4 Trastuzumab-PC4AP-DOX针对于不同HER2表达水平肿瘤细胞的细胞杀伤活性[0174] 取对数生长期的SK-BR-3和MCF-7细胞用胰酶消化、洗涤、离心后将其制备成单细胞悬液。取100μL细胞悬液分别接种于96孔板中(SK-BR-3细胞7000个/孔，MCF-7细胞3000个/孔)，将细胞培养板置于37℃含有5％CO2的细胞培养箱中过夜孵育。加入不同浓度梯度的载药连接子、抗体药物偶联物、DOX完全培养基，继续培养6小时后，PBS洗涤细胞2次，加入新鲜培养基。光照组将96孔板置于UV-LED(7mW/cm2,365nm)上方10cm处光照5分钟，对照组避光室温培养相同时间。培养箱中继续培养48小时后，每孔加入10μL CCK-8，继续培养1小时后，用酶标仪测定450nm处的吸光度，计算不同药物浓度条件下细胞的生长存活率。按下列公式计算细胞的存活率：细胞存活率＝(加药组A450值-空白组A450值)/(对照组A450值-空白组A450值)×100％。上述实验，独立重复3次，每个浓度设4-5个复孔。如图5a所示，对于HER2过表达的SK-BR-3细胞，光照条件下，抗体偶联药物孵育的SK-BR-3细胞成活率明显降低，其效力与游离阿霉素相当且呈现剂量依赖性；相反未光照组，细胞的生长并没有得到明显的抑制。用载药连接子孵育的SK-BR-3细胞，无论光照与否，都不会对细胞造成毒性。这说明单纯的光照，并不会导致DOX从抗体上释放下来，这也进一步验证了药物释放机制是按照发明人的设想通过分子内加成消除串联化学机制进行的。另外HER2阴性的MCF7细胞的毒性实验表明，光照下，细胞成活率没有明显降低(图5b)，因此本发明的抗体偶联药物能够实现药物的靶向光控释放。

[0175] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。