一种具有抗癌作用的多肽及其应用转让专利
申请号 : CN201910949019.3
文献号 : CN110590961B
文献日 : 2020-12-08
发明人 : 王中山 , 张梦
申请人 : 徐州医科大学
摘要 :
本发明公开了一种具有抗癌作用的多肽及其应用，该多肽名称为TAT‑ETA1，为如下(1)或(2)所述的多肽：(1)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第12‑69位氨基酸残基的多肽；(2)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽。本发明提供的多肽TAT‑ETA1来源于A型内皮素受体1(ETAR)羧基末端，TAT‑ETA1能够在内皮素1作用于ETAR时，和ETAR羧基末端竞争性地与β‑arrestin 1相结合，干扰ETAR和β‑arrestin 1之间的相互作用，从而缓解β‑arrestin 1介导的癌细胞迁移、侵袭和化疗耐药等功能。本发明的多肽TAT‑ETA1在癌症治疗中具有临床应用潜力。
权利要求 :
1. 一种具有抗癌作用的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示。
2.编码权利要求1所述的多肽的核酸分子，其特征在于，为SEQ ID NO：2所示的DNA分子。
3.含有权利要求2所述的核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌。
4.权利要求1所述的多肽和/或权利要求2所述的核酸分子在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤为卵巢癌或结肠癌。
5.一种具有抗癌作用的药物，其活性成分为权利要求1所述的多肽和/或权利要求2所述的核酸分子。
6.根据权利要求5所述的一种具有抗癌作用的药物，其特征在于，所述药物的给药方式包括：瘤内注射、皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射。
说明书 :
一种具有抗癌作用的多肽及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种具有抗癌作用的多肽及其应用。
背景技术
[0002] G蛋白偶联受体家族蛋白是最常见的治疗靶点，其中内皮素轴是癌症发生和进展的一条关键通路，也成为研究癌症机制和临床治疗的重要途径。内皮素包含ET-1，ET-2和ET-3这3种生物活性肽，最重要的ET-1肽通过特异性结合ET-1受体(ET-1R)能够调控细胞增殖、存活、运动、细胞骨架变化、血管生成、转移和化疗药物抗性，而ET-1R受体有两种亚型：ETA受体(ETAR)和ETB受体(ETBR)。ETAR的研究显示其功能主要通过多功能支架蛋白β-arrestins所精确介导，而β-arrestin1在ET-1参与的癌症信号传导中的作用研究显示：ET-
1的多效性和其动态的信号传导过程比预想的更复杂。关闭ETAR和β-arrestin1信号通路可能在癌症治疗中发挥重要作用。
1的多效性和其动态的信号传导过程比预想的更复杂。关闭ETAR和β-arrestin1信号通路可能在癌症治疗中发挥重要作用。
[0003] 有些癌症细胞表达内皮素1(endothelin1)受体主要为ETAR，比如卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌和鼻咽癌等。另有一些癌症则主要表达ETBR受体，如黑色素瘤、恶性胶质瘤、星形细胞瘤等。还有一些癌症则能够同时表达ETAR和ETBR，如膀胱癌、肺癌、外阴癌和卡波西肉瘤等。
[0004] ETAR作为一种G蛋白偶联受体，通过和β-arrestin1的相互作用影响EMT、侵袭、转移和化学药物抗性等，干预其信号通路可能成为临床治疗的有效策略。
[0005] β-arrestin1在卵巢癌尤其是高级别卵巢癌中过表达，而肺腺癌患者中β-arrestin1高表达则是一个独立的预后因子，和肿瘤进展以及细胞整体生存率相关，说明β-arrestin1有望成为不良预后的一个有效地生物标志物，基因沉默或者核突变β-arrestin1表达能够明显抑制卵巢癌转移。证实β-arrestin1是癌症发生、发展的关键分子，所以靶向β-arrestin1的药物研究将蕴含巨大的临床治疗潜力。
[0006] ET-1激活ETAR使其构象发生变化激活G蛋白信号通路，随后吸引β-arrestin1到细胞膜聚集。β-arrestin1竞争性地与ETAR细胞质区域结合，一方面将其从G蛋白偶联中释放出来，另一方面由于β-arrestin1覆盖了ETAR的细胞质功能区域，将阻止更多G蛋白的结合。随后β-arrestin1介导的信号通路开始在肿瘤发生、侵袭和转移等过程中发挥作用。
[0007] ETAR隶属于GPCR(G protein coupled receptor)家族，是一种典型的七次跨膜(trans-membrane，TM)受体，7个α螺旋结构通过3个胞外loop(extracellular loops,ECLs 1–3)和3个胞内loop连接(intracellular loops,ICLs 1–3)。ETAR和ETBR胞内区域ICLs 1–3之间氨基酸序列相似性高，其主要区别在羧基末端(如图1所示，ETAR和ETBR羧基末端多肽相似度39.66％)，ETAR和β-arrestin1之间的相互作用可能主要由羧基末端识别并介导。
[0008] 而选择性干扰β-arrestin1和ETAR的相互作用，能够阻止β-arrestin1到ETAR的聚集，可能阻止β-arrestin1介导的信号通路。因此，研究和开发阻断β-arrestin1和ETAR的相互作用的药物，将具有很好的抗癌的作用。
发明内容
[0009] 本发明的第一个目的是提供一种具有抗癌作用的多肽。
[0010] 为实现上述目的，本发明提供一种具有抗癌作用的多肽，名称为TAT-ETA1，为如下(1)或(2)的多肽：
[0011] (1)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列第12-69位氨基酸残基的多肽；
[0012] (2)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽。
[0013] 其中，序列表中SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列由69个氨基酸残基组成，序列1中第1-11位氨基酸残基组成具有穿透细胞膜作用的区域，该区域和12-69位氨基酸前后位置可以互换，并可以被具有相同作用的其他序列替换；序列1中第12-69位氨基酸残基构成能够干扰ETAR和β-arrestin1蛋白质结合的区域。
[0014] 本发明的第二个目的是提供编码所述多肽TAT-ETA1的核酸分子。
[0015] 为实现上述目的，本发明所提供的编码所述多肽TAT-ETA1的核酸分子，为如下(3)或(4)的DNA分子：
[0016] (3)SEQ ID NO：2自5’末端起第34位至第207位核苷酸所示的DNA分子；
[0017] (4)SEQ ID NO：2所示的DNA分子。
[0018] 其中，序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的长度为210bp，序列2中第208-210位为终止密码子，其编码氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO：1所示的多肽。
[0019] 本发明的第三个目的是提供含有所述多肽的编码核酸分子的表达盒、重组载体或重组菌。
[0020] 本发明的第四个目的是提供所述多肽和/或所述核酸分子在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0021] 所述肿瘤为具有ETAR表达的癌症组织或细胞，包括但不限定于：卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、胰腺癌和鼻咽癌。
[0022] 所述抗肿瘤作用包括抑制肿瘤细胞转移、侵袭，增加一线化疗药物(如铂类药物等)敏感性等。
[0023] 本发明还提供一种具有抗癌作用的药物，其活性成分为所述的多肽TAT-ETA1和/或所述的核酸分子。
[0024] 所述药物的给药方式包括但不限定于：瘤内注射、皮内注射、皮下注射、肌肉注射、静脉注射等。
[0025] 本发明提供的多肽TAT-ETA1来源于ETAR羧基末端，所述多肽TAT-ETA1能够在ET-1作用于ETAR时，和ETAR羧基末端竞争性的与β-arrestin1相结合，干扰ETAR和β-arrestin1之间的相互作用，从而抑制β-arrestin1介导的肿瘤细胞迁移和侵袭以及化疗药物耐受等症状。本发明的多肽TAT-ETA1在卵巢癌等癌症治疗中具有临床应用潜力。
附图说明
[0026] 图1为肽段序列和对照肽序列(ETA1为肽段序列，来源于ETAR羧基末端多肽，ETB1为对照肽序列，来源于ETBR羧基末端多肽)。
[0027] 图2为ETA1肽段序列和β-arrestin1之间的相互作用检测。
[0028] 图3为TAT-ETA1肽段序列对卵巢癌细胞迁移和侵袭的抑制(通过Trans-well实验)：A：体外纯化能够得到纯度较高的TAT-ETA1多肽；B：TAT-ETA1多肽对卵巢癌细胞迁移的干预作用检测；C：TAT-ETA1多肽对卵巢癌细胞侵袭的干预作用检测。
[0029] 图4为TAT-ETA1肽段序列对顺铂耐药卵巢癌细胞的化疗敏感性改善。
[0030] 图5为肽段序列对结肠癌细胞迁移和侵袭的抑制(通过Trans-well实验)：A：TAT-ETA1多肽对结肠癌细胞迁移的干预作用检测；B：TAT-ETA1多肽对结肠癌细胞侵袭的干预作用检测。
[0031] 图6为TAT-ETA1肽段序列对顺铂耐药结肠癌细胞的化疗敏感性改善。
具体实施方式
[0032] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。本实施例中的定量实验，如无特殊说明均设置三次重复，结果取平均值。
[0033] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规的分子生物学方法。
[0034] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0035] 下述实施例中SKOV3细胞、SKOV3/cDDP细胞、HCT8细胞、HCT8/DDP细胞、U251细胞、HEK293来源于ATCC(美国模式培养物集存库)。
[0036] 实施例1多肽TAT-ETA1的获得
[0037] (1)具有穿膜活性的TAT-ETA1多肽获得
[0038] 提取SKOV3细胞总RNA，反转录得到cDNA，以cDNA为模板通过PCR获得ETAR羧基末端多肽序列，其上游引物：下游引物5'CGTCGGATCCGTTCATGCTG
TCCTTATGGCT3'(SEQ ID NO.8)(粗体为穿膜肽序列)，在上游引物内插入TAT编码序列，在上下游引物分别加入XhoI和BamHI酶切位点，通过酶切链接的方法，构建pWaldo-TAT-ETA1大肠杆菌表达载体，并转化BL21(DE3)表达菌株，获得重组子。
TCCTTATGGCT3'(SEQ ID NO.8)(粗体为穿膜肽序列)，在上游引物内插入TAT编码序列，在上下游引物分别加入XhoI和BamHI酶切位点，通过酶切链接的方法，构建pWaldo-TAT-ETA1大肠杆菌表达载体，并转化BL21(DE3)表达菌株，获得重组子。
[0039] 接种BL21(DE3)重组子菌株于200ml LB培养基中，37℃过夜培养。转种50ml过夜培养物至1L LB培养基中，37℃培养至OD600约0.5～0.6之间，加入终浓度为0.1mM的IPTG，20℃培养20h左右，5000g离心15min收集细胞(4L培养基约收集细胞20g)，冻存于-20℃冰箱短时间保存，或者直接用于后续的蛋白质纯化(如果搁置时间较长，需保存于-80℃冰箱)。
[0040] 将细胞悬浮于100ml裂解缓冲液中(20mM Tris-HCl,pH 8.5；300mM NaCl和10％甘油)，加入50μg/mL溶菌酶，200U DnaseI和1片蛋白酶抑制剂(cocktail)，上海励途高压均质机FB-110X，1200bar，4℃破碎细胞两次，18,000rpm，4℃离心30min去除破碎不完全的细胞碎片；将上清与已经平衡的Ni-NTA柱子结合(平衡缓冲液：20mM Tris-HCl,pH 8.5；300mM NaCl和10％甘油)，让含有目的蛋白质的样品自然通过柱子一次；冲洗缓冲液(20mM Tris-HCL，pH8.5，300mM NaCl，10％甘油和30mM咪唑)洗100ml，再用洗脱缓冲液(20mM Tris-HCL，pH8.5，300mM NaCl，10％甘油和300mM咪唑)洗脱，收集蛋白质含量最高的5ml样品，通过AKTA pure M系统分子筛柱子(缓冲液：20mM Tris-HCL，pH8.5，300mM NaCl，10％甘油)进行纯化，此步骤能够获得较高纯度的TAT-ETA1多肽和GFP融合的产物，可以用于多肽定位研究。
[0041] 为了进一步获得TAT-ETA1多肽，对于收集的蛋白质样品，加入200μL浓度为3mg/mL的TEV(烟草花叶病毒)蛋白酶，室温静置酶切过夜。过夜酶切后的融合蛋白质样品重新通过Ni柱，将没有酶切完全的含有GFP的蛋白质和酶切后的融合GFP蛋白去掉。最终收集的TAT-ETA1多肽样品，通过截留分子量1,000的浓缩管，浓缩至10mg/mL左右，SDS-PAGE检测样品的纯度>95％，可以用于功能研究。纯化的多肽TAT-ETA1氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0042] 由图3A可知，能够获得高纯度的TAT-ETA1-GFP融合蛋白质和TAT-ETA1多肽，可以用于多肽定位和抗癌作用研究。
[0043] (2)哺乳动物细胞双杂交
[0044] 将ETAR基因ETA1多肽片段和pACT的重组子(上游引物5'CTCAGTCTAGATATTTTGTGAGCAAGAAATTTAAAA3 '(SEQ ID NO.3)和下游引物5 'CATCG GGTACC TCAGTTCATGCTGTCCTTATGGC3'(SEQ ID NO.4))，与β-arrestin1和pBIND的重组子(上游引物
5'CAG GTCGAC TTATGGGCGACAAAGGGACCC3'(SEQ ID NO.5)和下游引物5'CATCG TCTAGACTATCTGTTGTTGAGCTGTGGAGAG3'(SEQ ID NO.6))和报告基因载体pG5luc，共转染HEK293细胞，加入1μM ET-1处理细胞，继续培养48h之后，通过双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Beyotime RG009)使用GloMax-Multi detection system(Promega)检测荧光素酶的活性。
5'CAG GTCGAC TTATGGGCGACAAAGGGACCC3'(SEQ ID NO.5)和下游引物5'CATCG TCTAGACTATCTGTTGTTGAGCTGTGGAGAG3'(SEQ ID NO.6))和报告基因载体pG5luc，共转染HEK293细胞，加入1μM ET-1处理细胞，继续培养48h之后，通过双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Beyotime RG009)使用GloMax-Multi detection system(Promega)检测荧光素酶的活性。
[0045] 由图2结果可知，ETAR能够与β-arrestin1发生相互作用，这种相互作用可以被加入的TAT-ETA1多肽所阻断。该多肽能够用于后续干扰β-arrestin1介导的癌细胞迁移、侵袭和化疗药物耐受等作用。
[0046] 实施例2多肽TAT-ETA1对卵巢癌细胞的迁移和侵袭的抑制
[0047] 细胞迁移和侵袭：SKOV3细胞迁移和侵袭检测使用24孔transwell细胞培养小室，小室内放置有8μm孔的聚碳酸酯滤膜。将培养好的细胞用胰蛋白酶消化(消化前加入0.2mg/mL TAT-ETA1多肽处理2h)并重新悬浮于RPMI-1640培养基，使其终浓度为2×105个/ml。500μL 10％FBS/RPMI-1640培养基或者500μL SDF-1溶液加入到小室底层，100μL细胞悬液加入到滤膜上层。
[0048] 侵袭实验则先在Transwell小室中铺无血清的RPMI-1640培养基1:1稀释的Matrigel胶50μL，37℃孵育2h后接种细胞悬液400μL。
[0049] 恒温培养箱中静置培养24h后，用湿棉签轻轻擦去Matrigel凝胶和聚碳酸酯膜表面的细胞，以无水乙醇固定滤膜，0.1％结晶紫染色15min，PBS清洗，倒置显微镜20倍放大视野下随机取5个不重复视野，计数每个视野穿过Transwell小室底部膜下部的细胞数。
[0050] 给予多肽后细胞形态未发现明显异常。如图3B、图3C所示，TAT-ETA1能够明显抑制卵巢癌SKOV3细胞的迁移和细胞侵袭。
[0051] MTT检测：SKOV3/cDDP细胞接种于96孔板，贴壁12h后加入0.2mg/mL TAT-ETA1多肽，2h后再次加入0.2mg/mL TAT-ETA1多肽，30min后加入1-24μg/mL顺铂或等体积PBS，加入对照多肽的细胞做对照。给药处理48h后细胞孔中加入5mg/mL MTT溶液10μL，低速摇床震荡温育3-4h，随后移除MTT和培养基的混合液，加入100μL DMSO溶液。由于MTT的存在，活细胞将形成晶体，而结晶物随后溶解于DMSO溶液，酶联免疫检测仪检测490nm波长处的吸光值。
[0052] 由图4可知，TAT-ETA1能够明显增强SKOV3/cDDP细胞对顺铂化疗的敏感性。
[0053] 实施例3多肽TAT-ETA1对结肠癌细胞的迁移和侵袭的抑制
[0054] 细胞迁移和侵袭：HCT8细胞迁移和侵袭检测使用24孔transwell细胞培养小室，小室内放置有8μm孔的聚碳酸酯滤膜。将培养好的细胞用胰蛋白酶消化(消化前加入0.2mg/mL TAT-ETA1多肽处理2h)并重新悬浮于RPMI-1640培养基，使其终浓度为2×105个/ml。500μL 10％FBS/RPMI-1640培养基或者500μL SDF-1溶液加入到小室底层，100μL细胞悬液加入到滤膜上层。
[0055] 侵袭实验则先在Transwell小室中铺无血清的RPMI-1640培养基1:1稀释的Matrigel胶50μL，37℃孵育2h后接种细胞悬液400μL。
[0056] 恒温培养箱中静置培养24h后，用湿棉签轻轻擦去Matrigel凝胶和聚碳酸酯膜表面的细胞，以无水乙醇固定滤膜，0.1％结晶紫染色15min，PBS清洗，倒置显微镜20倍放大视野下随机取5个不重复视野，计数每个视野穿过Transwell小室底部膜下部的细胞数。
[0057] 给予多肽后细胞形态未发现明显异常。如图5A、图5B所示，TAT-ETA1能够明显抑制结肠癌HCT8细胞的迁移和细胞侵袭。
[0058] MTT检测：HCT8/DDP细胞接种于96孔板，贴壁12h后加入0.2mg/mL TAT-ETA1多肽，2h后再次加入0.2mg/mL TAT-ETA1多肽，30min后加入1-24μg/mL顺铂或等体积PBS，加入对照多肽的细胞做对照。给药处理48h后细胞孔中加入5mg/mL MTT溶液10μL，低速摇床震荡温育3-4h，随后移除MTT和培养基的混合液，加入100μL DMSO溶液。由于MTT的存在，活细胞将形成晶体，而结晶物随后溶解于DMSO溶液，酶联免疫检测仪检测490nm波长处的吸光值。
[0059] 由图6可知，TAT-ETA1能够明显增强HCT8/DDP细胞对顺铂化疗的敏感性。
[0060] 综上所述：本发明所述多肽TAT-ETA1能够和ETAR竞争性地与β-arrestin1结合，从而干扰ETAR和β-arrestin1之间的相互作用，进而抑制β-arrestin1所介导的癌细胞迁移、侵袭和化疗药物耐受等作用。