一种鞘氨醇杆菌及其在催化合成L(+)-酒石酸或其盐中的应用及方法

摘要

本发明公开了一种鞘氨醇杆菌及其在催化合成L(+)‑酒石酸或其盐中的应用及方法。所述鞘氨醇杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.18074，命名为：鞘氨醇杆菌BK99。本发明鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)BK99能将5‑酮基‑D‑葡萄糖酸或其盐生物合成为L(+)‑酒石酸或其盐，避免了现行工艺使用不可再生的化石原料；另一方面，本发明的鞘氨醇杆菌替代已见报道的采用稀有金属催化5‑酮基‑D‑葡萄糖酸合成L(+)‑酒石酸的方法，避免了稀有金属的使用。

权利要求

1.一种鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)，其特征在于，所述鞘氨醇杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.18074，命名为：鞘氨醇杆菌BK99。

2.如权利要求1所述鞘氨醇杆菌在催化5-酮基-D-葡萄糖酸或其盐生成L(+)-酒石酸或其盐中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，5-酮基-D-葡萄糖酸的盐形式为钠盐、钾盐、铵盐、镁盐、钡盐或钙盐，制备L(+)-酒石酸的盐形式对应为钠盐、钾盐、铵盐、镁盐、钡盐或钙盐。

4.一种催化合成L(+)-酒石酸或其盐的方法，其特征在于，在培养基中添加5-酮基-D-葡萄糖酸或其盐，然后使用如权利要求1所述的鞘氨醇杆菌进行培养，获得L(+)-酒石酸或其盐。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，培养温度为26～37℃。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，培养温度为30～34℃。

7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在培养基中添加5-酮基-D-葡萄糖酸或其盐的量为15～200g/L。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，在培养基中添加5-酮基-D-葡萄糖酸或其盐的量为70～120g/L。

9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，培养时间为2～10d。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，培养时间为6～9d。

说明书

一种鞘氨醇杆菌及其在催化合成L(+)-酒石酸或其盐中的应

用及方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种鞘氨醇杆菌及其在催化合成L(+)-酒石酸或其盐的微生物菌株中的应用及其应用方法。

背景技术

[0002] L(+)-酒石酸是一种天然构型有机酸，在葡萄、罗望子、天竺葵等高等植物中存在，广泛应用于食品、医药、化工、建筑、金属等行业。

[0003] L(+)-酒石酸的获得方法主要有提取法、化学合成拆分法、酶法合成以及糖质发酵法。天然酒石酸主要是从葡萄酒酿造过程的副产物酒石中提取，如米思(响应面法优化毛葡萄酒泥中L(+)-酒石酸提取工艺[J].食品科学,2012,33(8):49-53)等人从毛葡萄酒泥里提取L(+)-酒石酸。其产量和价格，取决于葡萄种植的丰欠水平。

[0004] 化学法可分是以顺丁烯二酸酐或顺丁烯二酸为原料经催化氧化为环氧琥珀酸，再开环得到DL-酒石酸，后者经拆分获得L(+)-酒石酸(赵培庆,彭志光,张小明,索继栓.酒石酸的制备方法CN1376663A[P].2002)。

[0005] 酶法催化合成是目前L(+)-酒石酸生产广泛采用的方法。该法以顺丁烯二酸酐为原料、以钨酸钠等稀有金属为催化剂化学合成顺式环氧琥珀酸盐；然后以顺式环氧琥珀酸水解酶或含此酶的微生物细胞为催化剂，将顺式环氧琥珀酸盐转化为L(+)-酒石酸盐。不论是化学拆分法还是酶法，其原料均来源于石化来源的苯或丁烷制得的顺丁烯二酸酐，具有不可再生的特点。

[0006] 糖质发酵法是以葡萄糖为原料，经微生物体内生物合成为制得L(+)-酒石酸的工艺。该法使用的葡萄糖原料，可来自于大米、玉米等粮食，也可来自木薯等非粮植物，更可来自秸秆、木屑等生物质资源，来源稳定并可再生，更适合于食品对绿色和天然的追求。研究、开发和应用L(+)-酒石酸的糖质微生物发酵技术是未来发展的趋势。已知氧化葡萄糖酸杆菌能以葡萄糖为底物发酵产生5-酮基-D-葡萄糖酸(High-temperature-resistant bacterium capable of producing5-ketogluconic acid,and method for producing 5-ketogluconic  acid  using  the  high-temperature-resistant bacterium.WO2009JP06953[P].2009)，后者经金属催化可产生L(+)-酒石酸(基于5-酮基-D-葡萄糖酸生物制造L-(+)-酒石酸的研究进展[J].现代化工,2013,33(9):13-16)。然而，进一步的研究表明其5-酮基-D-葡萄糖酸转化为L(+)-酒石酸过程并非生物转化，而是由一种稀有金属催化的转化反应，其转化率也低下。因此，筛选以5-酮基-D-葡萄糖酸为底物发酵产生L(+)-酒石酸的微生物菌种，对L(+)-酒石酸产业具有重要的经济意义和环境意义。

发明内容

[0007] 本发明提供了一种鞘氨醇杆菌及其在催化合成L(+)-酒石酸或其盐中的应用及方法。

[0008] 本发明从自然界筛选获得了一株能够催化5-酮基-D-葡萄糖酸或其盐合成L(+)-酒石酸或其盐的微生物菌株。该菌株经鉴定为鞘氨醇杆菌，命名为鞘氨醇杆菌BK99，保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.18074，保藏日：2019年7月4日。

[0009] 本发明又提供了所述鞘氨醇杆菌在催化5-酮基-D-葡萄糖酸或其盐生成L(+)-酒石酸或其盐中的应用。其中，5-酮基-D-葡萄糖酸的盐形式为钠盐、钾盐、铵盐、镁盐、钡盐或钙盐，制备L(+)-酒石酸的盐形式对应为钠盐、钾盐、铵盐镁盐、钡盐或钙盐。

[0010] 本发明还提供了一种催化合成L(+)-酒石酸或其盐的方法，在培养基中添加5-酮基-D-葡萄糖酸或其盐，然后使用所述的鞘氨醇杆菌进行培养，获得L(+)-酒石酸或其盐。其中，5-酮基-D-葡萄糖酸的盐形式为钠盐、钾盐、铵盐、镁盐、钡盐或钙盐，制备L(+)-酒石酸的盐形式对应为钠盐、钾盐、铵盐、镁盐、钡盐或钙盐。

[0011] 优选的，发酵培养温度为26～37℃。更优选的，发酵培养温度为30～34℃。

[0012] 优选的，在培养基中添加5-酮基-D-葡萄糖酸或其盐的量为15～200g/L。更优选的，在培养基中添加5-酮基-D-葡萄糖酸或其盐的量为70～120g/L。

[0013] 优选的，发酵培养时间为2～10d。更优选的，发酵培养时间为6～9d。

[0014] 本发明鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)BK99能将来源于可再生资源的5-酮基-D-葡萄糖酸或其盐生物合成为L(+)-酒石酸或其盐，避免了现行工艺使用不可再生的化石原料；另一方面，本发明的鞘氨醇杆菌替代已见报道的采用稀有金属催化5-酮基-D-葡萄糖酸合成L(+)-酒石酸的方法，避免了稀有金属的使用。

附图说明

[0015] 图1为16S rDNA系统发育树分析结果图。

具体实施方式

[0016] 固体培养基：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，自然pH，高温灭菌30min；

[0017] 种子培养基：牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，pH 7.2～7.4，高温灭菌30min；

[0018] 发酵培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，(NH4)2SO4 2g/L，MgSO4 0.5g/L，FeSO4 0.2g/L，5-酮基-D-葡萄糖酸盐15～200g/L，pH 7.2～7.4，高温灭菌30min。

[0019] 实施例1

[0020] 菌种筛选。

[0021] 采集杭州市余杭区紫藤萝根基土壤，加0.5g至50mL的种子培养基中，30℃、200rpm6
摇床中富集培养2d。富集培养液用无菌水稀释10 后涂布于固体平板培养基上，30℃下恒温培养2d。挑取单菌落于含5mL种子培养基的试管中，30℃、200rpm下培养16h。移取3mL种子培养液至含30g/L 5-酮基-D-葡萄糖酸钾的30mL发酵培养基中，30℃、200rpm下培养，定期取样检测发酵液中的L(+)-酒石酸含量。经20轮筛选，共从土壤中挑取2680株进行上述发酵实验，筛选到多株可利用5-酮基-D-葡萄糖酸盐生成L(+)-酒石酸盐的微生物菌株，其中，BK99菌株产量最高。

[0022] 从固体培养基上挑取BK99菌株的单菌落，悬浮于10μL无菌去离子水中作为16S rDNA扩增模板。采用擎科生物T5 PCR试剂盒进行扩增16S rDNA片段，扩增体系如下：2×T5 mix 25μL，上述模板1μL，上游引物和下游引物各1μL，无菌去离子水22μL，混匀。

[0023] 扩增程序如下：98℃预变形5min；98℃变性20s，53℃退火20s，72℃延伸15s，共29个循环；72℃延伸2min。

[0024] 扩增产物50μL全部点样于1％琼脂糖凝胶电泳，100V电压下电泳15min。将目的条带切割下来，采用擎科生物胶回收试剂盒进行胶纯化回收。经测序，回收产物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0025] 将如SEQ ID NO.1所示的16S rDNA序列在NCBI上进行BLAST比对，选取相似性达97％以上的10个序列结果进行进一步比对，利用MEGA软件上的临位链接法构建如图1所示的系统发育树，结果表明该菌属于鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)，命名为鞘氨醇杆菌BK99。该菌株保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.18074，保藏日：2019年7月4日。

[0026] 实施例2

[0027] 鞘氨醇杆菌BK99利用5-酮基-D-葡萄糖酸钾生成L(+)-酒石酸钾。

[0028] 从固体培养基上挑取单菌落于含50mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃、200rpm摇床中振荡培养16h，获得种子培养液。

[0029] 移取5mL种子培养液至含不同浓度5-酮基-D-葡萄糖酸钾的50mL发酵培养基中，30℃、200rpm摇床中振荡培养10d。发酵液经离心去除菌体后，用HPLC法测得上清液中L(+)-酒石酸的含量，结果如表1-5所示。HPLC检测条件为：色谱柱Astec CLC(150 9 4.6mm)，柱温30℃，进样量10μL，流动相3mM CuSO4水溶液(pH 3.2)，流速1.0mL/min，检测波长254nm。

[0030] 表1 15g/L 5-酮基-D-葡萄糖酸钾条件下的鞘氨醇杆菌发酵结果

[0031] 发酵时间(d) 2 3 4 5 6 7 8 9 10L(+)-酒石酸(g/L) 0.3 0.5 0.9 1.4 1.7 1.9 1.8 1.9 1.7

[0032] 表2 30g/L 5-酮基-D-葡萄糖酸钾条件下的鞘氨醇杆菌发酵结果

[0033] 发酵时间(d) 2 3 4 5 6 7 8 9 10L(+)-酒石酸(g/L) 0.3 0.7 1.5 2.5 4.4 5.3 5.4 5.4 5.3

[0034] 表3 70g/L 5-酮基-D-葡萄糖酸钾条件下的鞘氨醇杆菌发酵结果

[0035] 发酵时间(d) 2 3 4 5 6 7 8 9 10L(+)-酒石酸(g/L) 0.5 1.2 4.9 9.7 13.9 13.8 13.9 12.8 11.5

[0036] 表4 120g/L 5-酮基-D-葡萄糖酸钾条件下的鞘氨醇杆菌发酵结果

[0037] 发酵时间(d) 2 3 4 5 6 7 8 9 10L(+)-酒石酸(g/L) 0.4 1.3 4.8 10.2 13.2 14.2 14.1 12.1 11.3

[0038] 表5 200g/L 5-酮基-D-葡萄糖酸钾条件下的鞘氨醇杆菌发酵结果

[0039] 发酵时间(d) 2 3 4 5 6 7 8 9 10L(+)-酒石酸(g/L) 0.5 1.2 5.0 9.9 16.7 20.7 21.2 20.8 20.2

[0040] 实施例3

[0041] 鞘氨醇杆菌BK99利用5-酮基-D-葡萄糖酸钾生成L(+)-酒石酸钾。

[0042] 从固体培养基上挑取单菌落于含50mL种子培养基的250mL摇瓶中，30℃、200rpm摇床中振荡培养16h，获得种子培养液。

[0043] 移取5mL种子培养液至含70g/L 5-酮基-D-葡萄糖酸钾的50mL发酵培养基中，于不同温度、200rpm摇床中振荡培养10d。发酵液经离心去除菌体后，用HPLC法测得上清液中L(+)-酒石酸的含量，结果如表6所示。

[0044] 表6发酵温度对鞘氨醇杆菌发酵生成L(+)-酒石酸的影响

[0045]

[0046] 注：上表内数据为发酵液中L(+)-酒石酸的浓度。

[0047] 实施例4

[0048] 鞘氨醇杆菌BK99利用5-酮基-D-葡萄糖酸钠生成L(+)-酒石酸钠。

[0049] 实施例3中的70g/L 5-酮基-D-葡萄糖酸钾用70g/L 5-酮基-D-葡萄糖酸钠替代，发酵温度为34℃，发酵周期7d，其余条件不变。发酵结束后，发酵液中的L(+)-酒石酸浓度为13.6g/L。

[0050] 实施例5

[0051] 鞘氨醇杆菌BK99利用5-酮基-D-葡萄糖酸钙生成L(+)-酒石酸钙。

[0052] 实施例3中的70g/L 5-酮基-D-葡萄糖酸钾用70g/L 5-酮基-D-葡萄糖酸钙替代，发酵温度为34℃，发酵周期7d，其余条件不变。发酵结束后，发酵液用2M HCl酸解后进行HPLC检测，发酵液中的L(+)-酒石酸浓度为16.3g/L。

[0053] 实施例6

[0054] 鞘氨醇杆菌BK99利用5-酮基-D-葡萄糖酸铵生成L(+)-酒石酸铵。

[0055] 实施例3中的70g/L 5-酮基-D-葡萄糖酸钾用70g/L 5-酮基-D-葡萄糖酸铵替代，发酵温度为34℃，发酵周期7d，其余条件不变。发酵结束后，发酵液中的L(+)-酒石酸浓度为12.5g/L。

[0056] 实施例7

[0057] 鞘氨醇杆菌BK99利用5-酮基-D-葡萄糖酸镁生成L(+)-酒石酸镁。

[0058] 实施例3中的70g/L 5-酮基-D-葡萄糖酸钾用70g/L 5-酮基-D-葡萄糖酸镁替代，发酵温度为34℃，发酵周期7d，其余条件不变。发酵结束后，发酵液中的L(+)-酒石酸浓度为15.7g/L。

[0059] 实施例8

[0060] 鞘氨醇杆菌BK99利用5-酮基-D-葡萄糖酸钡生成L(+)-酒石酸钡。

[0061] 实施例3中的70g/L 5-酮基-D-葡萄糖酸钡用70g/L 5-酮基-D-葡萄糖酸钡替代，发酵温度为34℃，发酵周期7d，其余条件不变。发酵结束后，发酵液中的L(+)-酒石酸浓度为11.9g/L。

[0062] 实施例9

[0063] 5L发酵罐上鞘氨醇杆菌BK99利用5-酮基-D-葡萄糖酸钠生成L(+)-酒石酸钠。

[0064] 从固体培养基上挑取单菌落于含300mL种子培养基的1000mL摇瓶中，34℃、200rpm摇床中振荡培养16h，获得种子培养液。

[0065] 种子培养液接种至置于5L发酵罐、含70g/L 5-酮基-D-葡萄糖酸钠的3L发酵培养基中，在30℃、500rpm、1vvm的条件下发酵培养10d。经检测，发酵液中L(+)-酒石酸的含量为18.4g/L。

[0066] 综上可知，本发明的鞘氨醇杆菌BK99已具备将5-酮基-D-葡萄糖酸或其盐发酵转化为L(+)-酒石酸或其盐的生产特性。

[0067] 需要说明的是，本发明所述的5-酮基-D-葡萄糖酸盐可以为5-酮基-D-葡萄糖酸与各种金属离子形成的不同盐，如上述实施例的5-酮基-D-葡萄糖酸钠或5-酮基-D-葡萄糖酸钾，还可以是5-酮基-D-葡萄糖酸钙等其他不同形式的盐。