一种水虻肠道来源的奇异变形杆菌BSFLG-CIP5及其应用

摘要

本发明属于农业微生物学技术领域，具体公开了一种昆虫水虻肠道来源的奇异变形杆菌BSFLG‑CIP5及其应用，所述的奇异变形杆菌为奇异变形杆菌(Proteus mirabilis BSFLG‑CIP5),保藏编号：CCTCC M 2018225。本发明提供的奇异变形杆菌(Proteus mirabilis BSFLG‑CIP5)可以有效的降解抗生素环丙沙星，增强水虻在转化物料过程中抵抗和降解环丙沙星的能力，是一株水虻肠道益生菌，可以用于促进水虻对含环丙沙星污染的废弃物的转化。

权利要求

1.一种分离的奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)，其特征在于：所述的奇异变形杆菌为奇异变形杆菌BSFLG-CIP5,保藏编号为CCTCC NO：M 2018225。

2.权利要求1所述的奇异变形杆菌在制备抵抗环丙沙星的水虻中的应用。

3.权利要求1所述的奇异变形杆菌在制备降解环丙沙星的水虻中的应用。

4.权利要求1所述的奇异变形杆菌在制备同时抵抗和降解环丙沙星的水虻中的应用。

5.权利要求1所述的奇异变形杆菌在降解环丙沙星中的应用。

6.权利要求1所述的奇异变形杆菌在制备环丙沙星降解剂中的应用。

说明书

一种水虻肠道来源的奇异变形杆菌BSFLG-CIP5及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于农业微生物学技术领域，具体涉及一种昆虫水虻肠道来源的奇异变形杆菌BSFLG-CIP5及其应用，该奇异变形杆菌BSFLG-CIP5分离自转化含环丙沙星污染物料的水虻肠道，还涉及该奇异变形杆菌BSFLG-CIP5可与水虻协同降解环丙沙星。

背景技术

[0002] 随着人类医疗水平的提高，抗生素类药物经过多代演化已经广泛应用与世界各地；另外，随着养殖的集约化发展，为防止高密度养殖疾病相互传染，兽用抗生素已成为了现代养殖业不可或缺的一部分，每年用于兽药的抗生素数量巨大。但是抗生素在动物体内并不能被完全吸收，大部分的抗生素会随着母体或代谢产物的形式由粪便和尿液排出体外，进入环境和水体。喹诺酮类抗生素是一类人畜通用的药物。该类药物具有抗菌谱广、抗菌活性强、与其他抗菌药物无交叉、耐药性和毒副作用小等特点，因此被广泛应用于水产、畜牧等养殖业中，常被用于鸡、鸭、鹅、鱼、虾、蟹、猪、牛、羊等养殖过程中的疾病防治。

[0003] 喹诺酮类抗生素，如环丙沙星是目前使用最广泛的抗生素之一，数据显示每年全球生产以千亿吨计数的喹诺酮类抗生素通过人体及动物排泄进入自然环境。喹诺酮类抗生素生物降解性较低，尤其在水体中不易被自然降解，因此容易随污水向环境中扩散，例如，环丙沙星在多个自然水体中检测到。研究证明喹诺酮类抗生素诱导通过噬菌体转化的基因水平转移，可以将存在于污水中的微生物群转化为危险的致病菌；对水体生态平衡甚至人类健康造成威胁。在自然环境中抗生素的扩散同样引起了耐药性的出现和蔓延，导致了常用抗生素的失效，对新型抗生素的研发造成巨大压力。解决抗生素在自然环境中的蔓延，寻求高效便捷的抗生素降解方式迫在眉睫，这也引起了社会和科学家的广泛关注。

[0004] 亮斑扁角水虻(Hermitia illucens)是双翅目水虻科的一种昆虫，幼虫腐食性，取食各种新鲜或腐败的有机物，包括水果蔬菜、谷物、肉类及各种禽畜粪便等，饲养非常方便，是一种十分难得的饲料昆虫资源。亮斑扁角水虻可以可持续地处理动植物有机废弃物。水虻幼虫能够在大幅减少畜禽粪便等废弃物累积量的同时，消除废弃物携带的多种病原菌类、除臭及抑制家蝇滋生。通过转化废弃物营养得到的水虻虫体可以作为畜禽、水产动物等的优质蛋白词料来源。而且其对人畜无害、清洁环境并有可观的潜在经济效益，在可持续农业发展的模式中受到越来越多的关注。

[0005] 申请人通过构建无菌水虻体系，比较水虻肠道微生物在分解环丙沙星过程中的贡献，发现水虻肠道微生物是水虻分解环丙沙星的关键参与者。本发明从水虻肠道微生物中分离得到了一株水虻肠道共生菌奇异变形杆菌BSFLG-CIP5，其具备增强水虻在转化物料过程中抵抗和降解环丙沙星的能力，是一株水虻肠道益生菌。目前，国际上还没有从昆虫肠道分离具有降解抗生素并可以与昆虫水虻共生降解抗生素的昆虫肠道细菌的报道。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供了一种奇异变形杆菌BSFLG-CIP5，该菌株能与水虻良好共生，本身在好氧环境中具有一定的降解环丙沙星的能力。该菌株已于2018年4月20日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)BSFLG-CIP5，保藏编号：CCTCC NO：M 2018225，地址：中国武汉武汉大学

[0007] 本发明的另一个目的在于提供了奇异变形杆菌BSFLG-CIP5的应用，包括利用该菌株制备抵抗和/或降解环丙沙星的水虻，或是利用该菌制备成环丙沙星的降解剂。

[0008] 为了达到以上目的，本发明采取以下措施：

[0009] 通过构建无菌水虻体系，比较水虻肠道微生物在降解环丙沙星过程中的贡献。申请人发现，水虻肠道微生物是水虻降解环丙沙星的关键参与者，通过分离，申请人自转化含环丙沙星污染物料的水虻肠道中分离得到一株奇异变形杆菌BSFLG-CIP5，该菌株已于2018年4月20日送至中国典型培养物保藏中心保藏。分类命名：奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)BSFLG-CIP5，保藏编号：CCTCC M 2018225，地址：中国武汉武汉大学。

[0010] 奇异变形杆菌BSFLG-CIP5具有纤维素水解，蛋白水解，脂肪水解，淀粉水解等活性。

[0011] 奇异变形杆菌BSFLG-CIP5的培养：在LB培养基中，28℃下培养。

[0012] 奇异变形杆菌BSFLG-CIP5的应用，包括利用该菌株制备抵抗和降解环丙沙星的水虻，或是利用该菌制备成环丙沙星的降解剂。

[0013] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：

[0014] 1.奇异变形杆菌BSFLG-CIP5具有纤维素水解，蛋白水解，脂肪水解，淀粉水解等活性，可与水虻共生，促进水虻生长；

[0015] 2.奇异变形杆菌BSFLG-CIP5可以离体降解环丙沙星，而且可以与水虻联合降解环丙沙星，是一株具有抗生素降解应用潜力的水虻肠道益生菌。

附图说明

[0016] 图1为奇异变形杆菌BSFLG-CIP5在含不同浓度环丙沙星的LB培养基中的生长曲线示意图。

[0017] 图2为奇异变形杆菌BSFLG-CIP5回接于无菌水虻处理含环丙沙星物料时环丙沙星降解率比较图。

[0018] 表1为奇异变形杆菌BSFLG-CIP5回接于无菌水虻处理含环丙沙星物料后水虻幼虫的生长情况。

具体实施方式

[0019] 下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为报道的微生物学常规操作方法。所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

[0020] 实施例1：

[0021] 从水虻肠道分离和鉴定奇异变形杆菌BSFLG-CIP5

[0022] 申请人采用含50mg/L环丙沙星的LB培养基，从转化含环丙沙星污染物料的水虻肠道研磨液中分离得到一株奇异变形杆菌BSFLG-CIP5，该菌株已于2018年4月20日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)BSFLG-CIP5，保藏编号：CCTCC M 2018225，地址：中国武汉武汉大学。奇异变形杆菌BSFLG-CIP5的生理生化特性和培养特性如表1所示。

[0023] 表1奇异变形杆菌BSFLG-CIP5的生理生化特性和培养特性

[0024]

[0025] “+”为阳性，“-”为阴性。

[0026] 实施例2：

[0027] 奇异变形杆菌BSFLG-CIP5的离体培养：

[0028] 将奇异变形杆菌BSFLG-CIP5在平板上划线活化，取平板上单菌落接种到装100mL有LB培养基的三角瓶中，培养温度为28℃，摇床转速180rpm,培养时间24h，得到奇异变形杆菌BSFLG-CIP5发酵菌悬液，用于以下实施例。

[0029] 实施例3：

[0030] 奇异变形杆菌BSFLG-CIP5的体外降解环丙沙星：

[0031] 将150μL奇异变形杆菌BSFLG-CIP5菌悬液分别接种至装有150ml含25、50、75和100mg/L环丙沙星的LB培养基的三角瓶中，培养温度为28℃，摇床转速180rpm，培养时间7d。
检测内容及结果如下：

[0032] 1)检测其生长曲线，结果如图1所示，随着环丙沙星浓度的增高，奇异变形杆菌BSFLG-CIP5的适应期逐渐延长，但在适应期之后即进入对数生长期，并在24h内达到较高浓度。即使在100mg/L环丙沙星的浓度条件下，奇异变形杆菌BSFLG-CIP5也能耐受生长，说明其对高浓度的环丙沙星有很好的耐受作用。

[0033] 2)检测培养基中环丙沙星浓度变化，至168h时，含25mg/L、50mg/L、75mg/L和100mg/L环丙沙星的培养基中环丙沙星的降解率分别为98.2、97.8％、97.1％和96.3％。

[0034] 实施例4：

[0035] 奇异变形杆菌BSFLG-CIP5在水虻体内促进水虻转化环丙沙星：

[0036] 本实施例所用的水虻为亮斑扁角水虻武汉品系。

[0037] 1)将含50mg/L环丙沙星的无菌人工物料(固含量50g，含水率65％)装入无菌三角瓶中，成为物料三角瓶；

[0038] 2)设置两对照组和一个实验组，每组3个平行：

[0039] 其一，在物料三角瓶中接入1mL无菌水，标记为非生物对照组；

[0040] 其二，在物料三角瓶中接入100头无菌水虻幼虫(不含肠道微生物)，标记为无菌水虻

[0041] 对照组；

[0042] 其三，在物料三角瓶中接种1ml奇异变形杆菌BSFLG-CIP5菌悬液，以及100头无菌水虻幼虫(不含肠道微生物)，标记为CIP5回接处理组；

[0043] 3)将以上三个实验组置于28℃培养箱，保持通风及无菌环境，培养12d，取初始物料及12d的各组物料，测试其环丙沙星含量，计算各组环丙沙星的降解率，同时测定水虻重量；

[0044] 4)实验结果如图2和表1所示，CIP5回接处理组的环丙沙星降解率为72.44％，要显著高于无菌水虻处理组和非生物对照组(降解率分别为21.8％和7.83％)。同时，12d后CIP5回接处理组水虻的各项生长指标(存活率、虫体鲜重和干重等)均显著高于无菌水虻组的水虻，说明奇异变形杆菌BSFLG-CIP5回接处理有利于水虻自身的生长。因此，奇异变形杆菌BSFLG-CIP5是水虻生长和降解环丙沙星的肠道益生菌。

[0045] 表1

[0046]