一种特异性T细胞的培养方法

摘要

一种特异性T细胞的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：1)将PBMC激活分化为分化为效应T细胞，2)使用退分化培养基，使效应T细胞退分化为TCM，3)使用扩增培养基扩增TCM。本发明所培养的细胞纯度高、保存时间长、具有肿瘤特异性且活性强；该培养方法增殖速度快，成本低，易操作。

权利要求

1.一种特异性T细胞的培养方法，其特征在于：包括以下步骤：1)使用溶瘤病毒对PBMC进行激活，将PBMC激活分化为效应T细胞，所述效应T细胞需加入扩增培养基和CD28进行培养；2)使用退分化培养基和1/100经辐照灭活的工程化细胞，使效应T细胞退分化为TCM，3)使用上述扩增培养基扩增TCM；

所述步骤2)中的退分化培养基包括AIM-V，3-21mg/ml三羟甲基乙烷，0.4-2mg/ml的BaCL2，30-80ug/ml依维莫司，1-7mg/ml KCL。

2.如权利要求1所述的特异性T细胞的培养方法，其特征在于：所述CD28浓度为80ng/ml。

3.如权利要求1所述的特异性T细胞的培养方法，其特征在于：所述退分化培养基包括AIM-V，10mg/ml三羟甲基乙烷，1mg/ml的BaCL2，50ug/ml依维莫司，3mg/ml KCL。

4.如权利要求1所述的特异性T细胞的培养方法，其特征在于：所述扩增培养基包括AIM-V，9-32ng/ml的IL2，2-9％自体血清。

5.如权利要求4所述的特异性T细胞的培养方法，其特征在于：所述扩增培养基包括AIM-V，20ng/ml的IL2，5％自体血清。

说明书

一种特异性T细胞的培养方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种特异性T细胞的培养方法，尤其涉及一种肿瘤特异性中央记忆T细胞的培养方法。

背景技术

[0002] 《2012中国肿瘤登记年报》曾报道：我国癌症发病率为285.91/10万，城市和农村发病率分别为303.91/10万和249.98/10万。据估计，至2049年，我国癌症发病率可能达到400/10万的水平。癌症发病率升高的最主要原因为人口老龄化。现今我国老龄人口所占比例为
13.6％，20—30年后可能达到16％。与之相对应的，我们可以了解到近年来癌症发病率确实一直处于直线上升趋势，并且尽管目前的对于癌症的治疗措施在不断发展，但晚期恶性肿瘤患者愈后的身体状况仍然很差，5年生存率不到15％。

[0003] 传统的手术、化疗、放疗三种肿瘤治疗手段靶向性差，副作用大，容易产生比较强的耐药现象，同时还有转移复发的危险，难以根除肿瘤细胞。随着肿瘤生物学、分子生物学和免疫学的发展，大量研究表明免疫治疗对晚期恶性肿瘤患者具有其他治疗方式无法比拟的优越性，因此，免疫治疗已成为继传统肿瘤治疗方法，手术、化疗、放疗，后的第四种肿瘤治疗方法，具有广阔的临床应用前景。

[0004] 肿瘤免疫治疗通常指的是过继性细胞免疫治疗，是指通过输注自体或同种异体特异性或非特异性“抗肿瘤免疫效应细胞”，直接杀伤肿瘤细胞或改善提高机体免疫功能来达到治疗肿瘤的目的治疗方法。本发明主要对于肿瘤特异性中央记忆T细胞进行研究。

[0005] 肿瘤特异性中央记忆T细胞(Central Memory T cell，TCM)，是免疫应答中的上游细胞，被认为在体内有着更长的寿命和瘤体趋向性，能起到纽带作用。免疫系统识别肿瘤抗原之后，TCM负责长久记忆肿瘤抗原，并在肿瘤抗原刺激下源源不断地产生针对肿瘤的大量效应型记忆T细胞(Effector Memory T cells，TEM)，进而分化成为大量的效应T细胞。

[0006] 北华大学第二附属医院化疗科主任冯燕在2013年至2016年期间用TCM细胞治疗的365位癌症患者，证实了TCM在延长患者生存周期、提升癌症患者生存质量、减轻化疗副作用等方面有一定的效果。中国医学科学院肿瘤医院肝胆外科副主任赵宏指出，肝切除术是治疗肝细胞癌最主要的治疗方式，但超过50％的肝癌患者在术后两年内复发，TCM治疗或可改善这一现状。TCM作为最新一代抗肿瘤免疫细胞，已被纳入美国国立卫生研究院(NIH)癌症中心招标项目，被美国NIH评价为最佳抗肿瘤细胞。

[0007] 但是在现有的TCM培养中仍存在一些问题：

[0008] 1、外周血中的TCM“记忆”了不同抗原，针对不同的疾病、感染进行免疫应答，只有极少一部分TCM可以针对肿瘤进行识别，故通过外周血分离的TCM其肿瘤杀伤能力有限，基本上扩增的都是一些杂细胞；

[0009] 2、TCM传统培养方法中往往使用TCR配型、肿瘤抗原、免疫磁珠、单克隆挑选等进行，这些培养方法都非常耗时耗力，成本也非常大，很难推广；

[0010] 3、TCM在外周血中含量极少，鉴定分离扩增困难；

[0011] 4、TCM体外培养过程中TCM容易分化为效应记忆T细胞，使得TCM纯度较低。

[0012] 为了解决上述TCM传统培养方法中存在的问题，本申请人利用溶瘤病毒诱导外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)产生肿瘤特异性的效应T细胞，再将效应T细胞退分化为TCM。

发明内容

[0013] 本发明所要解决的技术问题是提供一种细胞增殖快、纯度高、能够长时间保存，所培养的细胞具有肿瘤特异性的TCM培养方法。

[0014] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

[0015] 一种特异性T细胞的培养方法，包括以下步骤：1)使用溶瘤病毒对PBMC进行激活，将PBMC激活分化为效应T细胞，所述效应T细胞需加入扩增培养基和CD28进行培养；2)使用退分化培养基和1/100经辐照灭活的工程化细胞，使效应T细胞退分化为TCM，3)使用上述扩增培养基扩增TCM；所述步骤2)中的退分化培养基包括AIM-V，3-21mg/ml三羟甲基乙烷，0.4-2mg/ml的BaCL2，30-80ug/ml依维莫司，1-7mg/ml KCL。

[0016] 优选地，所述CD28浓度为80ng/ml。

[0017] 优选地，所述退分化培养基包括AIM-V，10mg/ml三羟甲基乙烷，1mg/ml的BaCL2，50ug/ml依维莫司，3mg/ml KCL。

[0018] 为了提高扩增效率，所述扩增培养基包括AIM-V，9-32ng/ml的IL2，2-9％自体血清。

[0019] 优选地，所述扩增培养基包括AIM-V，20ng/ml的IL2，5％自体血清。

[0020] 与现有技术相比，本发明的优点在于：

[0021] 1、所培养的细胞纯度高、保存时间长、具有肿瘤特异性且活性强，

[0022] 2、该培养方法增殖速度快，成本低，易操作。

附图说明

[0023] 图1为实施例1中实验组细胞经溶瘤细胞刺激并培养24小时后的细胞形态图。

[0024] 图2为实施例1中实验组细胞经溶瘤细胞刺激并培养24小时后的效应T细胞含量图。

[0025] 图3为实施例1中对照组细胞培养24小时后的细胞形态图。

[0026] 图4为实施例1中对照组细胞培养24小时后的效应T细胞含量图。

[0027] 图5为实施例1中实验组TCM在第7、14、21天的FACS表型检测结果。

[0028] 图6为实施例1中对照组TCM在第7、14、21天的FACS表型检测结果。

[0029] 图7为实施例1中实验组和对照组的40天细胞增值曲线图。

[0030] 图8为实施例2中实验组TCM的活性对比图。

[0031] 图9为实施例3中TCM体外杀伤A375的实验结果图。

[0032] 图10为实施例3中TCM体外杀伤A375的实验结果图。

具体实施方式

[0033] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

[0034] 本发明的一种特异性T细胞的培养方法，其步骤包括将淋巴细胞中PBMC激活，分化为肿瘤特异性的效应T细胞，再将效应T细胞退分化，从而获得高纯度的TCM。

[0035] 具体地，肿瘤组织通过溶瘤病毒刺激，溶瘤病毒特异性感染肿瘤细胞，释放肿瘤抗原、增加肿瘤细胞MHC表达等作用，使得原本不能被免疫细胞识别杀伤的肿瘤，从冷肿瘤转变成热肿瘤，使得淋巴细胞的PBMC能够识别肿瘤，形成肿瘤特异性杀伤的效应T细胞。同时，溶瘤病毒使肿瘤细胞能够表达IL2、IL137L、anti-PDLI，从而增强了肿瘤细胞特异性，增强激活PBMC的能力。从而解决TCM数量少的问题。

[0036] 效应T细胞能够在退分化培养基下，通过K离子、EGF等多种因子的作用退分化为TCM。利用该原理，使效应T细胞退分化为TCM，避免其他培养方法中TCM分化为效应T细胞，从而使TCM的纯度降低的缺点。

[0037] 本发明还将工程细胞作为滋养层细胞，利用工程细胞能够表达IL7、IL21、IL15、CD137L等膜蛋白，使TCM高效扩增，维持TCM的相应表型，防止其在体外分化，从而避免了单独添加这些因子TCM无法同时结合的问题，经济实用。

[0038] 实施例1培养TCM

[0039] 1.1实验方法

[0040] 1.1.1实验前准备

[0041] 制备淋巴细胞：将身体健康的捐献者外周血作血样，采集血样20ml并平均分配至4支装有20ml的淋巴细胞分离液的50ml离心管中，以2200rpm离心20min；静置后用巴氏吸管吸取中间白膜层于新的50ml离心管，后用生理盐水以1800rpm离心5min，洗涤2次；用CD56磁珠去除其他对肿瘤非特异性杀伤的淋巴细胞，并用生理盐水以1800rpm离心5min，洗涤2次，得到淋巴细胞。

[0042] 制备肿瘤组织：用实验室正常培养的黑色素瘤细胞A375，按3×106接种到裸鼠皮下，制作肿瘤模型；等裸鼠皮下肿瘤长到6-10cm2时，处死小鼠，从小鼠身上取下肿瘤组织，消毒清洗后保存于组织保存液中，得到肿瘤组织。

[0043] 1.1.2实验步骤

[0044] 将得到的肿瘤细胞一分为二，分别为实验组和对照组，使用眼科镊固定实验组和对照组的肿瘤组织，用手术刀片延同一方向将这两块肿瘤组织均切成1mm3大小。

[0045] 实验组：

[0046] 1)将实验组1的组织块均匀分散到Transwell上层孔板上，用溶瘤病毒感染，MOI＝10。

[0047] 2)取2支离心管，将其中的淋巴细胞加入Transwell下层孔板中，再在Transwell下层孔板中加入2ml扩增培养基和80ng/ml的CD28，用于特异性激活肿瘤杀伤性T淋巴细胞。

[0048] 扩增培养基包括AIM-V，9-32ng/ml的IL2，2-9％自体血清。其中AIM-V为基础培养基，IL2用于淋巴细胞的扩增，自体血清用于提供细胞培养的必须营养成分，CD28用于更好的激活T淋巴细胞。优选地，扩增培养基包括AIM-V，20ng/ml的IL2，5％自体血清。

[0049] 3)Transwell上层孔板在培养箱中培养24小时后，取孔板中的得到淋巴细胞进行3+
光学镜检及FACS分析CD 、INF-γ观察T细胞的激活情况。结果如图1，图2所示。

[0050] 4)将Transwell上层孔板每天加入2ml扩增培养基和80ng/mlCD28，连续培养5天。

[0051] 5)培养至第5天，弃除transwell上层，用扩增培养基重悬下层细胞并计数，调整细胞1×106cells/100ml接种至培养瓶中。

[0052] 6)培养瓶中加入退分化培养基培养和1/100经辐照灭活的工程化细胞，将培养瓶均放至37℃，5％CO2培养箱中，隔天补液，培养24h。

[0053] 退分化培养基包括AIM-V，3-21mg/ml三羟甲基乙烷，0.4-2mg/ml的BaCL2，30-80ug/ml依维莫司，1-7mg/ml KCL，其中AIM-V是基础培养基，三羟甲基乙烷用于效应细胞往中央记忆T细胞退分化的诱导因子，BaCl2用于效应细胞往中央记忆T细胞退分化的诱导因子，依维莫司用于维持中央记忆T细胞，防止其再分化为别的细胞，KCL用于效应细胞往中央记忆T细胞退分化的诱导因子。优选地，退分化培养基包括AIM-V，10mg/ml三羟甲基乙烷，
1mg/ml的BaCL2，50ug/ml依维莫司，3mg/ml KCL。

[0054] 7)第6天，将退分化培养基更换成扩增培养基，继续培养24h。扩增培养基的组成和步骤2一致。

[0055] 8)培养瓶继续培养至40天，隔天补液，绘制细胞增值曲线，结果如图7。同时分别于第7天、第14天和第21天用FACS分析细胞表型，结果如图5。

[0056] 对照组：

[0057] 1)将对照组的组织块均匀分散在6孔板中，不进行处理。

[0058] 2)取剩余的2支离心管中的淋巴细胞加入6孔板中，再在6孔板上加入2ml扩增培养基+80ng/ml的CD28，用于特异性激活肿瘤杀伤性T淋巴细胞。

[0059] 3)6孔板在培养箱中培养24小时后，取孔板中的得到淋巴细胞进行光学镜检及FACS分析CD3+、INF-γ观察T细胞的激活情况。结果如图3和图4。

[0060] 4)6孔板每天加入2ml扩增培养基和80ng/mlCD28，连续培养5天。

[0061] 5)培养至第5天，弃除孔板内上层，用扩增培养基重悬下层细胞并计数，调整细胞1×106cells/100ml接种至培养瓶中。

[0062] 6)培养瓶中加入扩增培养基培养和1/100经辐照灭活的工程化细胞，将培养瓶均放至37℃，5％CO2培养箱中，隔天补液。

[0063] 7)培养瓶继续培养至40天，隔天补液，绘制细胞增值曲线，结果如图7。同时分别于第7天、第14天和第21天用FACS分析其表型，结果如图6。

[0064] 1.2结果分析

[0065] 1)图1和图2为实验组细胞经溶瘤细胞刺激并培养24小时后的细胞形态及激活情况。由图1可以看出明显的细胞克隆团块，由此可知有些细胞已经被激活形成克隆。图2中右上象限表示CD3+INFγ+双阳性的细胞，即被激活的T细胞，右下象限表示CD3+INFγ-的细胞，即没有被激活的T细胞，该图显示实验组的淋巴细胞中有22％的T细胞被激活了(即CD3阳性细胞分泌了INFγ)，有4.4％的NK细胞(即CD3阴性细胞左上象限)被激活。

[0066] 图3和图4为对照组培养24小时后的细胞形态及激活情况。图3没有肉眼可见的细胞克隆团块，同时由图4可知未检测到含有INFγ，可见其中没有免疫细胞被激活，无法分泌INFγ。

[0067] 综上所述，实验组中通过溶瘤病毒刺激淋巴细胞分化为效应T细胞的实验具有明显成效。

[0068] 2)图5为实验组TCM的FACS表型检测结果(CD45RO+CD62L+双阳性，右上象限)，右上象限表示TCM含量，右上象限表示效应T细胞含量，其中图5中的5A、5B、5C依次为第7天、第14天和第21天的检测结果。从图5中可知，实验组TCM含量在第7天时为84.1％，第14天为85.2％，第21天为78.6％。由此可知，实验组的TCM含量纯度高，效应T细胞含量低，且能长期维持该状态。

[0069] 图6为对照组TCM的FACS表型检测结果，其中图6中的5A、5B、5C依次为第7天、第14天和第21天的检测结果。从图6中可知，对照组TCM含量在第7天时为85.9％，第14天为58.7％，第21天为7.1％，基本已经全部分化为效应T细胞(右下象限)。由此可知，对照组的TCM随着培养时间的增加而快速分化为效应T细胞。

[0070] 综上所述，实验组的方法能够更好的维持TCM的表型，保证了培养过程中的TCM纯度。

[0071] 3)图7为实验组和对照组的40天细胞增值曲线图，由图可知，对照组的细胞在第5天开始进入对数生长期，第13天开始进入平台期，第23天出现明显的细胞衰竭开始出现细胞凋亡，第40天细胞数量明显降低。实验组的细胞第11天才进入对数生长期，第25天进入平台期，直到第40天细胞数量一致维持稳定。

[0072] 总体来说，因为实验组细胞首先需要经过肿瘤抗原激活成效应T细胞，其扩增的TCM是有效应T细胞退分化而来，然而只有部分效应T细胞才能退分为为TCM，其他的效应T细胞凋亡了，所以实验组前期的细胞数量不如对照组。但是分化后的TCM的扩增速度明显优于对照组，第21天实验组的细胞数量是对照组的2倍，且更晚的进入平台期。

[0073] 实施例2活性验证实验

[0074] 2.1实验方案

[0075] 取实施例1中培养至第7天的细胞，平均分成A、B、C三组，按照下述培养方法培养至第8天，分别检测A组、B组、C组中的FACS，结果如图8。

[0076] A组：细胞量为5×107，加入扩增培养基和5×105的A375细胞的裂解物；

[0077] B组：细胞量为5×107，加入扩增培养基和5×105的A375细胞；

[0078] C组：细胞量为5×107，加入扩增培养基。

[0079] 2.2结果分析

[0080] 图8中右上象限为TCM含量，右下象限为效应T细胞含量。结合图2和图8可知，A组细胞中加入的A375裂解物，即特异性相关抗原，可见第二天TCM基本分化为效应T细胞，以及有部分细胞转化成了TEF。B组细胞中加入靶细胞A375，TCM部分分化为效应T细胞。C组没有特异性相关抗原的刺激，TCM基本保持不变。

[0081] TCM(CD45RO+CD62L+)的特异性识别相关抗原，在遇到特异性抗原的时候能迅速分化成效应记忆T细胞(TEM：CD45RO+CD62L-)和效应T细胞(TEF：CD45RO-)。

[0082] 实施例3杀伤实验

[0083] 3.1实验方案

[0084] 1)制备靶细胞：取生长状态良好的靶细胞A375和ECA，1000rpm/min离心5min，用RPMI-1640完全培养基重悬，台酚蓝计数检测细胞活率，调整细胞数为2×105/ml，备用。

[0085] 2)制备效应细胞处理：取实施例1中的实验组和对照组中第14天的TCM细胞，重悬，1500rpm/min离心5min×2次，台酚蓝计数活率，完全培养基(1640+10％FBS)重悬，调整细胞数为4×106/ml3，得到效应细胞备用。按靶细胞104/孔处理效应细胞，效靶比E:T＝16:1、8:
1、4:1、2:1、1:1：

[0086] 3)将上述效应细胞按不同效靶分别加入96孔板中，不足100ul体积孔加入完全培养基补足100ul。取相应细胞数的靶细胞和TCM作对照，取相同体积培养基作空白对照，实验孔周围孔加入等体积PBS过夜培养(16～24h)。

[0087] 4)第二天每孔加入10％体积的CCK-8，放入37℃，5％CO2培养箱中孵育2—4h后，在450nm波长下测定OD值，同时设定630nm为参比波长，计算杀伤率，结果如图9和图10。

[0088] 杀伤率(％)＝(对照靶细胞OD值+相应对照组OD值-实验组OD值-空白培养基OD值)/(对照靶细胞OD值-空白培养基OD值)×100％。

[0089] 3.2结果分析

[0090] 如图9所示，对照组TCM在效靶比1:1，2:1，4:1，8:1，16：1的时候对A375的杀伤效率分别为0％，2％，12％，20％，46％。实验组TCM在效靶比1:1，2:1，4:1，8:1，16：1的时候对A375的杀伤效率分别为15％，30％，56％，87％，90％。对A375的杀伤能力，实验组所培养的TCM远远高于对照组。

[0091] 如图10所示，对照组TCM在效靶比1:1，2:1，4:1，8:1，16：1的时候对ECA的杀伤效率分别为0％，2％，10％，17％，39％。实验组TCM在效靶比1:1，2:1，4:1，8:1，16：1的时候对ECA的杀伤效率分别为1％，1％，12％，19％，35％。对ECA的杀伤能力，实验组和对照组的TCM无明显差异。

[0092] 从上述数据可知，实验组TCM对于A375的杀伤能力远远高于ECA，具有靶向性和肿瘤特异性，并且杀伤率高。