转氨酶突变体及其应用

摘要

本发明公开了一种转氨酶突变体及其应用。其中，该转氨酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，突变至少包括如下突变位点组合之一：T7C+S47C、Q78C+A330C、V137C+G313C、A217C+Y252C和L295C+C328C；或者转氨酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。本发明的转氨酶突变体实现蛋白质结构和功能的改变，减少了酶用量，提高了产物的ee值，降低了后处理的难度，使得其能够适合工业化生产。

权利要求

1.一种转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体与SEQ ID NO：1相比仅在如下位点发生突变，所述突变为如下组合之一：T7C+S47C、T7C+S47C+Q380L+V379L、T7C+S47C+Q380L+V379D、T7C+S47C+Q380L+V379A、T7C+S47C+Q380L+V379V、T7C+S47C+ Q78C+A330C +Y89A、T7C+S47C+ Q78C+A330C +Y89E、T7C+S47C+ V137C+G313C +Y89V、T7C+S47C+Q380L+V379L+S156P、T7C+S47C+ Q78C+A330C +S156Q、T7C+S47C+K249F+I400P +S156A、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F、T7C+S47C+H369A+C404V+M166A、T7C+S47C+H369A+F22P+M166V、T7C+S47C+ H369A+L283K+M166S、T7C+S47C+A33V+A57Y+M166Y、T7C+S47C+ A33V+A57V+M166G、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+S424A、T7C+S47C+ A33V+A57V+M166Y+S424G、T7C+S47C+Q380L+V379L+F397K+S424L、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416T、T7C+S47C+S292A+A299P+M166K+R416T、T7C+S47C+ S292A+A299P+M166F+R416P、T7C+S47C+S292A+A299P+M166F+R416D、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+Y168I、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+Y168M、T7C+S47C+S292A+A299P+M166E+Y168A、T7C+S47C+A334L+F367G+M166S+Y168V、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+N151Q、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+N151W、T7C+S47C+A334W+F367Q+M166F+N151S、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+N151Y、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416P、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+I414Q、T7C+S47C+ D436A+R457W+M166F+R416D+R444A、T7C+S47C+ D436A+R444P+M166S+R416F+D436V、T7C+S47C+D436A+R444Y +M166S+R416F+G419W、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151F、T7C+S47C+ D436A+R457C+M166E+R416Q+N151A、T7C+S47C+ D436A+R457P+M166W+R416F+N151V、T7C+S47C+ D436A+V379L+M166F+R416D+N151E、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+Y168E、T7C+S47C+D396Y+F397Q+M166F+R416D+Y168M、T7C+S47C+D396P+F397S+M166G+R416S+Y168S、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+Y168A、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+Y168M、T7C+S47C+D396G+F397Y+M166F+R416D+N151W+Y168A、T7C+S47C+D396G+F397Y+M166D+R416F+N151W+Y168S、T7C+S47C+D396G+F397Y+M166D+R416D+N151W+Y168E、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+S424C、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+S424A、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+S424V、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+F409Q、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+F409V、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+F409H、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+F409M、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+F409T、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+F409A、T7C+S47C+D396G+F397Y+M166A+R416V+N151W+F409M、T7C+S47C+D396G+F397Y+M166A+R416V+N151W+F409T、T7C+S47C+D396G+F397Y+M166A+R416V+N151W+F409A、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+S424V+F409C、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+S424A+F409Q、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+S424A+F409C、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+F409H+E171T、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+F409H+E171A、T7C+S47C+C404Q+R405F+M166S+R416D+N151W+S424V+F409C、T7C+S47C+C404Q+R405F+M166E+R416M+N151W+S424A+F409Q、T7C+S47C+C404Q+R405F+M166S+R416A+N151W+S424A+F409C、T7C+S47C+C404Q+R405F+M166T+R416A+N151W+F409H+E171T或T7C+S47C+C404Q+R405F+M166Y+R416A+N151W+F409H+E171A。

2.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1所述的转氨酶突变体。

3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有权利要求2所述的DNA分子。

4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pET‑22a（+）、pET‑22b（+）、pET‑3a（+）、pET‑3d（+）、pET‑11a（+）、pET‑12a（+）、pET‑14b（+）、pET‑15b（+）、pET‑16b（+）、pET‑17b（+）、pET‑19b（+）、pET‑20b（+）、pET‑21a（+）、pET‑23a（+）、pET‑23b（+）、pET‑24a（+）、pET‑25b（+）、pET‑26b（+）、pET‑27b（+）、pET‑28a（+）、pET‑29a（+）、pET‑30a（+）、pET‑31b（+）、pET‑32a（+）、pET‑35b（+）、pET‑38b（+）、pET‑39b（+）、pET‑40b（+）、pET‑41a（+）、pET‑41b（+）、pET‑42a（+）、pET‑43a（+）、pET‑43b（+）、pET‑44a（+）、pET‑49b（+）、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET‑A、pRSET‑B、pRSET‑C、pGEX‑5X‑1、pGEX‑6p‑1、pGEX‑6p‑2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pUC‑18或pUC‑19。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3或4所述的重组质粒，所述宿主细胞为原核细胞或酵母。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述原核细胞为大肠杆菌BL21‑DE3细胞或大肠杆菌Rosetta‑DE3细胞。

7.一种生产手性胺的方法，包括转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的步骤，其特征在于，所述转氨酶为权利要求1所述的转氨酶突变体；所述酮类化合物为、 、 、 、 、 、

或 。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述氨基供体为异丙胺或丙氨酸。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述氨基供体为异丙胺。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中，pH为7 11。

~

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，在转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中，pH为8 10。

~

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，在转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中，pH为9 10。

~

13.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系的温度为25℃ 60℃。

~

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系的温度为30 55℃。

~

15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系的温度为40 50℃。

~

16.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中二甲基亚砜体积浓度为0% 50%。

~

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中二甲基亚砜体积浓度为0% 20%。

~

说明书

转氨酶突变体及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种转氨酶突变体及其应用。

背景技术

[0002] 手性胺类化合物是合成许多手性药物的关键中间体。有许多重要的神经类药物、心血管药物、抗高血压药物、抗感染药物等都是以手性胺作为中间体来进行合成的。目前，
手性胺的合成主要通过化学法实现，例如不对称还原Schiff碱(Chiral amine synthesis:
methods,developments and applications[M].West Sussex,United Kingdom:John 
Wiley&Sons.2010)，但是反应中存在反应条件苛刻、使用有毒的过渡态金属催化剂、产品立
体选择性低等不足。

[0003] 转氨酶能够催化氨基供体上的氨基转移到前手性的受体酮，得到手性胺和副产物酮。由于转氨酶具有高选择性、高转化率及温和的反应条件等优点，被广泛应用于手性胺的
合成中。人们已经采用酶法(Biocatalytic Asymmetric Synthesis of Chiral Amines 
from Ketones Applied to Sitagliptin Manufacture[J].Science,2010,329(5989):
305‑309.)或化学‑酶法结合的手段制备得到了许多重要的手性胺(Chemoenzymatic 
asymmetric total synthesis of(S)‑Rivastigmine using omega‑transaminases[J]
.Cheminform,2010,46(30):5500‑5502)。但在工业化应用生产时，大多数的野生转氨酶存
在催化效率低、立体选择性差、稳定性弱等缺点，使得真正能够被应用的转氨酶并不多。

[0004] 申请公布号为CN108048419A的发明专利申请公开了一种来源于Chromobacterium violaceum的ω‑转氨酶突变体F89Y+A417S，该突变体可以较高选择性的催化二羟基缩酮类
化合物得到手性氨产品，反应如下：

[0005]

[0006] 但是其活性较低，反应时添加的酶量较多。

发明内容

[0007] 本发明旨在提供一种转氨酶突变体及其应用，以提高转氨酶的活性。

[0008] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种转氨酶突变体。该转氨酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，突
变至少包括如下突变位点组合之一：T7C+S47C、Q78C+A330C、V137C+G313C、A217C+Y252C和
L295C+C328C；或者转氨酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，
且与发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。

[0009] 进一步地，突变包括T7C+S47C和至少如下突变位点之一：Q78、A330、V137、G313、A217、Y252、L295、C328、F22、A33、V42、A57、F89、N151、S156、M166、Y168、E171、K249、L283、
S292、A299P、A334、F367、H369、V379、Q380、D396、F397、I400、C404、R405、F409、I414、R416、
G419、S424、D436、R444、G457。

[0010] 进一步地，突变包括T7C+S47C和至少如下突变位点之一：Q78C、V137C、G313C、F22P、A33V、A57V/Y、F89A/E/V、N151A/E/F/Q/S/V/W/Y、S156A/P/Q、M166A/D/E/F/G/K/S/W/
Y、Y168A/E/I/M/S/V、E171A/T、K249F、L283K、S292A、A299P、A33C、A334L/W、F367G/Q、H369A、
V379A/D/L/V、Q380L、D396G/P/Y、F397K/Q/S/Y、I400P、C404Q/V、R405F、F409A/C/H/M/Q/T/
V、I414Q、R416A/D/F/M/P/Q/S/T/V、G419W、S424A/C/Q/L/V、D436V/A、R444A/P/Y和G457C/P/
W。

[0011] 进一步地，突变至少还包括如下突变位点组合之一：T7C+S47C+D436A、T7C+S47C+Q380L+V379L、T7C+S47C+N151W和T7C+S47C+M166F。

[0012] 进一步地，突变至少还包括如下突变位点组合之一：T7C+S47C+Q380L+V379L、T7C+S47C+Q380L+V379D、T7C+S47C+Q380L+V379A、T7C+S47C+Q380L+V379V、T7C+S47C+Q78C+
A330C+Y89A、T7C+S47C+Q78C+A330C+Y89E、T7C+S47C+V137C+G313C+Y89V、T7C+S47C+Q380L+
V379L+S156P、T7C+S47C+Q78C+A330C+S156Q、T7C+S47C+K249F+I400P+S156A、T7C+S47C+
Q380L+V379L+M166F、T7C+S47C+H369A+C404V+M166A、T7C+S47C+H369A+F22P+M166V、T7C+
S47C+H369A+L283K+M166S、T7C+S47C+A33V+A57Y+M166Y、T7C+S47C+A33V+A57V+M166G、T7C+
S47C+Q380L+V379L+M166F+S424A、T7C+S47C+A33V+A57V+M166Y+S424G、T7C+S47C+Q380L+
V379L+F397K+S424L、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416T、T7C+S47C+S292A+A299P+M166K
+R416T、T7C+S47C+S292A+A299P+M166F+R416P、T7C+S47C+S292A+A299P+M166F+R416D、T7C+
S47C+Q380L+V379L+M166F+Y168I、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+Y168M、T7C+S47C+S292A+
A299P+M166E+Y168A、T7C+S47C+A334L+F367G+M166S+Y168V、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F
+N151Q、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+N151W、T7C+S47C+A334W+F367Q+M166F+N151S、T7C+
S47C+Q380L+V379L+M166F+N151Y、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D、T7C+S47C+Q380L+
V379L+M166F+R416P、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+I414Q、T7C+S47C+D436A+R457W
+M166F+R416D+R444A、T7C+S47C+D436A+R444P+M166S+R416F+D436V、T7C+S47C+D436A+
R444Y+M166S+R416F+G419W、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W、T7C+S47C+Q380L
+V379L+M166F+R416D+N151F、T7C+S47C+D436A+R457C+M166E+R416Q+N151A、T7C+S47C+
D436A+R457P+M166W+R416F+N151V、T7C+S47C+D436A+V379L+M166F+R416D+N151E、T7C+S47C
+Q380L+V379L+M166F+R416D+Y168E、T7C+S47C+D396Y+F397Q+M166F+R416D+Y168M、T7C+
S47C+D396P+F397S+M166G+R416S+Y168S、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+Y168A、T7C
+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+Y168M、T7C+S47C+D396G+F397Y+M166F+R416D+
N151W+Y168A、T7C+S47C+D396G+F397Y+M166D+R416F+N151W+Y168S、T7C+S47C+D396G+F397Y
+M166D+R416D+N151W+Y168E、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+S424C、T7C+
S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+S424A、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+
N151W+S424V、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+F409Q、T7C+S47C+Q380L+V379L
+M166F+R416D+N151W+F409V、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+F409H、T7C+
S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+F409M、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+
N151W+F409T、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+F409A、T7C+S47C+D396G+F397Y
+M166A+R416V+N151W+F409M、T7C+S47C+D396G+F397Y+M166A+R416V+N151W+F409T、T7C+
S47C+D396G+F397Y+M166A+R416V+N151W+F409A、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+
N151W+S424V+F409C、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+S424A+F409Q、T7C+S47C
+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+S424A+F409C、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+
N151W+F409H+E171T、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+F409H+E171A、T7C+S47C
+C404Q+R405F+M166S+R416D+N151W+S424V+F409C、T7C+S47C+C404Q+R405F+M166E+R416M+
N151W+S424A+F409Q、T7C+S47C+C404Q+R405F+M166S+R416A+N151W+S424A+F409C、T7C+S47C
+C404Q+R405F+M166T+R416A+N151W+F409H+E171T、和T7C+S47C+C404Q+R405F+M166Y+R416A
+N151W+F409H+E171A。

[0013] 根据本发明的另一个方面，提供一种DNA分子。该DNA分子编码上述转氨酶突变体。

[0014] 根据本发明的再一个方面，提供一种重组质粒。该重组质粒含有上述DNA分子。

[0015] 进一步地，重组质粒为pET‑22a(+)、pET‑22b(+)、pET‑3a(+)、pET‑3d(+)、pET‑11a(+)、pET‑12a(+)、pET‑14b(+)、pET‑15b(+)、pET‑16b(+)、pET‑17b(+)、pET‑19b(+)、pET‑20b
(+)、pET‑21a(+)、pET‑23a(+)、pET‑23b(+)、pET‑24a(+)、pET‑25b(+)、pET‑26b(+)、pET‑27b
(+)、pET‑28a(+)、pET‑29a(+)、pET‑30a(+)、pET‑31b(+)、pET‑32a(+)、pET‑35b(+)、pET‑38b
(+)、pET‑39b(+)、pET‑40b(+)、pET‑41a(+)、pET‑41b(+)、pET‑42a(+)、pET‑43a(+)、pET‑43b
(+)、pET‑44a(+)、pET‑49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、
pRSET‑A、pRSET‑B、pRSET‑C、pGEX‑5X‑1、pGEX‑6p‑1、pGEX‑6p‑2、pBV220、pBV221、pBV222、
pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232‑18、pUC‑18或pUC‑19。

[0016] 根据本发明的又一个方面，提供一种宿主细胞。该宿主细胞含有上述重组质粒。

[0017] 进一步地，宿主细胞包括原核细胞、酵母或真核细胞；优选原核细胞为大肠杆菌BL21‑DE3细胞或大肠杆菌Rosetta‑DE3细胞。

[0018] 根据本发明的再一个方面，提供一种生产手性胺的方法。该方法包括转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的步骤，转氨酶为上述任一种转氨酶突变体。

[0019] 进一步地，酮类化合物为 转氨基反应产物为 其中，R1和R2分别独立的表示任选取代或未被取代的烷基、任选取代或未被取代的芳烷基、或任选取代或未被
取代的芳基；R1和R2可单独或两者互相结合形成取代或未被取代的环；优选的，酮类化合物
为二羟基缩酮类化合物，反应为 生成 的转氨反应；优选的，R1和R2为碳原子
数1～20的任选取代或未被取代的烷基、任选取代或未被取代的芳烷基、或任选取代或未被
取代的芳基，更优选的为碳原子数1～10的任选取代或未被取代的烷基、任选取代或未被取
代的芳烷基、或任选取代或未被取代的芳基；优选的，取代是指被卤素原子、氮原子、硫原
子、羟基、硝基、氰基、甲氧基、乙氧基、羧基、羧甲基、羧乙基或亚甲二氧基取代；优选的，R1
表示为甲基或卤素取代的甲基，更优选的，卤素取代的甲基为CF3，CF2H，CCl3，CCl2H，CBr3或
CBr2H，进一步优选的，为CF3或CF2H；优选的，酮类化合物为

[0020]

[0021] 进一步地，氨基供体为异丙胺或丙氨酸，优选为异丙胺。

[0022] 进一步地，在转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中，pH为7～11，优选为8～10，更优选为9～10；优选的，转氨酶对酮类化合物及氨基供体进
行催化转氨基反应的反应体系的温度为25℃～60℃，更优选为30～55℃，进一步优选为40
～50℃；优选的，转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中二甲
基亚砜体积浓度为0％～50％，更优选为0％～20％。

[0023] 本发明的上述转氨酶突变体是在SEQ ID NO：1所示的来源于Chromobacterium violaceum的ω‑转氨酶突变体F89Y+A417S的基础上，通过定点突变的方法进行突变，从而
改变其氨基酸序列，实现蛋白质结构和功能的改变，减少了酶用量，提高了产物的ee值，降
低了后处理的难度，使得其能够适合工业化生产。

具体实施方式

[0024] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

[0025] 野生酶的活性较低，酶使用量较大。为了解决上述问题，本发明通过定向进化的手段对野生酶进行蛋白质改造，提高酶的活性和立体选择性，开发出可用于工业化生产的转
氨酶。

[0026] 发明人通过定向进化的方法对来源于Chromobacterium violaceum的ω‑转氨酶的突变体SEQ ID NO:1(申请公布号为CN108048419A)进行进化，提高酶活、降低酶使用量的
同时，又进一步提高了酶的立体选择性。

[0027] 具体的，以来源于Chromobacterium violaceum的ω‑转氨酶突变体F89Y+A417S(SEQ ID NO:1)为模板(在本发明中，以“F89Y”为例，表示“原氨基酸+位点+突变后的氨基
酸”，即第89位的F为变为Y)，首先设计了10对定点突变引物，构建了5对双点组合突变(T7C+
S47C，Q78C+A330C，V137C+G313C，A217C+Y252C，L295C+C328C)来提高酶在高温条件下的反
应活性。利用定点突变手段，以pET‑22b(+)为表达载体，获得带有目的基因的突变质粒。

[0028] 定点突变：是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点
突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工
作中一种非常有用的手段。

[0029] 利用全质粒PCR引入定点突变的方法简单有效，是目前使用比较多的手段。其原理是，一对包含突变位点的引物(正、反向)，和模板质粒退火后用聚合酶“循环延伸”，所谓的
循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热退火
延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。正反向引物的延伸产物退
火后配对成为带缺刻的开环质粒。来源于dam+菌株的模版DNA由于带有甲基化位点，可被
DpnI酶识别切割，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被消化，在转化入
大肠杆菌后缺刻可被自然修复，即可得到带有突变质粒的克隆。将突变质粒转化至大肠杆
菌感受态细胞内，涂布于含有LB固体培养基(100μg/mL氨苄青霉素)的培养皿中，37℃过夜
培养。对固体培养基上长出的单克隆进行活化。测序鉴定正确后，在25℃，0.2mM IPTG的条
件下，过夜诱导转氨酶的表达。然后通过离心、超声破碎细胞的方法获得粗酶液，用于反应
特性检测。

[0030] 通过采用计算机对转氨酶和底物的三维结构进行对接模拟分析，在酶催化中心附近选择一些氨基酸，可能与酶活有很大关系。在构建的双点突变的基础上，对这些可能有影
响的氨基酸位点进行饱和突变。设计了31对饱和突变引物(F22，A33，V42，A57，F89，N151，
S156，M166，Y168，E171，K249，L283，S292，A299，A334，F367，H369，V379&Q380L，D396，F397，
I400，C404，R405，F409，I414，R416，G419，S424，D436，R444，G457)，以获得活性大幅度提高
的突变体。

[0031] 其中，饱和突变是通过对目的蛋白的编码基因进行改造，短时间内获取靶位点氨基酸分别被其它19种氨基酸替代的突变体的一种方法。此方法不仅是蛋白质定向改造的强
有力工具，而且是蛋白质结构－功能关系研究的重要手段。饱和突变往往能获得比单点突
变更为理想的进化体。而对于定点突变方法不能解决的这些问题，恰恰是饱和突变方法所
擅长的独特之处。

[0032] 在饱和突变获得活性提高的突变体基础上，可对有益的氨基酸位点进行组合，以获得性状更优的突变体。组合突变中双点突变的构建方法和单点突变的构建方法一样，采
用全质粒PCR法构建。同时突变2个及以上位点的多点突变通过采用重叠延伸PCR扩增进行，
获得含多点突变的突变基因，两端经限制性内切酶酶切后，连接到表达载体上，转化至大肠
杆菌细胞内，涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养皿中，37℃培养过夜，获得组合突变
体，测序鉴定。

[0033] 重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR，简称SOEPCR)是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链
的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的
基因重组，常常被用于多点突变的构建中。

[0034] 根据本发明一种典型的实施方式，提供一种转氨酶突变体。该转氨酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1(MQKQRTTSQWRELDAAHHLHPFTDTASLNQAGARVMTRGEGVYLWDSEGNKI
IDGMAGLWCVNVGYGRKDFAEAARRQMEELPFYNTFYKTTHPAVVELSSLLAEVTPAGFDRVFYTNSGSESVDTMI
RMVRRYWDVQGKPEKKTLIGRWNGYHGSTIGGASLGGMKYMHEQGDLPIPGMAHIEQPWWYKHGKDMTPDEFGVVA
ARWLEEKILEIGADKVAAFVGEPIQGAGGVIVPPATYWPEIERICRKYDVLLVADEVICGFGRTGEWFGHQHFGFQ
PDLFTAAKGLSSGYLPIGAVFVGKRVAEGLIAGGDFNHGFTYSGHPVCAAVAHANVAALRDEGIVQRVKDDIGPYM
QKRWRETFSRFEHVDDVRGVGMVQAFTLVKNKAKRELFPDFGEIGTLCRDIFFRNNLIMRSCGDHIVSAPPLVMTR
AEVDEMLAVAERCLEEFEQTLKARGLA)所示的氨基酸序列发生突变得到的氨基酸序列，突变至少
包括如下突变位点组合之一：T7C+S47C、Q78C+A330C、V137C+G313C、A217C+Y252C和L295C+
C328C；或者转氨酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发
生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列。

[0035] 本发明的上述转氨酶突变体是在SEQ ID NO：1所示的来源于Chromobacterium violaceum的ω‑转氨酶突变体F89Y+A417S的基础上，通过定点突变的方法进行突变，从而
改变其氨基酸序列，实现蛋白质结构和功能的改变，减少了酶用量，提高了产物的ee值，降
低了后处理的难度，使得其能够适合工业化生产。

[0036] 本文使用的术语“同源性”具有本领域通常已知的含义，本领域技术人员也熟知测定不同序列间同源性的规则、标准。本发明用不同程度同源性限定的序列还必须要同时具
有转氨酶活性的提高。在上述实施方式中，优选转氨酶突变体的氨基酸序列具有以上的同
源性并具有或编码具有活性提高的氨基酸序列。本领域技术人员可以在本申请公开内容的
教导下获得这样的变体序列。

[0037] 优选的，突变包括T7C+S47C和至少如下突变位点之一：Q78、A330、V137、G313、A217、Y252、L295、C328、F22、A33、V42、A57、F89、N151、S156、M166、Y168、E171、K249、L283、
S292、A299P、A334、F367、H369、V379、Q380、D396、F397、I400、C404、R405、F409、I414、R416、
G419、S424、D436、R444、G457。

[0038] 更优选的，突变包括T7C+S47C和至少如下突变位点之一：Q78C、V137C、G313C、F22P、A33V、A57V/Y、F89A/E/V、N151A/E/F/Q/S/V/W/Y、S156A/P/Q、M166A/D/E/F/G/K/S/W/
Y、Y168A/E/I/M/S/V、E171A/T、K249F、L283K、S292A、A299、A33C、A334L/W、F367G/Q、H369A、
V379A/D/L/V、Q380L、D396G/P/Y、F397K/Q/S/Y、I400P、C404Q/V、R405F、F409A/C/H/M/Q/T/
V、I414Q、R416A/D/F/M/P/Q/S/T/V、G419W、S424A/C/Q/L/V、D436V/A、R444A/P/Y和G457C/P/
W。其中，“/”代表“或”。

[0039] 更优选的，突变至少还包括如下突变位点组合之一：T7C+S47C+S292A、T7C+S47C+D436A、T7C+S47C+D396G、T7C+S47C+Q380L、T7C+S47C+A299P、T7C+S47C+F397Y、T7C+S47C+
S424A、T7C+S47C+V379L、T7C+S47C+M166F、T7C+S47C+M166A、T7C+S47C+R405F T7C+S47C+
R416V、T7C+S47C+R416D、T7C+S47C+R416A、T7C+S47C+N151W、T7C+S47C+C404Q+R405F、T7C+
S47C+Q78C+A330C、T7C+S47C+Q380L+V379L、T7C+S47C+Q380L+R416D、T7C+S47C+V379L+
N151W、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F、T7C+S47C+C404Q+R405F+M166F+R416A+N151W和T7C+
S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W。

[0040] 进一步优选的，突变至少还包括如下突变位点组合之一：T7C+S47C+Q380L+V379L、T7C+S47C+Q380L+V379D、T7C+S47C+Q380L+V379A、T7C+S47C+Q380L+V379V、T7C+S47C+Q78C+
A330C+Y89A、T7C+S47C+Q78C+A330C+Y89E、T7C+S47C+V137C+G313C+Y89V、T7C+S47C+Q380L+
V379L+S156P、T7C+S47C+Q78C+A330C+S156Q、T7C+S47C+K249F+I400P+S156A、T7C+S47C+
Q380L+V379L+M166F、T7C+S47C+H369A+C404V+M166A、T7C+S47C+H369A+F22P+M166V、T7C+
S47C+H369A+L283K+M166S、T7C+S47C+A33V+A57Y+M166Y、T7C+S47C+A33V+A57V+M166G、T7C+
S47C+Q380L+V379L+M166F+S424A、T7C+S47C+A33V+A57V+M166Y+S424G、T7C+S47C+Q380L+
V379L+F397K+S424L、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416T、T7C+S47C+S292A+A299P+M166K
+R416T、T7C+S47C+S292A+A299P+M166F+R416P、T7C+S47C+S292A+A299P+M166F+R416D、T7C+
S47C+Q380L+V379L+M166F+Y168I、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+Y168M、T7C+S47C+S292A+
A299P+M166E+Y168A、T7C+S47C+A334L+F367G+M166S+Y168V、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F
+N151Q、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+N151W、T7C+S47C+A334W+F367Q+M166F+N151S、T7C+
S47C+Q380L+V379L+M166F+N151Y、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D、T7C+S47C+Q380L+
V379L+M166F+R416P、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+I414Q、T7C+S47C+D436A+R457W
+M166F+R416D+R444A、T7C+S47C+D436A+R444P+M166S+R416F+D436V、T7C+S47C+D436A+
R444Y+M166S+R416F+G419W、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W、T7C+S47C+Q380L
+V379L+M166F+R416D+N151F、T7C+S47C+D436A+R457C+M166E+R416Q+N151A、T7C+S47C+
D436A+R457P+M166W+R416F+N151V、T7C+S47C+D436A+V379L+M166F+R416D+N151E、T7C+S47C
+Q380L+V379L+M166F+R416D+Y168E、T7C+S47C+D396Y+F397Q+M166F+R416D+Y168M、T7C+
S47C+D396P+F397S+M166G+R416S+Y168S、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+Y168A、T7C
+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+Y168M、T7C+S47C+D396G+F397Y+M166F+R416D+
N151W+Y168A、T7C+S47C+D396G+F397Y+M166D+R416F+N151W+Y168S、T7C+S47C+D396G+F397Y
+M166D+R416D+N151W+Y168E、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+S424C、T7C+
S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+S424A、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+
N151W+S424V、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+F409Q、T7C+S47C+Q380L+V379L
+M166F+R416D+N151W+F409V、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+F409H、T7C+
S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+F409M、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+
N151W+F409T、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+F409A、T7C+S47C+D396G+F397Y
+M166A+R416V+N151W+F409M、T7C+S47C+D396G+F397Y+M166A+R416V+N151W+F409T、T7C+
S47C+D396G+F397Y+M166A+R416V+N151W+F409A、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+
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+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+S424A+F409C、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+
N151W+F409H+E171T、T7C+S47C+Q380L+V379L+M166F+R416D+N151W+F409H+E171A、T7C+S47C
+C404Q+R405F+M166S+R416D+N151W+S424V+F409C、T7C+S47C+C404Q+R405F+M166E+R416M+
N151W+S424A+F409Q、T7C+S47C+C404Q+R405F+M166S+R416A+N151W+S424A+F409C、T7C+S47C
+C404Q+R405F+M166T+R416A+N151W+F409H+E171T、和T7C+S47C+C404Q+R405F+M166Y+R416A
+N151W+F409H+E171A。

[0041] 根据本发明一种典型的实施方式，提供一种DNA分子。该DNA分子编码上述转氨酶突变体。该DNA分子编码的上述转氨酶突变体具有高可溶性表达特性以及高活力特性。

[0042] 本发明的上述DNA分子还可以以“表达盒”的形式存在。“表达盒”是指线性或环状的核酸分子，涵盖了能够指导特定核苷酸序列在恰当宿主细胞中表达的DNA和RNA序列。一
般而言，包括与目标核苷酸有效连接的启动子，其任选的是与终止信号和/或其他调控元件
有效连接的。表达盒还可以包括核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码目标蛋
白，但在正义或反义方向也编码目标功能RNA，例如反义RNA或非翻译的RNA。包含目标多核
苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少一个其组分与其至少一个其他组分是异源的。
表达盒还可以是天然存在的，但以用于异源表达的有效重组形成获得的。

[0043] 根据本发明一种典型的实施方式，提供一种重组质粒。该重组质粒含有上述任一种DNA分子。上述重组质粒中的DNA分子置于重组质粒的适当位置，使得上述DNA分子能够正
确地、顺利地复制、转录或表达。

[0044] 虽然本发明在限定上述DNA分子时所用限定语为“含有”，但其并不意味着可以在DNA序列的两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技术人员知晓，为了满足重组
操作的要求，需要在DNA序列的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启
动密码子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来限定将不能真实地覆盖这些情形。

[0045] 本发明中所使用的术语“质粒”包括双链或单链线状或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌二元核酸分子，优选为重组表达质粒，可以是原核表达质粒也可以是真
核表达质粒，但优选原核表达质粒，在某些实施方案中，重组质粒选自pET‑22a(+)、pET‑22b
(+)、pET‑3a(+)、pET‑3d(+)、pET‑11a(+)、pET‑12a(+)、pET‑14b(+)、pET‑15b(+)、pET‑16b
(+)、pET‑17b(+)、pET‑19b(+)、pET‑20b(+)、pET‑21a(+)、pET‑23a(+)、pET‑23b(+)、pET‑24a
(+)、pET‑25b(+)、pET‑26b(+)、pET‑27b(+)、pET‑28a(+)、pET‑29a(+)、pET‑30a(+)、pET‑31b
(+)、pET‑32a(+)、pET‑35b(+)、pET‑38b(+)、pET‑39b(+)、pET‑40b(+)、pET‑41a(+)、pET‑41b
(+)、pET‑42a(+)、pET‑43a(+)、pET‑43b(+)、pET‑44a(+)、pET‑49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、
pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET‑A、pRSET‑B、pRSET‑C、pGEX‑5X‑1、pGEX‑6p‑1、
pGEX‑6p‑2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232‑18、pUC‑18或pUC‑
19。更优选，上述重组质粒是pET‑22b(+)。

[0046] 根据本发明一种典型的实施方式，提供一种宿主细胞，宿主细胞含有上述任一种重组质粒。适用于本发明的宿主细胞包括但不仅限于原核细胞、酵母或真核细胞。优选原核
细胞为真细菌，例如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。更优选原核细胞为大肠杆菌BL21细胞
或大肠杆菌DH5α感受态细胞。

[0047] 根据本发明一种典型的实施方式，提供一种生产手性胺的方法。该方法包括转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的步骤，转氨酶为上述任一种耐有机溶剂
的转氨酶突变体。由于本发明的上述转氨酶突变体具有很好的催化活性及特异性，因而利
用本发明的转氨酶突变体制备的手性胺可以提高反应速率，减少酶用量，降低后处理的难
度。

[0048] 进一步地，酮类化合物为 转氨基反应产物为 其中，R1和R2分别独立的表示任选取代或未被取代的烷基、任选取代或未被取代的芳烷基、或任选取代或未被
取代的芳基；R1和R2可单独或两者互相结合形成取代或未被取代的环；优选的，所述酮类化
合物为二羟基缩酮类化合物，反应为 生成 的转氨反应；

[0049] 优选的，R1和R2为碳原子数1～20的任选取代或未被取代的烷基、任选取代或未被取代的芳烷基、或任选取代或未被取代的芳基，更优选的为碳原子数1～10的任选取代或未
被取代的烷基、任选取代或未被取代的芳烷基、或任选取代或未被取代的芳基；

[0050] 优选的，取代是指被卤素原子、氮原子、硫原子、羟基、硝基、氰基、甲氧基、乙氧基、羧基、羧甲基、羧乙基或亚甲二氧基取代。

[0051] 优选的，R1表示为甲基或卤素取代的甲基，更优选的，卤素取代的甲基为CF3，CF2H，CCl3，CCl2H，CBr3或CBr2H，进一步优选的，为CF3或CF2H。

[0052] 优选的，酮类化合物为二羟基缩酮类化合物，转氨基反应式为如下之一：

[0053]

[0054] 其中，TA为转氨酶，PLP为磷酸吡哆醛。

[0055] 在本发明一种典型的实施方式中，氨基供体为异丙胺或丙氨酸，优选为异丙胺。

[0056] 应用本发明的转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中，pH为7～11，优选为8～10，更优选为9～10，也就是说pH的取值可以任选为7～11中的值，
例如7、7.5、8、8、8.6、9、10、10.5等。转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应
的反应体系的温度为25～60℃，更优选为30～55℃，进一步优选为40～50℃，也就是说温度
的取值可以任选为25～60℃中的值，例如30、31、32、35、37、38、39、40、42、45、48、50、51、52、
55等。转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中二甲基亚砜体积
浓度为0％～50％，例如选10％、15％、18％、20％、30％、35％、38％、40％、42％、48％、49％
等。

[0057] 本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。且下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使
用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

[0058] 下面将结合实验数据及实施例进一步说明本发明的有益效果。

[0059] 实施例1

[0060]

[0061] 10mg的底物1/底物2/底物3分别溶于30μL DMSO中，配制底物溶液。反应体系中依次加入转氨酶10mg，66.6μL异丙胺盐酸盐溶液(6M)，0.1mg PLP，0.1M的Tris‑Cl buffer(pH 
9.0)溶液补到总体积500μL，最后加入配好的底物溶液，调pH至9.0，200rpm，45℃恒温反应
16h。向反应体系中加入2倍体积的乙腈，充分混匀，静置10min，12000rpm离心10min，取上
清，稀释10倍后送液相测转化率。ee值检测方法：向反应体系中加入2倍体积的乙腈，充分混
匀，静置10min，12000rpm离心10min，取上清，加入无水MgSO4除水，12000rpm离心10min，取
上清，用N2吹干，加1mL甲醇，溶解后送液相检测。部分突变体反应特性如下表1：

[0062] 表1

[0063]

[0064]

[0065]

[0066] 活性提高的倍数用+表示，+表示提高5‑10倍，++表示提高10‑20倍，+++表示提高20‑50倍，++++表示提高50‑100倍，+++++表示提高100倍以上；*表示ee值在95％‑98％，**表
示ee值＞98％。

[0067] 实施例2

[0068]

[0069] 10mg的底物4/底物5分别溶于30μL DMSO中，配制底物溶液。反应体系中依次加入转氨酶10mg，66.6μL异丙胺盐酸盐溶液(6M)，0.1mg PLP，0.1M的Tris‑Cl buffer(pH 9.0)
溶液补到总体积500μL，最后加入配好的底物溶液，调pH至9.0，200rpm，45℃恒温反应16h。
向反应体系中加入2倍体积的乙腈，充分混匀，静置10min，12000rpm离心10min，取上清，稀
释10倍后送液相测转化率。ee值检测方法：向反应体系中加入2倍体积的乙腈，充分混匀，静
置10min，12000rpm离心10min，取上清，加入无水MgSO4除水，12000rpm离心10min，取上清，
用N2吹干，加1mL甲醇，溶解后送液相检测。部分突变体反应特性如下表2：

[0070] 表2

[0071]

[0072]

[0073] 活性提高的倍数用+表示，+表示提高5‑10倍，++表示提高10‑20倍，+++表示提高20‑50倍，++++表示提高50‑100倍，+++++表示提高100倍以上；*表示ee值在95％‑98％，**表
示ee值＞98％。

[0074] 实施例3

[0075]

[0076] 10mg的底物6/底物7/底物8分别溶于30μL DMSO中，配制底物溶液。反应体系中依次加入转氨酶10mg，66.6μL异丙胺盐酸盐溶液(6M)，0.1mg PLP，0.1M的Tris‑Cl buffer(pH 
9.0)溶液补到总体积500μL，最后加入配好的底物溶液，调pH至9.0，200rpm，45℃恒温反应
16h。向反应体系中加入2倍体积的乙腈，充分混匀，静置10min，12000rpm离心10min，取上
清，稀释10倍后送液相测转化率。ee值检测方法：向反应体系中加入2倍体积的乙腈，充分混
匀，静置10min，12000rpm离心10min，取上清，加入无水MgSO4除水，12000rpm离心10min，取
上清，用N2吹干，加1mL甲醇，溶解后送液相检测。部分突变体反应特性如下表3：

[0077] 表3

[0078]

[0079]

[0080]

[0081] 活性提高的倍数用+表示，+表示提高5‑10倍，++表示提高10‑20倍，+++表示提高20‑50倍，++++表示提高50‑100倍，+++++表示提高100倍以上；*表示ee值在95％‑98％，**表
示ee值＞98％。

[0082] 从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本发明的转氨酶突变体，具有提高的酶活性，在使用时能够降低酶的使用量，解决野生型转氨酶不适
合于工业化生产的技术问题。

[0083] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修
改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。